菊苣提取物對高尿酸血癥大鼠腎臟果糖轉運體9表達的影響

王雨+林志健+聶安政+李麗玉+張冰

[摘要]該研究給予雄性SD大鼠10%果糖飲水建立高尿酸血癥模型，將其分為正常組、模型組、苯溴馬隆組（20 mg·kg^-1·d^-1）、菊苣提取物高、中、低劑量組（5，7.5，10 g·kg^-1·d^-1），連續42 d。分別測定血尿酸、血肌酐、尿素氮、尿尿酸，計算腎臟尿酸清除率；免疫組化法、逆轉錄實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法分別檢測果糖轉運體9（glucose transporter family member 9，Glut9）在大鼠腎臟的蛋白及基因的表達水平。探討中藥菊苣提取物降尿酸作用及對腎臟Glut9表達的影響。結果顯示菊苣提取物能降低高尿酸血癥大鼠血尿酸水平，增加腎臟尿酸清除率，降低腎臟Glut9的蛋白表達，抑制腎臟尿酸重吸收，從而促進腎臟尿酸排泄。

[關鍵詞] 菊苣； 高尿酸血癥； 果糖； 腎臟轉運蛋白； Glut9

[Abstract] Sixty SD male rats were randomly divided into normal group， model group， benzbromarone group（20 mg·kg^-1·d^-1）， chicory extract high dose， middle dose and low dose groups （5， 7.5， 10 g·kg^-1·d^-1）. The rats in normal group were given with water， and the rats in other groups were given with 10% fructose solution to establish hyperuricemia models. All the rats were sacrificed on the 42th day. Then their serum uric acid（SUA）， serum creatinine（CRE）， urea nitrogen（BUN） and urinary uric acid（UUA） levels were detected to calculate the clearance rate of uric acid in kidney（CUA）. Meanwhile， the protein and gene expression levels of renal glucose transporter family member 9（Glut9） were detected by immunohistochemical and Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-qPCR） methods. The effects of Chinese herb chicory extract on expression of renal Glut9 and decreasing uric acid were explored in this study， and the results showed that chicory extract could reduce SUA level in rats with hyperuricemia， increase renal CUA， decrease the protein expression of renal Glut9， inhibit uric acid re-absorption in kidney， and thus promote renal uric acid excretion.

[Key words] chicory； hyperuricemia； fructose； renal transporter； Glut9

中藥菊苣為菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根，可清肝利膽，健胃消食，利尿消腫^[1]。高尿酸血癥是血尿酸水平在體內持續性升高或血尿酸鹽過飽和的一種病理狀態，高尿酸血癥不僅是痛風發生的主要病因，還是糖尿病、高血壓、心血管疾病及代謝綜合征的獨立危險因素^[2-3]。本課題組長期從事菊苣防治高尿酸血癥的研究，發現菊苣可穩定降低血尿酸水平，并從尿酸生成途徑對其藥效機制進行了探討^[4-5]。尿酸生成過多與排泄障礙均會升高血尿酸水平，機體內66%尿酸由腎臟排泄，33%尿酸由腸道排泄。研究顯示90%的高尿酸血癥是由于腎臟對尿酸的重吸收增加和（或）分泌減少所致^[6]，腎臟中存在多種與尿酸相關的轉運體，如果糖轉運體Glut9（glucose transporter family member 9），有機陰離子轉運體OAT1，OAT3（organic anion transporter 1，organic anion transporter 3）等，這些轉運體通過影響腎小管對尿酸的重吸收或排泄從而改變腎臟的尿酸排泄。其中果糖轉運體Glut9由SLC2A9編碼，其基因多態性與尿酸生成及尿酸鹽腎臟重吸收密切相關，全基因組學關聯研究亦指出其與血尿酸水平變化相關^[7]。本研究從尿酸的腎臟排泄角度，切入腎臟轉運蛋白Glut9，探討中藥菊苣降尿酸的藥效機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠60只，體重（240±10） g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，動物合格證號SCXK（京）2011-0004。

1.2 藥物及試劑 菊苣根購于新疆市場，由北京中醫藥大學中藥學院黃建梅教授鑒定為菊苣Cichorii Herba。本課題組提取分離得菊苣地下部分水提取物（以下簡稱菊苣提取物）：菊苣藥材粉碎浸泡，10倍水回流提取1 h后收集濾液，再8倍水回流提取1 h，合并濾液后濃縮。苯溴馬隆片（德國赫曼大藥廠，批號1208106）；D-果糖（美國AMRESCO公司，批號3573C350）；尿酸（serum uric acid，SUA）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號151221）；肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（ureanitrogen，BUN）檢測試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所，批號20151218，20151230；Trizol（美國Ambion公司，批號94302）；氯仿、異丙醇等分析純試劑均購于北京化工廠；6×RNA loading buffe，Glodview核酸染料，均購于博邁德生物科技有限公司，批號705685BB，705972BE；水合氯醛、瓊脂糖（北京拜爾迪有限公司）；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國賽默飛公司，批號00270373；Universal SYBR Green Supermix（美國Bio-Rad公司，批號730003407）；Anti-GLUT9 polyclonal antibody（美國Millipore公司，批號Q2361577）；兔超敏二步免疫組化試劑PV-9001，DAB顯色試劑盒，抗體稀釋液，均購于北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K156617G，K165214C，16175A01。

1.3 儀器 Sunrise酶標儀（瑞士Teacan公司）；低溫高速離心機（德國Sigma）；恒溫水浴箱（北京醫療設備廠）；Quawell UV-Vis Spectrotometer Q5000（北京五洲東方科技發展有限公司）；CFX96 PCR儀（美國Bio-Rad公司）；FluorChem凝膠成像系統（香港安萊公司）；石蠟組織切片機（美國AO公司）；BX53顯微鏡，DP72CCD相機（日本奧林巴斯）；Imagine Pro-Plus 6.0圖像分析軟件。

2 方法

2.1 動物分組及處理 SD大鼠適應性飼養5 d后，按體重隨機分為正常組、模型組、苯溴馬隆組、菊苣提取物高、中、低劑量組，每組10只。正常組給予清水，其余各組給予10%果糖飲水造模。正常組與模型組給予清水灌胃，苯溴馬隆組給予20 mg·kg^-1苯溴馬隆灌胃，菊苣提取物高、中、低劑量組分別給予相應的菊苣提取物灌胃（相當于生藥量10，7.5，5 g·kg^-1·d^-1）。

2.2 相關指標檢測 動物取血前禁食不禁水12 h，并稱量體重，分別于實驗的第10，20，30，40天尾尖取血，3 000 r·min^-1離心10 min，分離血清，檢測血清尿酸（serum uric acid，SUA）、血清肌酐（creatinine，CRE）、血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）。實驗第40天，將動物放進代謝籠，禁食不禁水，收集24 h尿液，檢測尿尿酸（urine uric acid，UUA）。計算尿酸清除率（CUA），CUA=UUA/SUA×每分鐘尿量（mL·min^-1）。實驗第42天，10%水合氯醛麻醉，處死動物取材。部分腎臟以4%多聚甲醛固定，用于制作組織石蠟切片，部分腎臟立即于-80 ℃保存，用于提取腎臟總mRNA。

2.3 免疫組化染色 4 μm組織石蠟切片60 ℃烤片1 h，常規脫蠟復水，PBS孵育3×5 min；0.01 mol·L^-1檸檬酸鈉緩沖溶液水浴熱修復30 min后冷卻至室溫，PBS孵育3×5 min；滴加3%H₂O₂，避光濕溫孵育15 min，PBS孵育3×5 min；滴加一抗（1∶1 000稀釋），濕盒內4 ℃孵育過夜；37 ℃復溫孵育1 h，PBS孵育3×5 min；滴加PV-9001聚合物輔助劑，37 ℃濕溫孵育1 h，PBS清洗3×5 min；滴加PV-9001辣根酶標記抗兔IgG聚合物，37 ℃濕溫孵育1 h，PBS清洗3×5 min；滴加新鮮配制DAB工作液，顯微鏡下觀察，棕色顆粒染色后PBS清洗3×5 min；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性光學樹脂封固，封片。

2.4 圖像采集與分析 顯微鏡下采集圖像，各組織切片選取5個互不重疊的視野，高速彩色CCD相機采集圖像。以Imagine Pro-Plus 6.0圖像分析系統進行免疫組化染色結果分析，測定陽性顆粒積分光密度IOD（inergral optical density），陽性表達面積Area。

2.5 提取RNA與合成cDNA RNA提?。喝⌒迈r凍存的大鼠腎臟組織50～100 mg，于液氮中充分研磨至粉末狀，置于無酶EP管中，加入1 mL Trizol，室溫孵育5 min，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫孵育3 min，于4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清500 μL置于新管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，于4 ℃ 12 000×g離心15 min，棄上清，加入1 mL 4 ℃預冷75%乙醇，4 ℃ 7 500×g離心10 min，棄上清，空氣干燥10 min，加入30 μL無酶水溶解，55 ℃水浴10 min。于波長260，280 nm下測定吸光度，計算A260/A280和腎臟總RNA濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳，180 V，15 min，觀察腎臟總RNA完整性。cDNA合成：每個樣本取4 μg總RNA作為模板按Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit步驟合成cDNA第一鏈。4 μg RNA模板，oligo（dt）181 μL，無酶水補足體積至12 μL，混勻，65 ℃孵育5 min，冰上驟冷，加入5×reaction buffer 4 μL，Ribolockrnase inhibitor 1 μL，10 mmol·L^-1NTP Mix 2 μL，Reveraid M-MVLV RT 1 μL，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，終止反應。

2.6 Real-time RT-PCR檢測Glut9 mRNA表達 用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，選用看家基因GAPDH為內參基因，由北京博邁德基因技術有限公司合成。Glut9 mRNA引物序列為：Forward 5′-TGCATTGGCGTGTTTTCTGG-3′，Reverse 5′-GTTTGGAAGGCTTTCGTGGC-3′；GAPDH引物序列為：Forward 5′-GGTGGACCTCATGGCCTACA-3′，Reverse 5′-ATTGTGAGGGAGATCCTCAGTGT-3′。

Real-time RT-PCR反應體系為20 μL，包含cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Universal SYBR Green Supermix 10 μL，無酶水7 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，40個循環；65～95 ℃，每5 s升高0.5 ℃進行溶解曲線分析。

2.7 統計處理 實驗結果用SAS 9.0統計，數據均采用±s表示，多組間數據比較根據各組正態及方差齊與否選擇單因素方差分析或是Kruskal-Wallis軼和檢驗，組間兩兩比較根據方差齊與否選擇采用Dunnett-t檢驗或Dunnett′s T3檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。qPCR結果用2-ΔΔCt法統計，以相對值表示。

3 結果

3.1 動物一般狀態 實驗期間各組動物生長狀態良好，體重逐漸增長且各組無組間差異。

3.2 大鼠血清尿酸水平變化 實驗第10天至第40天，與正常組相比，模型組血尿酸水平均顯著升高（P<0.01或P<0.05）；與模型組相比，苯溴馬隆組血尿酸水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）；菊苣提取物高劑量組SUA水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。實驗第10天至第30天，菊苣提取物中劑量組血尿酸水平顯著降低（P<0.01）；實驗第20天，菊苣提取物低劑量組血尿酸水平顯著降低（P<0.01），見表1。

3.3 大鼠腎功能指標 與正常組相比，實驗第10天至第40天，模型組肌酐水平差異無顯著性，尿素氮水平顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，實驗期間其余各組肌酐、尿素氮水平差異無顯著性，見表2。

3.4 腎臟尿酸排泄指標 實驗第40天，各組尿尿酸無明顯差異。與正常組相比，模型組24 h尿量顯著減少（P<0.05），腎臟尿酸清除率無顯著性差異；與模型組相比，菊苣提取物中劑量組24 h尿量顯著增加（P<0.05），菊苣提取物高、中劑量組腎臟尿酸清除率顯著增加（P<0.05），其余組無明顯差異，見表3。

3.5 大鼠腎臟Glut9免疫組化染色及半定量分析 免疫組化染色結果見圖1，Glut9在各組大鼠腎臟均有表達，主要表達于腎臟近曲小管頂膜。相較于正常組，模型組陽性表達面積與積分吸光度均顯著增加（P<0.01）。相較于模型組，苯溴馬隆組陽性表達面積顯著減少（P<0.05），積分吸光度差異無統計學意義；菊苣提取物高、中、低劑量組陽性表達面積PEA與積分吸光度IOD均顯著減少，見表4。

3.6 大鼠腎臟Glut9 mRNA表達的變化 提取的腎臟總RNA經1%的瓊脂糖凝膠電泳后紫外成像，清晰可見18S和28S條帶，見圖2。構建內參基因GAPDH和目的基因Glut9的標準曲線，得到斜率為-3.386，-3.338，其相關系數分別為0.998，0.997，計算得其擴增效率分別為97.4%，99.3%。Real-time RT-PCR結果顯示內參基因GAPDH和目的基因Glut9擴增曲線呈“S”型，溶解曲線為尖銳單峰，擴增產物單一，引物特異性較好。

Real-time RT-PCR檢測大鼠腎臟Glut9 mRNA相對表達量，用內參基因GAPDH歸一目的基因Glut9的Ct值，相較于正常組，模型組Glut9 mRNA有上調趨勢（P=0.102）；相較于模型組，苯溴馬隆組與菊苣提取物高劑量組Glut9 mRNA有下調趨勢（P=0.085，P=0.101），菊苣提取物中、低劑量組Glut9 mRNA表達未見明顯改變，見圖3。

4 討論

4.1 果糖與高尿酸血癥 高尿酸血癥（HUA，hyperuricemia）是血尿酸水平在體內持續性升高或者血尿酸鹽過飽和的一種病理狀態，現代高尿酸血癥患病率的增高與人民飲食結構的改變具有密切聯系^[8]。果糖為己糖單糖，相關流行病學及臨床研究表明果糖過量攝入可導致代謝綜合征，其中，血清尿酸水平升高是其主要表現之一^[9-12]，近年來的相關動物實驗與上述流行病學及臨床研究具有一致性^[13-14]。本研究中給予大鼠10%高果糖飲水造模，實驗第10～40天，與正常組相比，給予果糖造模組大鼠血尿酸水平持續穩定顯著性升高。

果糖誘導高尿酸血癥的病理機制可能與尿酸生成增加或排泄減少有關。有學者認為高果糖攝入引起高尿酸血癥是由于果糖在肝臟迅速被轉化為果糖-1-磷酸，從而刺激ATP水解增加腺嘌呤核糖核苷酸AMP，AMP在腺苷脫氨酶ADA的催化下生成次黃嘌呤核苷，并進一步在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸^[15]。另有研究顯示果糖誘導的血尿酸升高可能與調控腎臟尿酸分泌的有機陰離子轉運體OAT，尿酸陰離子轉運體UAT有關^[16]。此外，有研究認為高果糖的攝入可引起腎臟血液動力學以及排泄功能的改變^[17]。本研究顯示，實驗第40天，與正常相比，果糖造模組24 h尿量，UUA及CUA均無顯著性差異，而在實驗期間，果糖模型組血尿酸水平顯著升高，表明其尿酸排泄量相對減少。同時本研究測定了腎臟功能相關指標，與正常組相比，果糖模型組CRE水平差異無顯著性，BUN水平顯著降低。CRE與BUN均為評價腎臟功能的指標，其中BUN為機體蛋白質代謝的終產物，果糖模型組大鼠BUN水平顯著高于正常組，可能與其果糖飲水增多，飲食攝入減少有關，本研究結果不能說明存在腎臟功能損害。

4.2 Glut9促進腎臟尿酸重吸收，為促進腎臟尿酸排泄的藥物作用靶點 尿酸生成過多與排泄減少均可使血尿酸水平升高，機體內2/3尿酸經由腎臟排泄，1/3經由腸道排泄^[18]，腎臟在尿酸排泄途徑中有重要作用。腎臟的尿酸排泄主要包括腎小球濾過、腎小管和集合管重吸收以及重吸收后的再分泌，其中，腎小球濾過的尿酸約98%被腎小管重吸收^[19]。因此，腎小管的重吸收在腎臟的尿酸排泄過程中占重要地位。近年有研究顯示，果糖轉運體Glut9與SUA水平密切相關，是高通量、低能量的尿酸鹽轉運體^[20-21]。Glut9由基因SLC2A9編碼，分為Glut9a和Glut9b 2個亞型，Glut9a由12個外顯子編碼，含540個氨基酸，表達于多個代謝器官，而Glut9b由13個外顯子編碼，含512個氨基酸，只在肝臟和腎臟中發現，并且腎小管是Glut9的主要表達場所，故Glut9是高尿酸血癥的危險因子之一。

本研究中免疫組化染色顯示Glut9在大鼠腎臟近曲小管頂膜表達，模型組Glut9蛋白表達水平顯著高于正常組，表明其血尿酸升高可能與Glut9蛋白表達增加有關。相較于模型組，苯溴馬隆組Glut9蛋白表達水平顯著低于模型組，這與近年來研究發現的苯溴馬隆可抑制Glut9，減少腎臟尿酸重吸收的報道一致^[22]，結合苯溴馬隆組大鼠血尿酸水平顯著低于模型組，表明抑制Glut9蛋白表達，減少腎臟尿酸重吸收，可作為促進腎臟尿酸排泄的藥物作用靶點。

4.3 菊苣可能通過抑制腎臟Glut9表達，減少腎臟尿酸的重吸收發揮促尿酸排泄作用 中藥菊苣為維吾爾族習用藥材，具有清肝利膽，健胃消食，利尿消腫的功效，本課題組長期從事中藥菊苣的研究，發現其可穩定的降低血尿酸水平。本研究顯示，實驗期間相較于模型組，各菊苣提取物組的血清尿酸水平均顯著性降低，且存在一定的時效關系，這與本課題組前期研究結果一致^[23]。

本課題組前期從尿酸的生成途徑對菊苣降尿酸的藥效機制進行了研究，發現菊苣可改變尿酸合成過程中關鍵酶的活性來抑制尿酸的生成，從而起到降低血尿酸的作用，如黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶^[4-24]。相關研究表明，對腎臟尿酸轉運蛋白的調控可能是傳統中藥及其有效成分發揮降尿酸作用的機制之一^[25]。本研究結果顯示，與模型組相比，各菊苣提取物組大鼠CUA顯著升高，表明菊苣提取物可能通過促進尿酸的腎臟排泄發揮降尿酸作用。尿酸水平的升高與腎臟Glut9過表達增加尿酸重吸收有關，本研究顯示，苯溴馬龍、菊苣提取物高、中、低劑量組可顯著降低高尿酸血癥大鼠腎臟Glut9蛋白的表達，有下調Glut9 mRNA表達的趨勢，表明菊苣提取物可通過抑制Glut9的表達，從而減少腎小管對尿酸的重吸收，促進腎臟尿酸排泄發揮降尿酸作用，Glut9可能為菊苣提取物干預高尿酸血癥的作用靶點。

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[責任編輯 張寧寧]