紫莖澤蘭種群空間遺傳結構研究

楊林秀+陳金龍+王亞婷

摘要：選取云南省境內怒江流域北段作為研究區域，采用SSR分子標記技術，對研究區域內的22個紫莖澤蘭種群的遺傳多樣性和種群遺傳結構進行了實驗分析。實驗從60對SSR引物中篩選出3對多態性引物進行擴增，采用0/1法讀取條帶。3對SSR引物一共擴增出136個條帶，共檢測到38個特異性條帶，每對SSR引物檢測出的多態性條帶平均為12.6。采用GenAlEx 6.2、Structure2.3.3、NTSYS-PC軟件進行分析，得出：22個紫莖澤蘭種群間遺傳多樣性較高，種群水平上的多態位點百分率（P）為71.21% ，Shannon信息指數（I）為0.280，Nei基因多樣性指數（H）為0.176，等位基因數（Na）為1.712，有效等位基因數（Ne）為1.280。通過UPGMA聚類和貝葉斯聚類分析均顯示出三個區域的種群遺傳差異。

關鍵詞：紫莖澤蘭；遺傳結構；怒江；微衛星標記

中圖分類號：S451

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）05000905

1引言

紫莖澤蘭（Ageratina adenophora R.M.King & H.Robinson），英文名Crofton weed，俗稱解放草、霸王草、破壞草等，菊科（Compositae）紫莖澤蘭屬（Ageratina Spach）[《中國植物志》（第76卷第1分冊）中曾置于澤蘭屬（Eupatorium Lin.），學名為Eupatorium coelestinum Lin.]的一種多年生叢生狀亞灌木草本植物（King & Robinson，1970）[1，2]。紫莖澤蘭是一種危害嚴重的世界性惡性雜草[3]，20世紀中期該雜草由中緬邊境傳入我國云南南部，之后迅速擴散至西南及華南地區，并仍以每年幾十公里的速度向內陸蔓延擴散，成為我國最為嚴重的入侵物種之一。

空間遺傳結構決定了種群的適應能力和進化潛力[4]，植物種群生存環境的差異導致了種群的特定空間遺傳結構[5，6]。不同地區溫度、濕度等條件不同，對植物產生的選擇壓力也將不同，這是導致植物遺傳結構隨地區變化的主要原因。由于在怒江流域所采集的紫莖澤蘭種群是沿怒江河谷從南至北的緯度梯度和沿高黎貢山及碧羅雪山從低到高的海拔梯度分布的，不同緯度梯度和不同海拔梯度下環境因素有所差異，不斷地對紫莖澤蘭產生選擇壓力。同時，高黎貢山和碧羅雪山的地理屏障阻礙了兩側山面間種群的擴散，一定程度上阻礙了基因交流。然而，怒江河谷的水流、茶馬古道以及道路的修建等人類活動卻促進了紫莖澤蘭種群間的基因交流，并擴大了種群的擴散范圍。以上這些環境因素和人為干擾都會影響怒江河谷內和高黎貢山及碧羅雪山紫莖澤蘭種群的空間遺傳結構。因此，對于紫莖澤蘭入侵種群遺傳結構的研究有助于了解紫莖澤蘭對環境的適應性以及其傳播途徑和傳播方式，并為紫莖澤蘭的防控提供一定的科學依據。

2材料和方法

2.1材料

紫莖澤蘭于2013年4月采集于怒江河谷（10個種群）以及高黎貢山百花嶺（6個種群）和碧羅雪山知子羅（6個種群），共22個種群。在野外，沿著怒江河谷和河谷東西兩座山（高黎貢山、碧羅雪山）不同海拔梯度采樣。河谷內按縣區域大小每個縣設置1～2個采樣點，海拔每間隔100～200 m為一個采樣點，每個采樣點設為一個種群，每個種群取24個個體單株間相距約50 m，將整株紫莖澤蘭連根拔起，剪掉植株上部的莖葉，并盡量保留根部土壤，編號單株保存，同時每個對應的植株采集5～10片新葉，密封后用變色硅膠干燥處理，根部帶回來后迅速轉移到溫室中及時進行定植。采樣時利用GPS定位系統定位，同時記錄每一個采樣點的經緯度、海拔、生境以及分布情況。

將上述22個種群的紫莖澤蘭硅膠干燥樣作為預實驗材料，根莖在溫室中建立實驗種群，每個盆種植一個植株，定期澆水，待萌發出新葉即可采集提取DNA。

2.2方法

本研究采用改進的CTAB法（參照Doyle（1987）[7]CTAB法）提取紫莖澤蘭DNA，用瓊脂糖凝膠電泳對所有樣品的基因組DNA進行檢測。紫莖澤蘭SSR-PCR選擇性擴增采用20 μL的反應體系：dNTP（0.2 mM）1.6 μL，MgCl2 1.6 μL，10×Buffer 2 μL，引物1和引物2（10 μM）各為0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5.0 U/μL ）0.1 μL，DNA 模板（60 ng/μL ）1 μL，ddH2O 12.7 μL。單個位點的反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，共35個循環后72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。擴增結束，進行PAGE（聚丙烯酰胺）凝膠電泳檢測，凝膠成像，然后通過0/1法讀取聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測結果。

2.3數據分析

在特定的SSR位點上，測定每一供試樣品的等位基因組成，電泳資料采用0/1二維數據矩陣的方法錄入電腦，有帶記錄為1，無帶記為0。

利用GenAlEx 6.2軟件獲取評價種群遺傳多樣性的參數，包括多態性位點百分率（P%）、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、期望雜合度（h）、觀測雜合度（uh）、Neis 基因多樣性指數（H）、Shannons 信息指數（I）及反映種群遺傳結構指標，包括種群間分化系數（Fst）、基因流（Nm）、Neis 標準遺傳距離（GD）和遺傳一致度（GI）。用Wright統計量（ Fst，雜合性基因多樣度比率） 基因分化系數（Gst）來間接測量基因流，估算種群群間的遺傳分化。利用GenAlEx 6.2軟件分子方差分析（AMOVA）估測遺傳變異在種群間和種群內的分布及種群遺傳分化顯著性檢驗，進行遺傳距離與地理距離的相關性分析，以檢驗種群間遺傳距離和地理距離的相關性。用Structure2.3.3進行類別推斷和模型聚類分析，NTSYS-PC進行種群間的聚類分析。

3結果與分析

3.1紫莖澤蘭種群間遺傳多樣性

利用3對SSR引物（表1）對紫莖澤蘭分布于怒江河谷、高黎貢山和碧羅雪山的22個種群、480個個體進行分析。不同引物擴增出來的條帶特異性差異大，所有引物一共擴增出136個條帶，每對引物平均擴增出45.3條多態性帶。不同區域種群多態性帶的檢出率分別為，高黎貢山百花嶺44.44%、碧羅雪山知子羅100.00%、怒江河谷70.00%，總體平均為71.21%。

Wright（1931，1969）提出的基因流（Nm）與種群間的固定指數Fst之間存在下列關系Nm=（1-Fst）/4Fst，Nm是種群每代的遷移數。因此可以根據Fst來測定基因流。也有人用基因分化系數Gst來代替Fst計算Nm。Wright（1931）[8]認為，當Nm>1時，基因流可以防止由遺傳漂變引起的種群間遺傳分化。因此，往往當Nm值升高時，Gst降低。利用GenAlEx 6.2軟件統計分析，發現物種水平上紫莖澤蘭總遺傳多樣性為0.280（Hsp），種群內的遺傳多樣性分別為0.155（高黎貢山）、0.474（碧羅雪山）、0.239（怒江河谷）（Hpop）。

紫莖澤蘭22個種群的AMOVA分析結果表明，種群間基因分化系數Gst為0.21，即種群間的遺傳變異占總變異的21%，而總變異中有71%的變異存在于種群內。不同區域之間的遺傳變異占8%。種群間和種群內的變異均較為明顯（P<0.05）。其中，高黎貢山百花嶺6個紫莖澤蘭種群的AMOVA分析結果表明，種群間基因分化系數Gst為0.15，即種群間的遺傳變異占總變異的15%，而總變異中有85%的變異存在于種群內。種群間和種群內的變異均較為明顯（P<0.05）。碧羅雪山知子羅6個紫莖澤蘭種群的AMOVA分析結果表明，種群間基因分化系數Gst為0.37，即總變異中有63%的變異存在于種群內，種群間的遺傳變異占總變異的37%，種群間和種群內的變異均較為明顯（P<0.05）。怒江河谷10個紫莖澤蘭種群的AMOVA分析結果表明，種群間基因分化系數Gst為0.04，即總變異中有96%的變異存在于種群內，種群間的遺傳變異占總變異的4%，種群內的變異較為明顯（P<0.01）。

通過以上的AMOVA分析，發現紫莖澤蘭22個種群間的遺傳結構，在海拔梯度間種群遺傳分化明顯，在怒江河谷下部沿江兩岸種群間遺傳分化不明顯。河谷空間對紫莖澤蘭遺傳結構有顯著的影響。

3.2種群空間遺傳結構

通過GenAlex6.2軟件的分析，按照Nei（1972）[9]的方法計算出紫莖澤蘭種群間的遺傳距離和遺傳相似度。結果顯示，22個紫莖澤蘭種群間的遺傳相似度在0.456～1.000 范圍間，其中種群Bhl1與Bhl2，種群Bhl1、Bhl2與種群Bhl5、Bhl6、Mk、Cj、Lw之間的遺傳相似度最高（均為1.000），種群之間遺傳距離最近。種群Zzl2與Bhl6（0.464）、Mk、Cj、Lw（均為0.456）之間遺傳相似度最低，種群Zzl2與種群Bhl6、Mk、Cj、Lw之間遺傳距離最遠。利用GenAlEx6.5軟件對22個紫莖澤蘭種群間遺傳距離與地理距離作相關性分析（圖1），結果顯示，隨著海拔梯度變化，對于高黎貢山6個種群（Bhl1-Bhl6）種群遺傳距離與地理距離間相關性不明顯；碧羅雪山5個種群（Zzl1-Zzl5）間的遺傳距離與地理距離相關性呈先增后減的趨勢；怒江河谷的10個種群遺傳距離與地理距離間相關性不明顯。

利用GenAlex6.2軟件對紫莖澤蘭22個種群進行種群間的PCA分析，結果見圖2，圖中兩點之間的距離越近，說明兩個種群之間的遺傳距離越近。從結果中可以明顯看出，22個種群之間有明顯的分化。除碧羅雪山知子羅的4個種群（Zzl1，Zzl2，Zzl4，Zzl6）外，其他18個種群集中聚集，即遺傳距離較近。PCA分析中，第一軸的貢獻率為95.46%，第二軸的貢獻率為3.91%。

基于遺傳距離系數的UPGMA聚類圖見圖3，來自相似或相鄰生境的紫莖澤蘭種群在聚類分析時大多聚集在同一個聚類群或相鄰的聚類群中。從聚類圖的聯結上可以看出，22個紫莖澤蘭種群基本上可分為兩大亞群5個聚類群。UPGMA聚類圖的上半部分為第一大亞群（包含第1～4聚類群），第1個聚類群包括高黎貢山百花嶺的4個種群（Bhl1、Bhl2、Bhl5、Bhl6）和怒江河谷的3個種群芒寬、漕澗、老窩（Mk、Cj、Lw）；第2個聚類群為貢山的2個種群（Gs1、Gs2），福貢1個種群（Fg1），瀘水（Ls）以及百花嶺（Bhl3）和知子羅（Zzl3）各1個種群；第3個聚類群為百花嶺1個種群（Bhl4），怒江河谷的3個種群福貢、六庫和瀾滄（Fg2、Lk、Lc）；第4個聚類群為知子羅的2個種群（Zzl1、Zzl4）。第二大亞群，即第6個聚類群包括的種群為知子羅的2個種群（Zzl2、Zzl6）。

利用Structure程序對22個紫莖澤蘭種群的480個個體進行類別數的推斷，根據不同分組評價標準所決定的22個種群的貝葉斯聚類分析結果顯示，22個種群的最優分組為 ：即以ΔK值為評定標準，當K=4時，ΔK的值為顯著的最大值（ΔK=19.80613）。

Structure分組結果等于4，相應的聚類圖如圖5和圖6，結果顯示22個紫莖澤蘭種群間存在明顯的分化，

兩個海拔梯度種群：碧落雪山知子羅和高黎貢山百花嶺種群間具有顯著相關性，種群主要聚成三種聚類，怒江沿江種群和兩個海拔梯度種群具有顯著差異，含有兩個海拔梯度都沒有的黃色聚類，而Cj、Lw、Lc是瀾滄江經分水嶺進入怒江河谷的，與怒江河谷沿江種群有很大區別，但也存在一定的聯系。

4討論

4.1紫莖澤蘭遺傳分化水平

SSR標記具有多態性高、共顯性、重復性好等優點，能夠檢測到較多的等位基因，是一種有效的植物種群遺傳多樣性研究分子標記。本研究基于SSR分子遺傳標記技術，利用3對SSR引物對怒江地區22個紫莖澤蘭種群進行遺傳多樣性檢測，研究結果顯示：所有引物一共擴增出136個條帶，每對引物平均檢測到45.3個多態位點，種群水平上的多態位點百分率（%P）為71.21% ，Shannon信息指數（I）為0.280，Nei基因多樣性指數（h）為0.176，即22個紫莖澤蘭種群間的遺傳多樣性高。種群內的遺傳多樣性，高黎貢山百花嶺為0.155，碧羅雪山知子羅為0.474，怒江河谷為0.239，其中百花嶺的種群Bhl4和知子羅的3個種群Zzl1、Zzl2、Zzl3種群內的遺傳多樣性較高。

種群內和種群間遺傳變異的分布格局即遺傳分化。利用AMOVA分析得到高黎貢山百花嶺、碧羅雪山知子羅和怒江河谷的紫莖澤蘭存在于種群間的遺傳變異分別為15%、37%和4%。對應地，存在于種群內的遺傳變異分別為85%、63%和96%，即紫莖澤蘭的遺傳變異主要存在于種群內，但種群間也出現了一定的遺傳分化，分化系數（Gst）分別為0.15、0.37、0.04，據Wright（1978）得出三個地區紫莖澤蘭種群的分化程度，碧羅雪山知子羅的紫莖澤蘭種群遺傳分化程度極大（Gst>0.25），高黎貢山百花嶺的紫莖澤蘭種群間存在一定程度的分化（Gst=0.15），而怒江河谷的紫莖澤蘭種群遺傳分化不是很明顯（Gst<0.05）。

紫莖澤蘭種群的AMOVA分析表明，在海拔梯度間種群遺傳分化明顯，在怒江河谷下部沿江兩岸種群間遺傳分化不明顯。河谷空間對紫莖澤蘭遺傳結構有顯著的影響。相應地，三個地區（高黎貢山百花嶺、碧羅雪山知子羅、怒江河谷）的基因流（Nm）分別為1.417、0.426、6.000，由此看出高黎貢山百花嶺和怒江河谷的基因流（Nm）大于1，據Wright（1951），基因流（Nm）大于1的情況下，基因流主要發揮均質化作用，從其他種群流入的基因阻止種群間的局部分化（王崇云，2008），所以高黎貢山百花嶺紫莖澤蘭種群的遺傳分化程度較低，怒江河谷紫莖澤蘭種群的遺傳分化不明顯。高黎貢山百花嶺紫莖澤蘭種群間的基因流如前面所述，可能是由于旅游業的發展導致。怒江河谷紫莖澤蘭種群間的基因流很可能是由于S228省道沿途的人為干擾，以及怒江水流對紫莖澤蘭種子及繁殖體的傳播，增加了種群間的雜交，頻繁的基因流，均質化作用明顯使得種群間的遺傳分化程度低，其結論與AMOVA分析一致。碧羅雪山知子羅紫莖澤蘭種群，其基因流（Nm）為0.426，小于1，種群遺傳分化程度高，原因可能是1986年在州政府搬遷后知子羅被邊緣化，交通要塞地位不復存在，人為干擾作用因此降低。

4.2紫莖澤蘭種群空間遺傳結構

4.2.1基于遺傳距離指數的UPGMA聚類分析

遺傳距離是研究植物種群遺傳多樣性的基礎，反映了植物群體的系統進化，基于遺傳距離構建的聚類圖被廣泛用來描述植物群體遺傳結構的差異（屠云潔等，2006）。22個紫莖澤蘭種群基本上可分為兩大亞群5個聚類群。UPGMA聚類圖的上半部分為第一大亞群（包含第1～4聚類群），第1個聚類群包括高黎貢山百花嶺的4個種群（Bhl1、Bhl2、Bhl5、Bhl6）和怒江河谷的3個種群芒寬、漕澗、老窩（Mk、Cj、Lw）；第2個聚類群為貢山的2個種群（Gs1、Gs2），福貢1個種群（Fg1），瀘水（Ls）以及百花嶺（Bhl3）和知子羅（Zzl3）各1個種群；第3個聚類群為百花嶺1個種群（Bhl4），怒江河谷的3個種群福貢、六庫和瀾滄（Fg2、Lk、Lc）；第4個聚類群為知子羅的2個種群（Zzl1、Zzl4）。第二大亞群，即第5個聚類群包括的種群為知子羅的2個種群（Zzl2、Zzl6）。對比紫莖澤蘭UPGMA聚類圖與PCA分析圖發現，UPGMA聚類圖上的第一大亞群的前3個聚類群在PCA分析圖（圖2）上也是距離最近的，第一大亞群的第4聚類群和第二大亞群在PCA分析圖與其他種群距離較遠，即兩者結論相一致。

4.2.2基于Structure程序的類別推斷和模型聚類分析

Structure模型聚類結論與UPGMA聚類基本一致，最終將紫莖澤蘭的22個種群480個個體劃分為4個類別，怒江河谷的Gs2種群和下游種群（Mk、Cj、Lw）以及碧羅雪山知子羅的Zzl3和Zzl5種群中明顯可以看出有高黎貢山百花嶺個體的存在，而高黎貢山百花嶺的中海拔處的種群（Bhl3、Bhl4）中有碧羅雪山知子羅低海拔（Zzl1、Zzl2）和高海拔（Zzl5、Zzl6）個體的存在。22個紫莖澤蘭種群間存在明顯的分化：高黎貢山百花嶺和怒江河谷紫莖澤蘭的種群遺傳分化程度低于碧落雪上知子羅。怒江沿江種群和上下都不相同，Cj、Lw、Lc是瀾滄江經分水嶺進入怒江河谷的，和怒江河谷沿江種群有很大區別，但有聯系。這里可以大致推測，怒江河谷的入侵過程，與瀾滄江種群有關，和百花嶺不太相關。因此百花嶺的種群可能是早先馬幫帶去的。

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