紫蘇葉揮發油化學型和組分影響因素探究Ⅰ——不同生長發育期

魏長玲+張琛武+郭寶林+李衛萍+高占祥+張芬+田景

[摘要] 該論文以普遍存在的PK型、PA型及稀有的PL型3種紫蘇種質為研究對象。在紫蘇生長的營養期、開花期、果熟期3個時期進行紫蘇成熟葉樣品采集，同時分為1 d之中早7點、午12點、晚18點3個時間點，對其揮發油進行了提?。ㄋ羝麴s法）和GC-MS分析，3種化學型的樣品揮發油得率在0.08%～0.96%，不同生長時期揮發油得率大致為營養期>開花期>落葉期，營養期揮發油得率：PA型>PK型>PL型。各化學型類別不受生長發育影響，表明遺傳因素決定了化學型。PA和PK型的特征成分和主要成分相對含量都比較穩定，而PL型的特征成分隨生長發育大幅度降低，組成中還存在大量各類成分代謝的上游化合物，表明該化學型可能具有原始性和多變性。PA型特征成分紫蘇醛相對含量各個時期基本上從早到晚逐漸降低。PK型特征成分紫蘇酮在營養期和開花期中午相對含量高于早晚樣品，果熟期則相反。PL型特征成分紫蘇烯相對含量在營養期和果熟期都是中午最高，開花期則是傍晚樣品最高。綜合揮發油得率和主要成分相對含量，PA型的最佳采收時間在營養期的早晨采收；PK型的最佳采收期在各期午前均可；PL型的最佳采收期在營養期的晚上采收最好。

[關鍵詞] 紫蘇； 揮發油； 紫蘇醛型； 紫蘇酮型； 紫蘇烯型； 生長發育時期； 相對含量變化

[Abstract] This experiment researched on three kinds of Perilla frutescens including the widespread PK， PA and rare PL chemotype. The Perilla samples were the mature leaves collected in nutrition， flowering and frutescence three different phenological periods， and at 7 am， 12 pm and 6 pm three day time. The volatile oil was extracted by steam distillationand analyzed by GC-MS， as a result， the three chemotype samples′volatile oil yield was between 0.08% and 0.96%； volatile oil yield of different growth period was as follow： nutrition>flowering>fructescence， and the volatile oil yield of nutrition period： PA type>PK type>PL type. Each chemotype was not affected by the growth and development， indicating that the chemotype is determined by genetic factors. Characteristic and main components of PA and PK type are relatively stable， and the characteristic components of PL type are significantly decreased with the growth. There are still a large number of upstream metabolism components， and the chemical type may have their primitiveness and changeability. The relative content of perillaldehyde， characteristic components of PA type， is basically decreased from morning to night， in all the period. The relative content of perillaketone， characteristic components of PK type， in nutrition and flowering period， when samples were collected at 12 noon is relatively higher than that at 7 am and 6 pm， and contrary to samples collected in frutescence period. The relative content of perillene， characteristic components of PL type， in nutrition and frutescence period are highest at 12 noon， while in flowering period is highest at 6 pm. According to the volatile oil yield and relative content of maincomponents， the best harvest time of PA type is in the morning of the nutrition period； the best harvest time of PK type is in the morning of all the period； and the best harvest time of PL type is at dusk of the nutrition period.

[Key words] Perilla frutescens； volatile oil； perillaldehyde chemotype（PA）； perillaketone chemotype（PK）； perillene chemotype（PL）； phenological period； changes of relative content

紫蘇葉因存在不同的揮發油化學型從而導致藥用時活性存在差異。本實驗在前期對國內紫蘇資源調查和化學型歸類分析的基礎上[1-2]，選擇了國內資源中普遍存在的紫蘇醛型（PA型）和紫蘇酮型（PK型），以及《中國藥典》藿香正氣液項下的紫蘇葉油標準中涉及的紫蘇烯型（PL型）3種不同化學型的紫蘇[3]，研究它們不同在生長發育期、一天不同時間段的葉中揮發油化學型和構成揮發油組分的變化，并探討可能的規律。

1 材料

1.1 儀器和試劑 GC-MS（7890B-5977A）氣相質譜聯用儀器（Agilent安捷倫公司）；旋轉蒸發儀（EYELA N-1100 上海愛朗儀器有限公司）；分析天平（FA2014N型，上海精密科學儀器有限公司）；循環式真空泵（CA-1111上海愛朗儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

蒸餾水，石油醚（分析純，北京化工廠）；正己烷（色譜純，fisher公司）無水乙醇（分析純，北京化工廠）。

1.2 樣品 3份不同揮發油化學型的紫蘇種子均來自經調查后確定的栽培紫蘇主產區：PK型種子來自甘肅省慶陽市，PA型和PL型種子均來自重慶市，收集于2015年3月，種植于中國醫學科學院藥用植物研究所栽培實驗田。3份種子以其對應的化學型名稱為編號。播種期5月8日，出苗期5月17日左右。3個生長時期采集成熟葉樣品，①營養生長期（簡稱營養期）：營養生長旺盛時期，植株高度約達最終高度的2/3，PK型樣品采集于7月23日，PA型和PL型樣品采集于8月20日；②開花期：花序上半數以上花開放，PK型樣品采集于9月15日，PA型和PL型樣品采集于10月8日；③果熟期：果序上半數果實成熟，植株下部葉片開始發黃和脫落，PK型樣品采集于10月8日，PA型和PL型樣品采集于10月19日，每1個生長期，又分為早晨7時（簡稱早）、中午12時（簡稱午）和傍晚18時（簡稱晚）3個時間點取樣。葉片均采集自植株中部的成熟葉片，每個樣品約60個單株的混合，陰干，陰涼處存放。

2 方法

揮發油提取和GC-MS分析參見文獻[2]。

3 結果和討論

紫蘇葉PA，PK，PL 3個化學型在營養期、開花期、果熟期3個時期揮發油得率及GC-MS分析結果分別見表1～3。

3.1 揮發油得率的變化 PA型各生長時期揮發油得率均表現為：生長發育期對揮發油得率影響很大，營養期開花期>果熟期；從1 d的不同時間點看，營養期：早中≈晚；而開花期和果熟期：早≈中>晚。

PK型各生長時期揮發油得率均表現為：營養期≈開花期>果熟期，下降幅度不大。從1 d的不同時間點看，營養期：早≈中>晚，而開花期和果熟期：早<中，中>晚，開花期早晚差不多，而果熟期的早晨揮發油很低0.08%，是較為特殊的結果。

PL型在各生長時期揮發油得率大體表現為：營養期>開花期≈果熟期，下降幅度不大。從1 d的不同時間點看，營養期：早>午晚，開花期：早≈午晚，果熟期：早≈午<晚，在2個發育期表現為晚上得率最高，是有意思的現象。

本結果支持紫蘇葉采集時間一般應為營養期或花前期，而不應在果熟期采集，其中PA型對采集時期非常敏感，而PL型次之，PK型紫蘇則營養期直至花期采集均可。在適合采集期里，PA型應該在早晨采集，PK型則從早到午采集均可，PL型卻在傍晚采集最好。

3.2 揮發油組成變化 3種化學型樣品，在各生長發育期的化學型類型是穩定的，且石竹烯（caryophyllene）為3個化學型各時期共有的較高含量成分，與以往關于PA型和PK型的報道一致[4-7]。

PA型揮發油組成可分為4個主要部分，第一部分是該化學型的特征成分紫蘇醛（perillaldehyde）、D-檸檬烯（D-limonene），以及和該化學型代謝相關的幾個單萜： trans-shisool、紫蘇醇（perilla alcohol），紫蘇醛的相對含量大多在50%左右，花期的相對含量稍高，D-檸檬烯是紫蘇醛代謝直接上游化合物，在3個生長發育期大致是逐漸降低的趨勢，其中在開花期和果熟期的傍晚都低于2%；其他幾個成分中，紫蘇醇和trans-shisool則在果熟期增加較多，如trans-shisool在其他時期1.45%～3.36%，果熟期則為3.84%～4.95%，紫蘇醇在營養期未檢測到，花期低于1%，到果熟期傍晚則達到8.14%；第二部分是倍半萜類成分，包括石竹烯、α-佛手柑油烯（α-bergamotene）、葎草烯（humulene）、大根香葉烯D（germacrene D）、γ-欖香烯（γ-elemene）、石竹烯氧化物

（caryphyllene oxide）和α-法尼烯（α-farnesene），石竹烯在全部樣品中相對含量變化不大，15.61%～17.77%，α-佛手柑油烯在果熟期較其他時期相對含量高，其他幾個成分大多是果熟期略有增加，α-法尼烯含量較低（0～1.11%）；第三部分為該化學型中一般不會出現的單萜成分，如PK型的紫蘇酮（perillaketone）、PL型的紫蘇烯（perillen）僅在開花期檢出紫蘇酮（開花期午1.05%，晚4.39%）和紫蘇烯（開花期晚1.16%）；第四部分是芳香類化學型PP型的構成成分及相關成分，肉豆蔻醚（myristicin）及其上游代謝成分丁香酚（eugenol），肉豆蔻醚則在3個發育時期的9個時間點中6個時間點檢出，且含量大小沒有規律，如開花期僅在傍晚檢出，而含量卻最高（7.61%），丁香酚僅在開花期和果熟期的中午和傍晚檢出。另有紫蘇中所有單萜類成分代謝的共同上游成分芳樟醇（linalool），在各個時間點均有檢出（0.72%～3.76%），相對含量大致呈現隨發育期逐漸降低。

PK型揮發油組成可分為3個主要部分，第一部分是該化學型的特征成分紫蘇酮（perillaketone），以及代謝相關的白蘇烯酮（egomaketone），紫蘇酮的相對含量在48%～70%，營養期（約50%）<開花期（約60%）<果熟期（67%以上），一天的不同時間點，則營養期和開花期是中午最高，果熟期反而是中午最低，白蘇烯酮是紫蘇酮代謝的前體化合物，相對含量正好與紫蘇酮相反，且變化幅度比較大，營養期（36%以上）>開花期（大約22%）>果熟期（大約15%）；第二部分也是倍半萜類成分，包括與PA型共有的石竹烯、α-法尼烯、葎草烯、石竹烯氧化物，以及2-丁烯二環庚烷（2-（1-buten-3-yl）-bicyclo[2.2.1]heptane）和保留時間為11.01的未知成分（經GC/MS軟電離分子量分析，為倍半萜成分），均相對含量變化不大。第三部分為該化學型中一般不會出現的單萜類，如PA型的D-檸檬烯，僅在開花期的中午檢測出，微量（0.13%）。未檢出芳香類化合物。另外上游單萜成分芳樟醇在開花期和果熟期檢測到，相對量均小于1%。另有一種在植物揮發油中常存在的1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol），又叫蘑菇醇，在開花期和果熟期檢出，相對量也均小于1%。

PL型揮發油組成可分為4個主要部分，第一部分是該化學型的特征成分紫蘇烯，其含量在不同生長發育期表現為極大的差異，營養期（大于75%）>開花期（54.51%～60.70%）>果熟期（3.57%～24.36%）；第二個部分是倍半萜類成分，包括和PA， PK共有的石竹烯、α-佛手柑油烯、葎草烯、石竹烯氧化物、α-法尼烯，以及和PA共有的大根香葉烯D、還有反式橙花叔醇（trans-nerolidol），石竹烯、α-佛手柑油烯和大根香葉烯D在生長發育期均表現為營養期<開花期<果熟期，且變化幅度很大，如石竹烯從營養期的大約7.52%～9.31%變為果熟期的19.02%～25.71%，其他幾種倍半萜或者在營養期、或者在花期未檢出，或相對含量很低，而果期均相對含量均增加，且大多高于在PA和PK型中的同期情況；第三部分為其他化學型中的單萜成分，如紫蘇醛、D-檸檬醛，紫蘇酮，薄荷酮，均在部分時間點的樣品中檢出，含量不高，也未見明顯規律；第四部分為芳香類化學型中的成分，如細辛腦（asarone）、丁香酚，且含量較高。在PL型中還發現紫蘇單萜成分代謝過程中的多個上游化合物，除了芳樟醇，還有順勢牻牛兒醇（cis-geraniol）、順式檸檬醛（cis-citral）、反式檸檬醛（trans-citral），均是在部分時間點檢出。此外PL型中還檢出了一些植物揮發油中常見成分，除了1-辛烯-3-醇，還有鄰二甲苯（O-xylene）、甲基水楊酸（methyl-salicylate），也是在部分時間點檢出。

Nitta等通過雜交實驗推測了紫蘇葉揮發油中主要化學型構成成分單萜類和芳香類兩類成分的生物合成途徑，單萜類以甲羥戊酸（mevalonic acid）途徑合成，芳香類終產物以莽草酸（shikimic acid）途徑合成，兩途徑之間因基因控制而發生切換[8]。從生源合成途徑來看，本實驗的3個化學型樣品均以甲羥戊酸途徑合成，但在PA型樣品全生長期均檢出芳香類成分肉豆蔻醚、開花期和果熟期檢出芳香類成分的前體化合物丁香酚，PL型樣品的全生長期均檢出丁香酚、果熟期檢出芳香類成分細辛腦，而PK型樣品各時期均未檢出芳香類成分，故作者認為對于PA型和PL型，單萜類和芳香類2個合成途徑之間可能并非嚴格的單基因控制。紫蘇烯是紫蘇酮的前體化合物，但自然界PK型為最普遍的化學型，在已有報道的PK型紫蘇揮發油中一般無紫蘇烯成分或微量存在（0.8%）[9-12]，說明紫蘇烯很容易轉化為紫蘇酮。PA型和PL型中均檢出紫蘇酮，而PK型中僅檢出極微量的PA型特征成分D-檸檬烯，說明PK型較PA和PL型為優勢（顯性）化學型[10]，另外從種類和相對含量上，PK型中較少代謝上游單萜成分，而PA型較多、PL型更多，其他文獻也支持這樣的狀況[13]，表明幾種化學型中可能PL較為原始、PA適當進化，PK更為進化，本研究結果為進一步探討紫蘇單萜類成分的代謝控制，以及不同化學型之間的進化關系，有一些不錯的提示[13]。

3.3 主要成分相對含量變化 本實驗選擇了每種化學型的相對含量在前5位的化合物，比較它們在不同發育期（早晨）相對含量的變化，結果參見圖1。

PA型揮發油中主要成分單萜類的紫蘇醛、D-檸檬烯和trans-shisool，以及倍半萜類的石竹烯、α-佛手柑油烯均表現為在不同發育期內相對含量的穩定性，表明單萜類的幾種成分的轉化不受生長發育影響。

PK型揮發油中主要成分單萜類的紫蘇酮和白蘇烯酮表現為隨生長發育前者上升，后者下降的趨勢，而二者之和相對穩定，而倍半萜類的石竹烯、α-法呢烯和石竹烯氧化物表現穩定，表明白蘇烯酮轉化為有條件轉化，紫蘇酮受生長發育較大影響。由于白蘇烯酮存在于PK型紫蘇中的情況較少，因此本實驗樣品表現出了一種特殊性，可作為一種特殊研究材料。

PL型揮發油中主要單萜成分紫蘇烯，隨生長發育呈現出相對含量大幅度減少的趨勢。而倍半萜成分α-佛手柑油烯、石竹烯、大根香葉烯D不同于PA和PK型，相對含量均呈增加趨勢。芳香類成分丁香酚相對含量也呈增加趨勢。PL型中主要特征成分隨生長發育的相對含量巨幅減少，而其他成分的相對含量增加，都表明PL型的化學構成的特殊性，這為闡明紫蘇葉揮發成分的生物合成具有重要的價值。

4 小結

綜合生長發育期和一天不同時間點的揮發油得率和揮發油中特征成分相對含量（得率×相對含量）的變化，PA的最佳采收時間在營養期的早晨采收；PK型的最佳采收期在開花期的中午，營養期和開花期的午前均可；PL型的最佳采收期在營養期的晚上采收最好。由于本項目設定的營養期為植株尚未長到最終高度的時期，且本論文各類型均只涉及一個實驗樣品，因此有必要對更多的紫蘇種質進行營養期至開花期的主要特征成分含量變化的研究，以確定最佳的采收時間，以及適合的采收期范圍。

各化學型類別不受生長發育影響，表明遺傳因素決定了化學型。PA和PK型的特征成分和主要成分相對含量都比較穩定，而PL型的特征成分隨生長發育大幅度降低，倍半萜類成分和芳香類成分的相對含量在生長發育期呈現較大變化，而且組成中還存在大量各類成分代謝的上游化合物，表明該化學型可能具有原始性和多變性。

一天之中，PA型特征成分紫蘇醛相對含量各個時期基本上從早到晚逐漸降低，D-檸檬烯相對含量早晨較傍晚高。PK型特征成分紫蘇酮在營養期和開花期中午相對含量高于早晚樣品，果熟期則相反。PL型特征成分紫蘇烯相對含量在營養期和果熟期都是中午最高，開花期則是傍晚樣品最高。

揮發油中組分的含量無論是隨生長發育還是一天的變化包括了合成、降解、轉化和散發幾個同時作用的過程，本研究通過對3個紫蘇單萜類化學型組成變化的初步研究有助于找到一些特殊的類型和變化階段，為后續深入的合成生物學研究奠定基礎。

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