七葉膽苷ⅩⅤⅡ大鼠體內藥代動力學研究

王超+顧冬冬+王彥+韓雪春

[摘要] 應用高效液相色譜-質譜聯用分析方法，建立七葉膽苷ⅩⅤⅡ體內分析方法，方法學結果顯示線性范圍為1～2 500 μg·L-1（r=0.996 3）；高、中、低3種不同濃度的日內RSD分別為9.9%，3.0%，1.7%；日間RSD分別為16%，14%，2.5%；基質效應90.0%～100%，RSD<15%；回收率>80.0%。對大鼠靜脈和灌胃給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ對照品后測定血漿中濃度隨時間的動態變化過程，繪制藥時曲線，并根據藥時曲線計算藥代動力學參數。用DAS 2.0軟件計算得到七葉膽苷ⅩⅤⅡ在大鼠體內口服藥代動力學參數tmax為0.17～0.20 h，t1/2為1.94～2.56 h，生物利用度為1.87%。結果顯示七葉膽苷ⅩⅤⅡ藥動學特征為口服吸收分布快，達峰時間快，消除快。

[關鍵詞] 七葉膽苷ⅩⅤⅡ； 藥代動力學； LC-MS/MS； 血藥濃度

[Abstract] In this study， we established an HPLC-MS method to determine gypenoside ⅩⅤⅡ in biosamples. The methodology results indicated that the linear range was 1-2 500 μg·L-1（r=0.996 3）； intraday RSD values for high， medium and low concentrations were 9.9%， 3.0% 1.7%； interday RSD values were 16%， 14%， 2.5%； matrix effect ranged between 90.0%-100%， with RSD<15%. The recovery was more than 80.0%， with precision and accuracy in line with request. After the rats were orally and intravenously administered with gypenoside ⅩⅤⅡ， the concentrations of gypenoside ⅩⅤⅡ in plasma were determined， and pharmacokinetic parameter was calculated using pharmacokinetic software DAS 2.0. According to the main pharmacokinetic parameters of gypenoside ⅩⅤⅡ， tmax was 0.17-0.20 h， t1/2 was 1.94-2.56 h， bioavailability of oral administration was 1.87%. The results indicated that the pharmacokinetic profiles of gypenoside ⅩⅤⅡ were rapid absorption and distribution after oral administration， short time to peak and rapid elimination.

[Key words] pypenoside ⅩⅤⅡ； pharmacokinetics； LC-MS/MS； plasma concentration

三七Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen為五加科人參屬植物，又名田七、金不換等，為我國名貴中藥材，產于云南和廣西[1]。三七具有活血化瘀、消腫止痛和滋補強壯等功效[2]，主要化學成分為皂苷、黃酮、多炔醇、多糖、氨基酸、肽以及脂肪酸等，其中三萜皂苷類成分是三七制劑的主要有效成分和質控指標[3]。目前對于皂苷的研究大多數集中于三七藥材中含量較高的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd等[4-5]。

現代藥理學研究表明，三七中含有的一些微量皂苷成分也具有很顯著的藥理活性。七葉膽苷在體內具有抗腫瘤活性，其可能機制為代謝生成了具有誘導腫瘤細胞凋亡作用的20-O-（β-吡喃葡萄糖基）-20（S）-原人參二醇[6]。據報道，從三七中發現的一種新的植物雌激素七葉膽苷ⅩⅤⅡ屬于七葉膽苷類化合物，通過抑制氧化應激，抑制腦缺血導致的神經損傷，進而抑制氧化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，其作用機制可能與抑制免疫炎癥因子的分泌和自由基清除作用有關，從而起到防止動脈粥樣硬化的作用[7]。為了更好地理解七葉膽苷ⅩⅤⅡ的作用機理、作用過程，有必要全面了解其體內動態變化規律。本研究監測七葉膽苷ⅩⅤⅡ大鼠體內血藥濃度變化規律，為后期藥物安全性評價、臨床新藥研究提供科學依據。

1 材料

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀，Thermo TSQ Vantage，ESI 離子源，XS105 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Legend Micro17 微量臺式離心機（美國Thermo Finnigan 公司）；Vortex Genie-2 渦旋振蕩器（美國Scientific 公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲波清洗器）。

七葉膽苷ⅩⅤⅡ對照品（批號130421，純度>98%）和內標人參皂苷Rg1（批號140809，純度>95%）購自上海同田生物技術股份有限公司；甲酸（分析純，中國國藥控股有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）。

雄性/雌性Wistar大鼠，體重（200±20） g，購自北京維通利華有限公司。普通飼料喂養，自由飲水進食，適應性喂養1周。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫 45 ℃；流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，10%～50%B，2～3.5 min，50%～90%B，3.5～6 min，90%B，6～6.5 min，90%～10%B，流速0.4 mL·min-1；進樣體積10 μL。

質譜參數：Thermo TSQ Vantage三重四級串聯質譜儀；ESI離子源；負離子檢測模式；離子源參數設置：噴霧電壓（spray voltage）3.0 kV；噴霧溫度（vaporizer temperature）200 ℃；鞘氣流速（sheath gas）40 unit；輔助氣流速（aux gas）10 unit；毛細管溫度（capillary temperature） 300 ℃；碰撞氣（collision gas， argon）1.5 mTorr；質譜掃描模式選擇反應監測（SRM）：七葉膽苷ⅩⅤⅡ m/z 945.5/783.8，CE 31 eV；GRg1 m/z 799.5/637.6，CE 24 eV。所有操作以及數據處理由Xcalibur（version 2.2）軟件控制。

2.2 給藥方案與血樣采集

2.2.1 尾靜脈給藥

12只SD大鼠，實驗前禁食12 h，實驗期間自由飲水。以2 mg·kg-1經尾靜脈注射給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ溶液，于給藥后5，10，20，40，60，120，180，240，360，480，720 min經眼球后靜脈叢采血 0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r·min-1離心 10 min，吸取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.2.2 口服給藥

12只SD大鼠，實驗前禁食12 h，實驗期間自由飲水。以50 mg·kg-1（2.0 mL·kg-1）的劑量口服給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ溶液，于給藥后5，10，20，40，60，90，120，180，240，360，480，720 min經眼球后靜脈叢采血0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r·min-1離心 10 min，吸取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.3 血漿樣品預處理

取大鼠血漿樣品50 μL，加入內標溶液50 μL，甲醇150 μL，渦旋混合30 s，15 000×g離心10 min，吸取上清液10 μL，進樣分析，記錄色譜圖。此外，由于靜注給藥后5 min血藥濃度超過了儀器的定量上限。因此，將該時間點得到的血漿樣品用空白血漿稀釋1倍后再按照上述處理方法處理。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察

取大鼠空白血漿，除不加內標溶液并補加相應體積的甲醇外，其余按2.3項下操作，獲得空白血漿樣品色譜圖；另取50 μL質量濃度為500 μg·L-1的七葉膽苷ⅩⅤⅡ對照溶液，37 ℃氮氣吹干后，加入50 μL空白血漿渦旋混合均勻，其余按2.3項下操作，獲得模擬生物樣品色譜圖；再取靜注給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ（2.0 mL·kg-1）后60 min血漿樣品，按2.3項下操作，獲得給藥血漿樣品色譜圖。

2.4.2 線性關系、檢測限與定量限試驗

精密移取各標準系列溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入50 μL空白血漿渦旋混合均勻配制成相當于1，5，10，50，100，500，1 000，2 500 μg·L-1的七葉膽苷ⅩⅤⅡ標準系列溶液，其余按2.3項下操作。以七葉膽苷ⅩⅤⅡ濃度為橫坐標（C），七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內標峰面積比值為縱坐標（R），以加權（1/x2）最小二乘法進行線性回歸運算，得回歸方程即為標準曲線。

2.4.3 精密度和準確度試驗

按標準曲線配制方法制備含七葉膽苷ⅩⅤⅡ質量濃度分別為5，50，2 000 μg·L-1的質量控制 （QC）樣品，每個濃度平行配制5份。取空白血漿50 μL，按2.3項下操作，連續測定3 d，記錄色譜圖，計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ峰面積As和內標峰面積Ai的比值fx，代入當天的標準曲線求得實測濃度及實測濃度準確度，計算日內和日間精密度，與配制濃度相比，求得方法的準確度。

2.4.4 提取回收率試驗

精密移取各QC標準溶液50 μL置1.5 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL，渦旋混合均勻后加入200 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混合30 s，15 000×g離心10 min，分取上層清液150 μL，加入內標50 μL，渦旋混合均勻后，吸取10 μL進樣分析，記錄色譜圖，每一濃度平行配制5份，計算各濃度樣品和內標的峰面積比值A。

另取空白血漿50 μL，加入甲醇200 μL沉淀蛋白，渦旋混合30 s，15 000×g離心10 min，分取上層清液，得空白血漿上清液。另取各標準溶液50 μL，置1.5 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿上層清液250 μL，渦旋混合均勻后，吸取150 μL加入50 μL內標溶液，渦旋混合均勻后吸取10 μL進樣分析，記錄色譜圖，每一濃度平行配制5份，計算各濃度樣品和內標的峰面積比值B。A與B的比值即為七葉膽苷ⅩⅤⅡ的提取回收率。

2.4.5 穩定性試驗

2.4.5.1 短期穩定性 精密移取各標準溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，在室溫下放置24 h后按2.3項下操作，每一濃度5個樣品，記錄相應的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內標峰面積的比值帶入隨行標曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算實測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品短期穩定性。若比值為85.0%～115%，則認為樣本穩定。

2.4.5.2 長期穩定性 精密移取各標準溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，在-20 ℃冰箱中放置14 d后按2.3項下操作，每一濃度5個樣品，記錄相應的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內標峰面積的比值帶入隨行標曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算所測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品的長期穩定性。若比值在85.0%～115%，則認為樣本穩定。

2.4.5.3 凍融穩定性 精密移取各標準溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，置-20 ℃冰箱儲存24 h，取出解凍后再置于-20 ℃儲存24 h，取出，解凍，再置-20 ℃儲存24 h取出解凍后進樣分析，記錄相應的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內標峰面積的比值帶入隨行標曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算所測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品的凍融穩定性。若比值在85.0%～115%，則可認為樣本穩定。

2.4.5.4 樣品在進樣器中穩定性 精密移取各標準溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，按2.3項下操作，在自動進樣器中放置8 h后進樣分析，每一濃度5個樣品，記錄相應的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內標峰面積的比值帶入隨行標曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算所測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品在進樣器中的穩定性。若比值在85.0%～115%，則可認為樣本穩定。

2.5 基質效應

取空白血漿，按2.3項下操作制備空白血漿上清液適量，備用。精密移取100 μL質量濃度為5，50，2 000 μg·L-1標準溶液于1.5 mL離心管中，以氮氣流吹干。殘渣以空白血漿上清液100 μL復溶，15 000×g離心10 min，分取上層清液，進行LC-MS分析。記錄色譜圖，記錄七葉膽苷ⅩⅤⅡ峰面積A。

精密移取100 μL質量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的標準溶液于1.5 mL離心管中，以氮氣流吹干。殘渣以蒸餾水100 μL復溶，15 000×g離心10 min，分取上層清液，進行LC-MS分析。記錄色譜圖和七葉膽苷ⅩⅤⅡ峰面積B，計算基質效應（matrix effect，ME）。ME=A/B×100%。若ME在85.0%～115%，則可認為沒有基質效應。

2.6 藥動學研究

實驗資料采用中國藥理學會編寫的藥代動力學統計軟件包DAS 2.0進行非房室模型擬合，計算口服給藥的生物利用度（bioavailability，BA）。BA=（AUCpo × Dose iv）/（AUCiv × Dosepo）×100%。

3 結果

3.1 色譜、質譜條件優化

對七葉膽苷ⅩⅤⅡ和內標Rg1進行質譜全掃模式研究。在負離子模式下，七葉膽苷ⅩⅤⅡ能夠產生m/z 915.98[M-H]-，對其進行二級質譜分析，其主要碎片為m/z 783.87。因此，選擇離子對m/z 945.5/783.94為七葉膽苷ⅩⅤⅡ的SRM定量離子對。同樣對內標GRg1也進行相關二級能量等參數優化，m/z 799.90/637.64作為GRg1的SRM定量離子對。在色譜條件優化過程中，選擇不同流動相進行相關實驗，乙腈作為有機相時峰型較好，分析時間較短，最終選擇乙腈作為有機相。

3.2 血漿樣品處理方法

比較了有機溶劑沉淀蛋白、液-液萃取法和固相萃取法，固相萃取處理的樣品能除掉大部分的鹽和干擾物質，但萃取小柱價格昂貴，沉淀蛋白處理的樣品操作簡單，重復性好，成本最低。因此從經濟角度考慮選擇沉淀蛋白作為樣本處理方法。

3.3 分析方法學驗證

3.3.1 系統適用性與專屬性試驗

空白血漿、空白血漿加標準品以及給藥后所得血漿色譜圖見圖1。結果表明，在該色譜條件下，七葉膽苷ⅩⅤⅡ和內標保留時間分別為3.67，2.51 min，血漿中內源性雜質不干擾七葉膽苷ⅩⅤⅡ和內標的測定。

3.3.2 標準曲線與最低定量限

以七葉膽苷ⅩⅤⅡ濃度為橫坐標，七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內標峰面積比值為縱坐標，以加權最小二乘法進行線性回歸運算，得標準曲線方程為R=0.007 07+0.006 11 C，r=0.996 3， weight=1/c/c。標準曲線各個濃度點的準確度在85.0%～115%。結果表明，七葉膽苷ⅩⅤⅡ在1～2 500 μg·L-1線性關系良好。方法檢測限（LOD）為0.3 μg·L-1（S/N>3），最低定量限（LLOQ）為1 μg·L-1（S/N>10），表明該方法靈敏度較高，可用于七葉膽苷ⅩⅤⅡ的微量分析。

3.3.3 精密度與準確度

精密度和準確度結果見表1，結果表明，高、中、低3個濃度日內精密度與日間精密度RSD均小于15%，準確度為93.90%～99.41%。

3.3.4 基質效應與提取回收率（絕對回收率）

方法提取回收率結果見表2，結果表明，高、中、低3個濃度提取回收率均符合生物樣本的分析要求，且RSD均小于15%，該方法提取回收率較高?；|效應測定結果表明，內源性物質不干擾七葉膽苷ⅩⅤⅡ的測定，ME為90.0%～100%，且RSD小于15%。

3.3.5 樣本穩定性

穩定性試驗結果表明，七葉膽苷ⅩⅤⅡ在血漿中-20 ℃放置14 d，室溫下放置24 h，經過3個凍融

結果表明，所建立的血漿樣品分析方法符合有關規定的要求，可以用于七葉膽苷ⅩⅤⅡ體內藥代動力學研究。

3.4 藥動學研究

3.4.1 靜脈注射給藥后七葉膽苷ⅩⅤⅡ在大鼠體內藥動學過程

大鼠靜脈注射給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ（2 mg·kg-1）后，其體內血藥濃度-時間曲線見圖2。七葉膽苷ⅩⅤⅡ靜脈注射后能夠快速從大鼠體內消除，給藥后12 h其體內血藥濃度基本檢測不到（低于LLOQ）。七葉膽苷ⅩⅤⅡ的總體清除率CL為（3.45±1.70） L·kg-1·h-1，其消除半衰期t1/2小于2 h，藥動學非房室分析所得藥動學參數見表4。

3.4.2 口服給藥后七葉膽苷ⅩⅤⅡ在大鼠體內藥動學過程

大鼠口服給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ后（50 mg·kg-1），其體內血藥濃度-時間曲線見圖3。

七葉膽苷ⅩⅤⅡ口服給藥后能夠迅速從胃腸道吸收進入血中，給藥后5 min在血中可以檢測到七葉膽苷ⅩⅤⅡ，并迅速達到最大血藥濃度，達峰時間為0.19 h?？诜o藥后七葉膽苷ⅩⅤⅡ消除非?？?，半衰期較短?？诜锢枚容^低，為1.87%，可能是由于其極性大，脂溶性較差，難以透過腸系膜所致。非房室模型分析所得藥動學參數見表5。七葉膽苷ⅩⅤⅡ無論靜注還是口服，其體內滯留時間均較短，消除較快，半衰期約為2 h，屬于短半衰期類藥物。同時，體內藥動學行為基本不存在性別差異；t1/2，MRT，CL等主要藥動學參數無顯著性差異。有文獻報道[8-9]，原人參二醇型皂苷三七皂苷Fc，人參皂苷Rb1等都屬于長半衰期（t1/2>20 h）的化合物，這表明皂苷類化合物半衰期可能與皂苷結構中糖的種類、取代的位點以及糖的數目都有一定關系。

4 結論

本研究建立了測定大鼠血漿中七葉膽苷ⅩⅤⅡ的LC-MS/MS方法，該方法簡單、靈敏、快捷，精密度等線性關系良好，可以用于生物樣本中七葉膽苷ⅩⅤⅡ的藥代動力學研究。這為理解七葉膽苷ⅩⅤⅡ的作用機制、作用過程奠定了基礎，為后期藥物安全性評價、臨床新藥研究提供了科學依據。

[參考文獻]

[1] 時圣明， 李巍， 曹家慶， 等. 三七果化學成分的研究[J]. 中草藥， 2010， 41 （8）： 1249.

[2] Wan X Q， Chen S H， Peng Y S， et al. Comparative of Notoginseng Radix et Rhizome and its processed products on enriching blood and supplementing Qi of rats with blood-deficiency [J]. Chin J Mod Appl Pharm， 2014， 31（6）： 696.

[3] 中國藥典. 一部[S]. 2015.

[4] 陳華麗，潘堅揚，瞿海斌，等.HPLC測定三七提取液中三七皂苷R2（S）、七葉膽苷XVII和人參皂苷F2的含量[J].中國現代應用藥學，2015，32（9）：1114.

[5] 萬曉青， 夏伯侯， 樓招歡， 等. 三七不同炮制品中皂苷類成分的含量比較[J]. 中華中醫藥雜志， 2011（4）： 841.

[6] Lee S J， Ko W G， Kim J H， et al. Induction of apoptosis by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin via cytochromec-mediated activation of caspase-3 protease[J]. Biochem Pharmacol， 2000（60）： 677.

[7] 楊科， 羅云， 邢娜， 等. 七葉膽苷ⅩⅤⅡ對氧化低密度脂蛋白誘導人臍帶靜脈內皮細胞損傷的保護作用研究[C]. 瀘州：中國微循環學會痰瘀專業委員會學術會議，2015.

[8] Zhao J， Su C， Yang C， et al. Determination of ginsenosides Rb1， Rb2， and Rb3 in rat plasma by a rapid and sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry method： application in a pharmacokinetic study[J]. J Pharm Biomed Anal， 2012（64/65）：94.

[9] He C， Li J， Xu N， et al. Pharmacokinetics， bioavailability， and metabolism of notoginsenoside Fc in rats by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal， 2015， 38：150.