孕期尼古丁暴露所致成年子代雌鼠代謝綜合征易感的宮內起源機制

劉永斌 夏利平 裴林國 袁超 汪暉

生命早期的發育狀況對于機體代謝的終身影響乃至對成年期發生某些慢性疾病的重要意義，日益受到重視。早在1989年，英國流行病學學家Barker教授[1]就提出了“成人疾病的胎兒起源(fetal origins of adult disease)”假說。流行病學研究顯示，出生體重的差異來源于62%的宮內環境因素、20%的母體基因因素和18%的胎兒基因因素。學者利用人群流行病學研究和動物實驗的方法對Barker假說進行了驗證，并提出不單是胎兒期營養狀況會對健康產生長久影響，嬰幼兒期、兒童少年期甚至青壯年期的營養均會對其后期的健康產生一定程度的影響[2-3]。研究表明，85%～90%的宮內生長遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)胎兒在出生后2年發生追趕式生長，且有追趕式生長者更易于發生胰島素抵抗(insulin resistance, IR)[4]。大量流行病學研究表明，IUGR、追趕式生長及伴隨而來的肥胖與后期代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)、心血管疾病、2型糖尿病和非酒精性肝病發生密切相關[5-8]。

研究發現，孕期尼古丁、咖啡因和乙醇暴露皆可引起胎兒母源性糖皮質激素(glucocorticoid, GC)過暴露和下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸功能低下，IUGR子代出生后HPA軸呈低基礎活性和高應激敏感性改變，并伴有GC依賴的糖脂代謝改變，提出了外源物的“宮內神經內分泌代謝編程”機制[9-11]。研究表明，母體GC通過胎盤屏障進入雌性胎兒的量比進入雄性胎兒的量更大，提示了母體應激對雌性后代HPA軸的影響比雄性后代更大[12]。本研究通過觀察高脂飲食(模擬高營養狀態)、慢性應激(模擬高社會壓力)及孕期尼古丁暴露(prenatal nicotine exposure, PNE)對子代雌鼠成年后的影響，從而進一步探討IUGR子代MS易感的宮內起源機制，為特殊群體的優生優育和生后的合理干預提供更多的理論依據。

對象與方法

一、對象

1. 實驗動物：未孕SPF級Wistar大鼠，雌性體重200～240 g，雄性體重260～300 g，購于湖北省疾病預防中心(合格證號：SCXK(鄂) 2007—2009，中國湖北)。

2.主要試劑：尼古丁(CAS. NO.54-11-5)購于中國濰坊三強集團公司；大鼠腎上腺激素釋放激素(adrenocorticotropin-releasing hormone, ACTH)試劑盒購于北京北方生物研究所；大鼠皮質酮(corticosterone, CORT)試劑盒購于美國R&D公司；胰島素ELISA試劑盒購于瑞典Mercodia公司；葡萄糖氧化酶法試劑盒購于上海名典生物工程有限公司；1型11β-羥類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1, 11β-HSD1)、糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GR)、鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)及內對照磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物、甘油三酯(triglyceride, TG)和總膽固醇(total cholesterol, TCH)試劑盒均購于上海生工生物工程技術有限公司；高密度脂蛋白-膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白-膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)試劑盒購于浙江創業生物有限公司。逆轉錄 PCR試劑購于大連TaKaRa公司；Applied Biosystems Step One實時定量PCR儀和PCR試劑盒購于美國Applied Biosystems公司。

二、方法

1.處理方法：大鼠適應性喂養1周后，于每晚6點按照雌鼠：雄鼠=2:1合籠，次晨陰道分泌物涂片鏡檢見精子者記為孕0天(gestational day 0, GD0)。將孕鼠隨機分為對照組和PNE組，每組8只。自GD11開始，PNE組給予尼古丁2 mg/(kg·d)(皮下注射，分2次給予)至分娩；對照組給予等體積蒸餾水。分娩0天，每窩仔鼠數量調整為8只(雌雄數量均等)，以保證哺乳期均等的營養。仔鼠于產后(postnatal week)1周PW1起每周稱體重，并計算PW1—36的體重增長率，體重增長率(%)=(PWX體重-PW1體重)×100/PW1體重。PW4斷奶后，各組每窩仔鼠隨機選1只雌鼠，給予高脂飲食[13]，PW24轉為標準飲食飼養至PW40。兩組子代鼠于PW38—40給予不可預見性慢性應激(unpredictable chronic stress, UCS)，末次應激3天后，處死大鼠取血和海馬組織。從妊娠0天到出生后40周動物實驗流程圖見圖1。

圖1 從妊娠0天至生后40周動物實驗流程圖

2.不可預見性慢性應激實驗(UCS)：根據文獻[14]，包括7種應激因子，如攝食限制24 h、水限制24 h、尾部夾痛5 min、45 ℃烘箱烤5 min、4～8 ℃冷水游泳4 min、顛倒晝夜循環及社會隔離(每個籠子1只大鼠)24 h，共持續14 d。

3.血代謝表型測定：根據試劑盒的說明，檢測血ACTH、CORT、血糖、胰島素、TG、TCH、LDL-C和HDL-C的水平，并計算胰島素抵抗指數(insulin resistance index, IRI)和TG、TCH、LDL-C與HDL-C的比值。

IRI=空腹血糖(FBG)×空腹胰島素(FINS)/22.5

4.海馬相關基因的表達：取海馬組織30 mg，按RNA-Solv Reagent 說明書提取總RNA。測A260和A280，并計算總RNA的濃度及純度，調整總RNA濃度至1 g/L。cDNA合成和PCR擴增均按試劑盒方法說明進行。檢測海馬組織11β-HSD1、GR和MR的mRNA表達。各引物見表1。擴增產物回收按試劑盒說明進行。將回收產物以10倍梯度稀釋成一系列濃度，根據預實驗結果選取6個梯度濃度為標準品，與樣品一起采用實時定量PCR儀擴增；以標準品的相對濃度為橫坐標，測得各自的Ct值為縱坐標得到標準曲線。采用2-ΔΔCt計算mRNA表達的相對水平。

表1 引物序列

5.統計學處理：采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以(均數±標準誤)表示，采用雙尾t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、出生后體重及其增長率的變化

觀察和記錄PNE子代出生后1周體重及其變化情況，見圖2。PW1時，PNE組雌鼠體重為(10.3±0.5)g明顯低于對照組[(13.9±0.3)g]，直至PW40，PNE組雌鼠體重[(242.2±1.8)g]始終未超過對照組[(252.7±2.2)g]，差異均有統計學意義。進一步分析可見，在PW16前，PNE組雌鼠體重增長率(1540.62±65.58)超過對照組(1634.71±119.51)，之后持續高水平，出現統計學差異。提示低出生體重的PNE組雌鼠在“高營養”狀態下體重呈現“追趕式生長”。

圖2 孕期尼古丁暴露對子代雌鼠體重和體重增長率的影響 A.生后1周和36周體重; B.每月體重; C.體重增長率。與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01；與生后一周比較，##P<0.01

二、HPA軸活性

通過檢測成年雌鼠血ACTH和CORT水平，海馬相關基因的表達，進一步了解成年雌鼠HPA軸的活性，見圖3。PNE組大鼠血ACTH水平[(16.36±2.58)pg/ml]與對照組相當[(18.21±3.87)pg/ml]，血CORT水平[1061.76±92.58]較對照組[(361.06±97.47)pg/ml]明顯升高，差異有統計學意義(圖3A、B)；海馬11β-HSD1[0.12±0.03]明顯較對照組[0.05±0.01]升高，差異有統計學意義，而GR、MR表達及MR/GR[(6.85±1.01)、(0.16±0.05)、(0.03±0.01)]比與對照組相當[(5.88±0.58)、(0.20±0.04)、(0.03±0.01)](圖3C—E)，差異無統計學意義。提示PNE組雌鼠經歷體重追趕式生長和晚期慢性應激后，海馬HPA軸負反饋調節功能明顯減弱，HPA軸功能持續亢進。

圖3 孕期尼古丁暴露對子代成年雌鼠血促腎上腺皮質激素和皮質酮水平及海馬相關基因表達的影響 A.血ACTH;B.血CORT;C.海馬11β-HSD1 mRNA;D.海馬GR mRNA;E.海馬MR mRNA;F.海馬 MR/GR。與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01

三、糖脂代謝功能

為觀察經歷早期高營養和后期慢性應激下PNE成年雌鼠糖脂代謝的改變，檢測和分析糖脂代謝血表型變化，見圖4。PNE組成年雌鼠的血糖和胰島素水平[(5.82±0.31)mmol/l、(103.39±9.11)μIU/ml]較對照組[(4.16±0.32)mmol/l、(45.14±1.39)μIU/ml]明顯升高，致使IRI[(27.86±5.15)]隨之較對照組[(8.11±1.29)]升高，差異有統計學意義(圖4A—C)；PNE組成年雌鼠TG、TCH和LDL-C水平[(3.71±0.30)mmol/l、(1.35±0.14)mmol/l、(1.11±0.01)mmol/l]較對照組[(3.30±0.25)mmol/l、(1.23±0.10)mmol/l、(0.38±0.04)mmol/l]呈不同程度升高，尤以血LDL-C水平升高明顯，差異有統計學意義(圖4D)；進一步分析血脂比值改變發現，LDL-C/HDL-C比值(1.58±0.21)明顯高于對照組(0.66±0.07)，差異有統計學意義(圖4E)。提示PNE成年雌鼠10月齡時出現高血糖、高胰島素血癥、IR及以LDL-C升高為主的高血脂。

圖4 孕期尼古丁暴露對子代成年雌鼠糖脂代謝的影響 A.血糖;B.血胰島素;C.胰島素抵抗指數 (IRI);D.血脂;E.血脂比值。與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01

討 論

中國成人MS患病率達14%～16%[15]。MS是高血壓、高血糖、血脂紊亂和肥胖等多種疾病在人體內集結的一種狀態，可直接引起脂肪肝、糖尿病和心腦血管疾病等。IR是共同的病理生理基礎。越來越多的證據表明，胎兒發育對宮內環境的改變非常敏感，胎兒針對不良宮內環境做出的適應性反應將對胎兒出生后的健康和生存產生長期的影響。流行病學調查表明，IUGR胎兒發生成年MS的概率是2.3%，是正常體重胎兒的5.75倍，提示MS存在宮內起源[16]。追趕式生長可發生在包括嬰幼兒、青少年期和成年期在內的生命任何階段，其目的是為了減輕或消除發育不良帶來的不利影響。然而，越來越多的研究顯示，這一代償機制會對機體造成后續危害，導致中心性肥胖、2型糖尿病和心血管疾病。本研究發現，在經歷了出生后早期高營養狀態和成年期慢性應激的10月齡PNE雌鼠出現高血皮質酮、高血糖、高血胰島素、血脂紊亂，提示PNE可導致子代追趕式生長、IR及MS易感，患心腦血管疾病的風險增加。

越來越多的研究提示，宮內HPA軸的編程改變是成年后MS發生的最可能機制[17]，HPA軸的調控異常及GC的外周代謝參與了IR的發生、發展[18-20]。研究發現，海馬組織中11β-HSD1和GR共存于同一個神經元內[21]，11β-HSD1、GR與MR共同參與對HPA軸的負反饋調節活動。相關研究結果顯示，成年期4月齡IUGR仔鼠慢性應激后海馬11β-HSD1、GR、MR等表達顯著升高，提示慢性應激后IUGR仔鼠試圖通過產生更多的11β-HSD1和GR來負反饋抑制HPA軸活性，使亢進的HPA軸逐漸回到基礎狀態[9-10]。然而，本研究發現，在經歷了生后早期高營養狀態和成年期慢性應激的10月齡PNE組雌鼠的海馬11β-HSD1表達仍明顯高于對照組，但是GR的表達不再明顯增加、MR表達則呈降低趨勢，提示PNE組成年雌鼠海馬對HPA軸的負反饋抑制作用減弱，導致HPA軸功能呈持續亢進狀態。過量的皮質酮是可引起海馬神經元凋亡，導致海馬損傷進一步加劇，最終海馬HPA軸的負反饋機制逐漸減弱乃至消失，HPA軸功能出現紊亂。高水平的GC既是應激性海馬損傷的結果，又是海馬進一步損傷的原因。此外，本研究發現，反映HPA軸活性的指標——血ACTH和皮質酮水平變化不一致，皮質酮升高而ACTH不變，提示PNE成年雌鼠HPA軸的功能確實是紊亂的。

Reynolds[22]認為，宮內循環中高GC與宮內糖脂代謝的編程關系密切。前期研究也證實[9,23]，PNE的IUGR子代出現神經內分泌代謝編程改變與宮內母源性GC過暴露有關，發現出生后4月齡子代仔鼠血糖不變但血脂升高，然而慢性應激可增加血糖而降低血脂，即重現宮內高GC下的糖脂代謝表型變化。隨后的系列研究進一步證實，IUGR仔鼠在成年期呈現更為明顯的糖代謝功能減弱和血脂異常[24]。為了進一步了解IUGR子代生活后期的糖脂代謝功能變化，本研究繼續觀察了經歷出生后早期高營養狀態和成年期慢性應激的10月齡仔鼠的糖脂代謝血表型變化。本研究發現，PNE組HPA軸功能持續亢進的同時，呈現顯性高血糖、高胰島素血癥，并出現IR。同時血脂也是異常的，主要表現為高LDL-C血癥、LDL-C/HDL-C比值增加。PNE成年雌鼠的這種高血糖、高胰島素血癥和血脂紊亂的出現，高度提示MS易感。其發生可能與“HPA軸相關的宮內神經內分泌代謝編程”出現紊亂有關。糖脂代謝紊亂是心血管疾病的重要危險因素。高LDL-C和低HDL-C是缺血發作患者主要的危險因子[25]。大量研究表明，血脂比值對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的早期預防和診斷有較大的臨床價值，采用TCH/HDL-C、LDL-C/HDL-C比值能反映冠狀動脈病變的范圍和程度，且對冠狀動脈粥樣硬化程度的預測價值要優于Lpa和apoB/apoA[26-28]。本研究分析了各血脂比值的改變，發現PNE組成年雌鼠具有更高的LDL-C/HDL-C比值，提示PNE組成年雌鼠心腦血管疾病的患病風險明顯增加。

綜上所述，經歷出生后早期高營養狀態和成年期慢性應激生活事件的PNE10月齡仔鼠呈現高血糖、高胰島素血癥，出現IR；血脂紊亂，血脂比值升高，MS易感，患心腦血管疾病風險明顯增加，其發生機制與HPA軸的宮內神經內分泌代謝編程出現紊亂相關，HPA軸的發育異常加快了MS及代謝性疾病的進程。本研究進一步解析了IUGR個體MS易感的宮內起源機制，為這一特殊群體的宮內預防和生后終生合理干預提供更多的理論及實驗依據，對倡導優生優育和提高IUGR特殊群體的生存質量具有重要現實意義。

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