UPLC—Q—TOF—MS分析茜草炒炭前后的化學成分變化

陳毅+單鳴秋+王海麗+薛露+張麗+丁安偉

[摘要]為了探究茜草炒炭對化學成分的影響，利用超高效液相串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）分析茜草和茜草炭的成分，比較炒炭前后化學成分的變化，并運用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘判別法（OPLS-DA）進行數據統計，尋找茜草炒炭前后的主要差異成分，同時依據一級質譜精確質荷比和二級質譜碎片信息進行結構解析。結果表明：茜草炒炭前后有6種差異較大的成分，根據其在生品和炭品中的峰面積值，選擇其中的3種成分作為主要差異成分，并鑒定為光澤汀、異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌，且炒炭后異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌含量顯著增加，光澤汀含量明顯減少，可作為化學標記物區分生品和炭品。該實驗的研究成果對于揭示茜草炒炭的炮制機制具有重要意義，也為茜草炭藥效物質基礎的闡明提供了重要依據。

[關鍵詞] 茜草； 茜草炭； UPLC-Q-TOF-MS； PCA； OPLS-DA

[Abstract] In order to explore the effect on chemical constituents after carbonized， the changes of chemical constituents in raw and carbonized Rubiae Radix et Rhizoma were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS. The research also used principal component analysis（PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA） for data statistics to find out the main differences on components before and after carbonized. The accurate m/z values of Q-TOF-MS and Q-TOF-MS-MS fragments were applied to identify the structures. The results showed that 6 more discrepant constituents were existed between raw and carbonized Rubiae Radix et Rhizoma. Three constituents were selected as the main discrepant components according to the peak area （276 nm） and identified， as lucidin， xanthopurpurin and 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone. After carbonized， contents of xanthopurpurin and 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone were observably increasing， while lucidin was obviously decreasing. They could be used as the chemical markers for the differentiation between raw and carbonized Rubiae Radix et Rhizoma. The results of this experiment played an important role in the study of processing principle of carbonized Rubiae Radix et Rhizoma. It also provided important evidences for the interpretation of effective material based on carbonized Rubiae Radix et Rhizoma.

[Key words] Rubiae Radix et Rhizoma； carbonized Rubiae Radix et Rhizoma； UPLC-Q-TOF-MS； PCA； OPLS-DA

中藥茜草為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖，味苦，性寒，歸肝經，具有涼血、祛瘀、止血、通經的功效，臨床上常用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經閉、關節痹痛、跌撲腫痛^[1]。國內外對茜草的化學研究表明，茜草中主要含有蒽醌及其苷類、萘醌及其苷類，此外還含有環己肽類、多糖類、萜類等其他化學成分^[2]?，F代藥理研究發現，茜草具有抗腫瘤、升高白細胞及免疫調節、護肝、抗炎抗風濕、抗氧化、止血等作用^[3]。

茜草炭是由中藥茜草經炒炭炮制而成，是中醫臨床常用化瘀止血藥。余旭東等^[4]比較了茜草與茜草炭飲片在抗炎、鎮痛、活血化瘀、止血等方面藥理作用的強弱，研究發現茜草炒炭后，抗炎、鎮痛、活血化瘀等藥理作用減弱，但止血作用增強。炒炭前后藥理作用的變化必然由化學成分的變化引起。張振凌等^[5]對茜草飲片炒炭前后化學成分的變化進行了研究，發現茜草在炒炭后大葉茜草素等化學成分減少的同時也有成分含量增加，提取分離鑒定為1，3-二羥基蒽醌（異茜草素）且有止血作用。單鳴秋等^[6]利用UPLC對茜草炒炭前后1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的含量進行了測定，研究發現炒炭后1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的含量顯著升高，為茜草炭的主要成分。但上述所研究均只針對單個成分在茜草炒炭前后發生的變化，不夠全面，UPLC-Q-TOF-MS是近年來發展起來的具有高效分離和定性檢測綜合能力的分析方法，在中藥化學成分分析等研究中已得到較多應用^[7]。鑒于此，本研究擬采用該技術分析茜草炒炭前后化學成分的變化，并結合MarkerLynx XS軟件進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），以期探討茜草炒炭前后化學成分的差異。

1 材料

1.1 儀器 ACQUITY^TMUPLC系統-PDA檢測器（Waters公司）；Synapt^TMQ-TOF質譜儀（Waters公司），配有Lock-spray接口，電噴霧離子源（ESI），MassLynx V4.1質譜工作站軟件（Waters公司）；高速萬能粉粹機（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-S恒溫水浴鍋（江蘇國勝實驗儀器廠）；KH-500B型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；HANGPING FA1104N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司，d=0.1 mg）；MS 105DU型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司，d=0.01 mg）；Milli-Q Direct 8超純水儀（美國Millipore公司）；TGL-16B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥 95%乙醇（化學純，南京化學試劑股份有限公司）；甲醇（色譜純，Q/320801GHB005，江蘇漢邦科技有限公司）；甲酸、甲醇（質譜純，美國MERCK公司）；超純水（Milli-Q Direct 8超純水）；茜草素、甲基異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、1-羥基-2-甲基蒽醌均為本實驗室自制，經HPLC檢測純度≥ 98%；羥基茜草素（南京森貝伽生物科技有限公司，純度≥98%）；大葉茜草素（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%，批號110884-200604）；茜草購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定為茜草科植物茜草R. cordifolia的干燥根和根莖，按2015年版《中國藥典》（一部） 有關要求炒制成茜草炭。

2 方法

2.1 色譜條件 Acquity BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃；流速0.2 mL·min^-1；DAD掃描190～400 nm，經選擇在276 nm下進行測定；進樣量2 μL；流動相A相為0.3%甲酸-水，流動相B相為甲醇；梯度洗脫（表1）。

2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），正、負離子模式掃描；相對分子質量掃描范圍m/z 100～1 000；離子源溫度110 ℃，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速（N₂） 400 L·h^-1，錐孔電壓30 V，毛細管電壓3 kV。

2.3 供試品溶液的配制 稱取茜草粉末（過2號篩）4.0 g，置100 mL錐形瓶中，加入40 mL 95%乙醇，水浴加熱回流提取5次，每次2 h，濾液合并至蒸發皿中，水浴加熱揮干溶劑，得醇提液浸膏；醇提后的藥渣晾干后再加入40 mL水，水浴加熱回流提取3次，每次2 h，濾液合并至蒸發皿中，水浴加熱揮干溶劑，得醇提后水提液浸膏；將上述2種浸膏合并，用80%甲醇溶解置50 mL量瓶，加80%甲醇至刻度，搖勻，高速離心10 min（15 000 r·min^-1），上清液過0.22 μm微孔濾膜，取濾液作為供試品溶液。同法制得茜草炭供試品溶液。

2.4 對照品溶液的配制 精密稱取大葉茜草素、羥基茜草素、茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、甲基異茜草素、1-羥基-2-甲基蒽醌各1 mg，分別置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液0.3 mL置2 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.5 數據分析 在質譜正、負離子模式下，為保證統計結果的可靠性和重要性，生品和炭品分別連續進6針?；贛arkerLynx XS軟件分析茜草生品及其炭品的液質數據，利用PCA和OPLS-DA法進行處理，找出生品和炭品的主要差異成分，經分析得到化學標記物。

3 結果與討論

3.1 PCA分析 正、負離子模式下MarkerLynx XS分析的Scores圖（圖1，2）清晰地展示了茜草生品與炭品在X軸和Y軸方向的差別。生品組分布在2，3象限，炭品組分布在1，4象限，2組沒有任何交叉，說明經過炒炭后生品和炭品在化學成分上產生了明顯的變化。產生變化的成分在UPLC-Q-TOF-MS數據采集過程中，被以分子離子峰的形式記錄下來，通過MarkerLynx XS分析生成Loadings圖（圖3，4），圖中離原點最遠、分散在四周的點代表了茜草生品和炭品之間的差異成分，離原點越遠說明該化合物在2組之間的差異越大，對Scores圖的貢獻越大。

3.2 OPLS-DA分析 基于MarkerLynx XS軟件，在正、負離子模式下將茜草生品與炭品中的化學成分峰信息進行OPLS-DA分析得到散點圖（圖5，6）。圖中每個點代表一個變量，即位于某個保留時間的某個質荷比的信號。橫坐標代表變量的貢獻度（協方差）；縱坐標代表變量的相關性（可信度），在-1～1取值。茜草生品與炭品之間差異顯著的分子離子峰分布在S曲線的兩端，S曲線的右上角代表了正、負離子模式下茜草炭品與茜草生品相比含量較高的化合物的分子離子峰，S曲線的左下角代表了正、負離子模式下茜草生品與茜草炭品相比含量較高的化合物的分子離子峰。越靠近S曲線兩端的點，所代表的分子離子峰對兩組樣品間的差異貢獻越大。根據不確定性值以及對樣品差異的貢獻度和可信度，從散點圖中篩選出不確定性小的、對樣品差異貢獻度大且可信度高的特征標記物（表2，3）。

3.3 茜草生品與炭品主要差異成分的鑒定 通過對比2組樣品UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖，并結合正、負離子模式下偏最小二乘法從2組樣品數據分析散點圖中獲得的差異較大數據，可尋找茜草生品和炭品間的差異性成分。本實驗發現茜草炒炭前后有6種差異較大的成分。

將茜草生品和炭品的UPLC圖進行比較（圖7），在276 nm檢測波長下，6種差異成分在生品和炭品中的峰面積值（表4）。

從表4中可以看出，與點d、點e和點f相比，點a、點b和點c所對應的3種差異成分在茜草生品和炭品中的峰面積值較低，響應較小，不適合作為特征性成分來區分生品和炭品，因此將點d、點e和點f所對應的3種差異成分作為茜草炒炭前后的主要差異成分。

根據茜草生品和炭品總離子流圖（圖8，9），通過分析這3種主要差異成分的一級質譜準分子離子和二級質譜碎片離子（圖10～12），依據其裂解規律，對其進行結構解析，并與對照品或文獻數據比對，鑒定出這3種主要差異成分（表5）。

茜草含有大量的蒽醌類化合物，在其電噴霧質譜選擇性離子碰撞誘導解離（CID）中，失去母核基團中的CO是其主要裂解方式；另外，側鏈基團也是較活躍的裂解部位，側鏈取代基（主要為-OH，-CH₃，-OCH₃，-COOH等）容易以O，H₂O，CH₃，CH₂，CO₂等中性小分（原）子片斷的形式離去^[11]。因此，依據該類化合物的質譜裂解規律，可推測其二級質譜碎片離子的歸屬，從而推斷該化合物的結構。

峰4和峰6的一級及二級質譜基本相同，僅保留時間不一致，推測可能是由于側鏈取代基不同而導致兩者的極性產生差異，推斷兩者為同分異構體。對峰6的二級質譜碎片離子（圖12）進行歸屬：m/z 271為少量未被打碎的一級質譜準分子離子峰[M+H]⁺，m/z 215是準分子離子失去2個CO后的碎片[M+H-2CO]⁺，m/z 187為m/z 215再失去1個CO后的碎片[M+H-3CO]⁺，m/z 159是m/z 187又失去1個CO后的碎片[M+H-4CO]⁺，m/z 131為m/z 159再失去1個CO后的碎片[M+H-5CO]⁺，m/z 115是m/z 131又再失去1個-CH₃和1個H后的碎片[M+H-5CO-H-CH₃]⁺；通過與對照品比對，推斷峰6為1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌。峰4的二級質譜碎片離子與峰6一致，通過比較茜草化學成分中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的同分異構體的結構及參考文獻數據^[8]，推斷峰4為光澤?。?，3-二羥基-2羥甲基蒽醌）。

對峰5的二級質譜碎片離子（圖11）進行歸屬：m/z 241為少量未被打碎的一級質譜準分子離子峰[M+H]⁺，m/z 199是準分子離子失去1個CO、1個-CH及1個H后的碎片[M+H-CH-H-CO]⁺，m/z 171為m/z 199再失去1個CO后的碎片[M+H-CH-H-2CO]⁺，m/z 143是m/z 171又失去1個CO后的碎片[M+H-CH-H-3CO]⁺，m/z 139為準分子離子失去3個CO和1分子H₂O后的碎片[M+H-3CO-H₂O]⁺，m/z 115是m/z 143再失去1個CO后的碎片[M+H-CH-H-4CO]⁺；通過與文獻數據^[9-10]比對，推斷峰5為異茜草素（1，3-二羥基蒽醌）。

4 討論

為了更直觀地反映出主要差異成分在茜草生品與炭品間的量變趨勢及幅度，作者將鑒定出的3種主要差異成分在茜草炭中的峰面積與茜草生品中峰面積的比值作為量化指標，并結合OPLS-DA分析出的主要差異成分在茜草生品與炭品間的變化因子，從而更好地說明3種主要差異成分在炒炭前后的含量變化情況。

光澤汀在茜草炭品與生品中的峰面積比值為0.32，變化因子為1.6，表明該成分在炒炭后含量明顯降低，推測可能是在加熱炒炭過程中部分發生了碳碳雙鍵、碳氧雙鍵的斷裂或取代基的游離^[8]。光澤汀具有一定的抗菌作用^[2]，但至于該活性是否與茜草炒炭前后藥理作用的變化存在某種關聯，還需要通過進一步研究來發現。

異茜草素在茜草炭品與生品中的峰面積比值為14.93，變化因子為16.7，說明該成分在炒炭后含量顯著升高。關于異茜草素含量增加的具體原因，還未見有文獻報道，推測可能是有其他蒽醌類成分在加熱炒炭過程中化學結構發生改變，轉化成異茜草素?，F代藥理研究表明，異茜草素確有明顯的止血作用^[5]，并且該成分在炒炭后含量升高顯著，這與茜草炭的止血作用增強^[4]相吻合，可作為茜草炭止血的有效成分，為本課題對茜草炭化瘀止血效應物質基礎的研究提供依據。

1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌在茜草炭品與生品中的峰面積比值為14.31，變化因子為12.2，表明該成分在炒炭后含量顯著增加。對于1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌在炒炭前后所發生的含量變化，作者查閱了茜草化學成分的相關文獻，發現茜草生品中含有較多的以1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌為苷元的糖苷，如1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷^[12]、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-新橙皮糖苷^[13]、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷^[14]等。在加熱炒炭過程中，上述糖苷的苷鍵可能發生斷裂釋放出苷元，從而使得茜草炭品中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的含量明顯高于生品。至于該成分的增加是否會對茜草炭的化瘀止血作用產生影響，目前尚不清楚，還有待于本課題后續對茜草炭藥效物質基礎的進一步研究。

5 結論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術對茜草生品和炭品的化學成分進行分析，用MarkerLynx XS軟件進行PCA分析和OPLS-DA分析，發現茜草炒炭前后有6種差異較大的成分，根據其在生品和炭品中的峰面積值，選擇其中的3種成分作為主要差異成分。依據化合物質譜裂解規律對這3種主要差異成分進行結構解析，并與對照品或文獻數據比對，鑒定為光澤汀、異茜草素和1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌。與茜草生品相比，茜草炭中異茜草素和1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌含量顯著增加，光澤汀含量明顯減少，作者認為可作為化學標記物區分茜草生品和炭品。

本研究應用UPLC-Q-TOF-MS技術和多元統計學方法研究炒炭對茜草化學成分的影響，該方法能夠直觀準確地反映茜草炒炭前后化學成分的變化情況，從整體上彌補了HPLC和UPLC分析的不足，對進一步研究茜草炒炭炮制機制具有重要意義，同時也為本課題對茜草炭藥效物質基礎的闡明提供了重要依據。

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[責任編輯 丁廣治]