丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的制備及其體外抗腫瘤藥效研究

陳晨+王慧潔+劉芙蓉+王銀+毛聲俊+金輝

[摘要] 采用高壓均質法制備丹參酮ⅡA白蛋白納米粒，以粒徑、包封率和載藥量為評價指標，采用星點設計-效應面法優選處方，進而考察其體外抗腫瘤效果。結果表明，采用優選的處方制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒形態為規則的圓球形，粒徑分布均勻，平均粒徑為（175.7±3.07） nm，包封率和載藥量分別為90.8%±1.47%和5.52%±0.09%。對于人早幼粒細胞白血病NB4細胞，載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒較游離藥物有更優的抑瘤效果。白蛋白納米粒制備工藝簡便，可顯著改善丹參酮ⅡA的溶解度，有助于拓展其在抗血液腫瘤方面的應用。

[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；白蛋白納米粒；處方優化；抗腫瘤

[Abstract] In this study， the tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles were prepared by high pressure homogenization method. The formulation was optimized by central composite design-response surface method （CCD-RSM ）， with the particle size， encapsulation efficiency， and drug loading as indexes to investigate their in vitro anti-tumor effect. The results showed that the prepared nanoparticles had uniformly spherical morphology and uniform particle size distribution. The average particle size， encapsulation efficiency and drug loading of nanoparticles were about （175.7 ± 3.07） nm， 90.8%±1.47% and 5.52%±0.09%， respectively. Tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles showed a more powerful antitumor effect than free tanshinone ⅡA for human promyelocytic leukemia NB4 cells. The preparation method of the drug-loaded albumin nanoparticles was simple and easy， and can significantly improve the solubility of tanshinone ⅡA， so it was helpful to extend its application in therapies against hematological malignancies.

[Key words] tanshinone ⅡA； albumin nanoparticles； formulation optimization； anti-tumor effect

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取的一種脂溶性成分，其在心腦血管疾病、抗菌消炎、抗氧化等方面具有確切藥理作用[1]。研究發現，丹參酮ⅡA可抑制多種腫瘤細胞的生長，其對人早幼粒白血病細胞具有明顯增殖抑制作用[2]。然而丹參酮ⅡA水溶性差（溶解度僅為2 mg·L-1），口服生物利用度低（<3.5%），半衰期短，滲透性差[3]，限制了其在臨床上的推廣應用。白蛋白納米粒是一種生物相容性優良的載體，其不僅能增大難溶性藥物的溶解度，還可增強抗腫瘤藥物的功效[4]。據此，考慮到丹參酮ⅡA與白蛋白結合率高（血漿蛋白結合率99.2%）的特點[3]，采用高壓均質的方法[5]制備丹參酮ⅡA白蛋白納米粒，以期提高其溶解度，充分發揮其抗腫瘤作用。本研究以粒徑、包封率和載藥量的綜合評分為評價指標，采用星點設計-效應面法優化丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的處方，并對其藥劑學特性與細胞藥效學進行初步考察，為拓展丹參酮ⅡA在抗血液腫瘤方面的應用提供新劑型和新思路。

1 材料

丹參酮ⅡA（純度>95%，南京狄爾格醫藥科技有限公司，批號D20150622A）；丹參酮ⅡA對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-15021504）；牛血清白蛋白（美國Amresco，純度>98%）；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Amresco公司；膽固醇（上?；菔郎噭┯邢薰?，批號151024）；精制蛋黃卵磷脂（德國Lipoid，批號510300-2153731/948）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

高效液相色譜儀 Agilent 1100（美國安捷倫科技有限公司）；ALC-110.4型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV-2450紫外分光光度計（SHIMADZU 日本島津公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析儀（英國Malvern）；拓普超純水機（成都超純科技有限公司）；EF-C5 高壓均質機（加拿大Avestin公司）；HENC高速剪切儀（德爾特混合設備有限公司）；冷凍干燥機（美國Labconco公司）。

2 方法與結果

2.1 丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的制備

稱取200 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于20 mL超純水中，超聲溶解，作為水相；另稱取20 mg丹參酮ⅡA 、40 mg膽固醇、40 mg蛋黃卵磷脂溶于0.9 mL的氯仿中，超聲溶解，作為油相。在高速剪切儀的作用下，將油相緩慢地注入水相中，高速剪切8 min，制備得到粗乳，迅速將粗乳轉移至高壓均質機中，均質10次，在35 ℃下，減壓真空除去氯仿，最終得到白蛋白納米粒膠體溶液[6]。

2.2 丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的藥劑學特性表征

2.2.1 形態學觀察 取適量丹參酮ⅡA白蛋白納米粒溶液，加水稀釋后，滴加在覆蓋碳膜的銅網上，用20 g·L-1磷鎢酸負染樣品后，自然晾干后于透射電鏡下觀察，結果見圖1。由圖1可見，納米粒形態較為圓整，粒徑較均勻。

2.2.2 粒徑分布與Zeta電位 采用激光粒度分析儀對所制備的白蛋白納米粒的粒徑、分散系數（PDI）及Zeta電位進行測定，其平均粒徑為（175.7±3.07） nm，PDI為（0.187±0.04），Zeta電位為（-22.2±0.62） mV（n=3）。

2.3 包封率和載藥量的測定

2.3.1 色譜條件[7] 色譜柱Cosmonsil C18 烷基硅膠鍵合相（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（75∶25）；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm；流速1.0 mL·min-1；進樣量20 μL；檢測波長270 nm。方法的專屬性良好；回歸方程為Y=118.82X+69.15，r=0.999 9。丹參酮ⅡA在16～80 mg ·L-1與對應的色譜峰面積線性關系良好；精密度和重復性RSD分別為0.78%，0.67%；平均加樣回收率為99.7%，RSD為1.2%。

2.3.2 白蛋白納米粒樣品的處理 精密量取按2.1項下制得的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒1.0 mL于5 mL量瓶中，加入0.5 mL 0.01 mol·L-1鹽酸，用無水乙醇定容，搖勻，超聲5 min，0.22 μm微孔濾膜精濾，按2.3.1項下色譜條件測定峰面積，計算。

2.3.3 包封率和載藥量的測定 參考文獻[8]方法，取200 μL的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒注入G25葡聚糖凝膠柱，用超純水洗脫，待棕紅色納米粒洗脫至凝膠柱底端時，用離心管接收白蛋白納米粒洗脫液，直至其完全被洗脫（約5 mL）。將上述納米粒洗脫液按2.3.2項下方法處理，進樣HPLC檢測，即可測得被包封的藥物量We，另取同等體積未過柱分離的白蛋白納米粒，稀釋至與總洗脫液相同的體積，再取稀釋后的納米粒按2.3.2項下方法處理，同法操作，即可得白蛋白納米粒中藥物總量Wt。將納米粒在制備時的投藥量記為Wa，血清白蛋白及藥用輔料的總量為Wd。包封率（EE）公式為EE=（We/Wt）×100%；載藥量（DLE）公式為DLE=（Wa×EE）/（Wa+Wd）×100%。

2.4 溶解度的測定

在2.1項下制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒中加入3%的甘露醇，溶解后，轉移至-80 ℃冰箱冷凍24 h，然后迅速轉移至冷凍干燥機中凍干36 h，得到納米粒凍干粉。將過量的丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡA白蛋白納米粒凍干粉加入到5 mL水中，平行操作3次，超聲后，于（37± 0.5） ℃恒溫振搖24 h，平衡后，4 000 r·min-1離心10 min[9]。取上清液0.5 mL，按2.3.2項下方法，提取丹參酮ⅡA，進樣測定。根據實驗結果得出丹參酮ⅡA及其白蛋白納米粒制劑在水中的溶解度分別為（2.31±0.03），（708±1.15） mg·L-1（n=3）。

2.5 制劑處方優化

2.5.1 星點設計-效應面法優化處方[10] 參考預實驗中的單因素試驗結果，將剪切時間設為8 min，均質次數設為10次，有機相體積設為0.9 mL，附加劑（膽固醇和蛋黃卵磷脂）的比例設為1∶1，采用星點設計-效應面法考察牛血清白蛋白質量（A）、附加劑質量（B）和丹參酮ⅡA質量（C）對載藥白蛋白納米粒粒徑（Y1）、包封率（Y2）及載藥量（Y3）的影響。使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對3因素分別設定5水平，各因素水平見表1。以Y1，Y2和Y3共同作為評價指標，每個指標均標準化為“0～1”之間的“歸一值（desirability，di）”。公式為OD=（d1d2……dk）1/k ，k為指標數。其中，對于取值越大越好的指標（如包封率、載藥量）和取值越來越小的指標（如粒徑）分別按公式dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）和dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）計算各指標的di[11]。實驗安排及結果見表2。

2.5.2 模型擬合與方差分析 使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對上表數據進行二次多項式擬合，擬合方程為Y1=467.063 91-0.622 64A-2.743 66B-11.550 99C-0.003 012 5AB+0.015 35AC-方差分析結果顯示，該二項式擬合模型F為4.37，P<0.05，是一個顯著的模型，對響應值OD影響顯著的順序依次為B>C>A，交互項AB，AC和BC對指標的影響均不顯著，二次項A2影響不顯著，而二項式B2和C2影響顯著，由此可說明各因素間的交互作用較小。該二次項擬合模型擬合效果良好，且具有顯著性，可作為丹參酮ⅡA白蛋白納米粒處方優化預測模型。

2.5.3 等高線圖及效應面圖綜合分析 固定牛血清白蛋白質量、附加劑質量、藥物質量3個因素中任意一個，考查其他2因素交互作用對OD值的影響，結果見圖2。由圖可知，在3個因素中，對于OD影響最大的是附加劑的質量，其次是藥物質量，而白蛋白質量的影響相對很小。在一定范圍內，隨著附加劑質量的增加，OD呈非線性減小趨勢，表現為曲面較陡；而隨著白蛋白質量的增加，OD呈線性增加趨勢，表現為曲面較平滑。

根據Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對試驗結果進行系統分析，得出在擬定工藝條件下的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的最佳處方：牛血清白蛋白200 mg、附加劑的質量80 mg、丹參酮ⅡA質量20 mg。預測在此處方條件下制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的粒徑為173.3 nm，包封率為90.1%，載藥量為5.48%，OD為0.869。

2.5.4 處方驗證[12] 按照以上優化處方平行制備3批樣品，結果見表4。由表4可見，實際所得白蛋白納米粒的粒徑與預測值相差（二者之差除以預測值）1.37%，包封率與預測值相差0.75%，載藥量與預測值相差0.73%。結果表明，該模型可以準確的預測白蛋白納米粒的質量特性參數。另制劑學特性表征均按照最優處方進行測定。

2.6 體外抗腫瘤活性評價

2.6.1 白蛋白納米粒的細胞毒性 參考文獻[13]方法，選擇對數生長期的人早幼粒細胞白血病NB4細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，取100 μL的細胞懸液接種于96孔板，在96孔板外圍孔中，分別加入100 μL細胞培養基以避免邊緣效應，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的孵箱中培養12 h過夜。每孔加入經RPMI 1640培養基稀釋的空白載體溶液（白蛋白濃度依次為200，100，50，25，5 mg·L-1，每個濃度設置3個復孔）40 μL，同時設置不加載體的對照組（含細胞）及調零孔（不含細胞），然后置孵箱中培養48 h。實驗結束前4 h，每孔加入MTT液（5 g·L-1）20 μL，37 ℃培養4 h，每孔加入100 μL SDS，放置過夜后，置酶聯免疫檢測儀于570 nm測定各孔的吸光度（A），按公式“細胞存活率=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%”計算細胞存活率。結果為經不同濃度白蛋白納米粒處理的細胞，其存活率為90%±0.84%（n=3），表明空白納米粒對細胞幾乎無毒性。

2.6.2 載藥納米粒的抗腫瘤作用 細胞鋪板同2.5.1項。用培養基將載藥白蛋白納米粒稀釋至50，25，12.5，6.25，3.12 mg·L-1（每個濃度設置3個復孔）加入96孔板中，后續操作同2.5.1項。同時用培養基將丹參酮ⅡA儲備液稀釋至與載藥白蛋白納米粒相同濃度作為對照考察，結果見圖3。游離丹參酮ⅡA和載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒對NB4細胞的殺傷作用均具有濃度依賴性，且載藥白蛋白納米粒的細胞毒性顯著強于游離丹參酮ⅡA，IC50分別為（10.43±0.12），（5.69±0.04） mg·L-1（n=3）。

3 討論

血清白蛋白是一種安全、無毒、生物相容、可降解的廣泛存在于血液中的蛋白質，這些特性使其成為一種良好的載體材料[14]。目前制備白蛋白納米粒的方法主要有超聲乳化法、去溶劑化法以及蛋白結合技術。其中去溶劑化法是制備白蛋白納米粒常用的方法，但作者在預實驗中發現，丹參酮ⅡA在無水乙醇中溶解度差，無法形成載藥納米粒，故采用蛋白結合技術制備丹參酮ⅡA白蛋白納米粒。蛋白結合技術指的是在高速剪切力作用下，載藥的有機溶劑以納米液滴的形式分布于白蛋白水溶液中，在均質過程中產生的空穴和熱效應，會引起血清白蛋白的二硫鍵橋聯而形成納米粒[15]。與去溶劑化法制備的白蛋白納米粒相比，其制備工藝簡單，包封率和載藥量較高，可實現規?；a。另在預實驗中發現，加入一定量的蛋黃卵磷脂和膽固醇可顯著降低納米粒的粒徑，這可能是由于它們的存在提供了親脂性的微環境，增加了難溶性藥物丹參酮ⅡA與白蛋白的結合作用[16]。由溶解度測定結果可知丹參酮ⅡA在水中的溶解度為2.31 mg·L-1，而以白蛋白納米粒的制劑形式其溶解度可達到708 mg·L-1，與其水溶性相比提高了近300倍，較好地解決了丹參酮ⅡA的難溶性問題。在體外細胞實驗中，載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒較游離藥物表現出更優的抑瘤效果，這可能是由于白蛋白納米粒提高了丹參酮ⅡA的溶解度以及腫瘤細胞對白蛋白納米粒具有較強的攝取能力，從而增加了丹參酮ⅡA在腫瘤細胞內的聚集，發揮藥物的抗腫瘤功效[17]。

綜上，本研究采用高壓均質法制備得到的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒，不僅提高了其溶解度，還增強了其抗腫瘤藥效，將有助于拓展丹參酮ⅡA在抗血液腫瘤方面的應用。

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