腦心通膠囊促進后下肢缺血損傷小鼠內皮祖細胞動員與歸巢

邱麗珍++陳璐+李春曉+耿瀟+尤星宇

[摘要]內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能分化為血管內皮細胞的前體細胞，組織缺血缺氧所產生的信號分子可促使骨髓EPCs動員至外周循環，并歸巢于損傷組織參與新生血管的形成。腦心通膠囊（Naoxintong capsule，NXT）具有活血化瘀、行氣止痛之功效，其多成分具有血管保護作用，可以有效改善組織缺血癥狀，但其對EPCs動員和歸巢的作用尚不明確。該研究采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉基因小鼠骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）聯合后下肢缺血損傷模型（unilateral hind limb ischemia，UHLI）研究腦心通膠囊對EPCs動員和歸巢的作用。受體小鼠經CS137全身照射后，從目內眥靜脈叢輸注GFP標記的骨髓單個核細胞，建立BMT模型，經過4 周骨髓重建后取外周血檢測GFP陽性細胞比例。取BMT模型成功的小鼠，采用股動脈結扎復制UHLI模型，術后隨機分為3組：模型組、NXT組（模型+NXT）和陽性對照組（模型+辛伐他?。?。采用流式細胞術檢測骨髓重建4周后GFP陽性細胞比例，術前及術后第1，3，7，14 天外周血中EPCs細胞數；采用免疫熒光組織化學染色檢測給藥3，7 d缺血腓腸肌組織EPCs細胞歸巢數目。BMT小鼠與 GFP 基因鼠相比， GFP 陽性細胞比例無顯著性差異；術后1，3 d，NXT組和辛伐他汀組外周血EPCs數量顯著性上調；術后 3，7 d，NXT組和辛伐他汀組EPCs歸巢數量顯著高于模型組（P<0001），因此腦心通膠囊能顯著促進EPCs的動員與歸巢。

[關鍵詞]腦心通膠囊； 骨髓移植； 后下肢缺血損傷模型； 內皮祖細胞； 動員； 歸巢

Effect of Naoxintong capsule on endothelial progenitor cell mobilization

and homing following bone marrow transplantation in a mouse

hind limb ischemia model

QIU Lizhen， CHEN Lu， LI Chunxiao， GENG Xiao， YOU Xingyu， ZHANG Lusha， WANG Hong*

（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin State Key Laboratory of Modern

Chinese Medicinethe Ministry of Education to Build National Key Experimental Cultivation

Base， Tianjin StateKey Laboratory of Chinese Pharmacology， Tianjin State Key Laboratory of

Prescription Medicine of Ministry of Education， Tianjin 300193， China）

[Abstract]Endothelial progenitor cells （EPCs） are precursor cells of endothelial cells Signal molecules produced by ischemia and hypoxia can promote mobilization of bone marrow EPCs to peripheral circulation and formation of novel blood vessels in tissues that are damaged during heart attack Naoxintong capsule （NXT） has the functions of promoting blood circulation， removing blood stasis， promoting the circulation of qi and relieving pain The various components in NXT have protective effects on blood vessels and can effectively improve the symptoms of ischemia However， its effect on EPCs is not clear To study the intervention effect of NXT on mobilization and homing of peripheral blood EPCs， green fluorescent protein （GFP） transgenic mice were used for bone marrow transplantation （BMT） and then unilateral hind limb ischemia model （UHLI） were constructed For BMT， wildtype ICR mice were irradiated by CS137 and then injected with 4×106 bone marrow cells isolated from GFP mice The bone marrow reconstitution of recipients was assessed by quantification of GFP bone marrowderived cells （BMDC） from transplanted mice 4 weeks after BMT The UHLI model was duplicated by ligating femoral artery and divided into three groups： the model group， the NXT group （model+NXT） and the positive control group （model+simvastatin） Flow cytometry was used to detect the proportion of GFP positive cells and the peripheral blood EPCs levels at 1， 3， 7， 14 days before and after surgery Ischemic tissue of gastrocnemius muscle was excised at 3 and 7 days after operation for immunofluorescence staining to detect the number of GFP+ cells The bone marrow chimerism was achieved at day 28 after BMT There was no significant difference in the percentage of GFP positive cells between BMT mice and GFP transgenic mice NXT and simvastatin could significantly increase the number of peripheral blood EPCs 1，3 days after surgery Three and seven days after operation， the number of homing EPCs was significantly higher in NXT group and positive control group than that in model group （P<0001） In conclusion， NXT can obviously promote the mobilization and homing of EPCs

[Key words]Naoxintong capsule； bone marrow transplantation； hind limb ischemia model； endothelial progenitor cells； mobilization； homing

doi：10.4268/cjcmm20162320

缺血性血管疾病是目前威脅人類健康的重要疾病之一，其中下肢血管缺血性疾病以高發病率、高致殘率和高死亡率成為僅次于缺血性腦卒中、冠心病之外危害人類健康的重大公共衛生問題[1]。由于損傷組織缺血缺氧，下肢缺血性疾病常表現為傷口愈合較慢、間歇性跛行，嚴重時甚至出現潰瘍和壞疽[2]，因此恢復缺血組織血流灌注，促進血管新生成為亟待解決的問題。其中內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種能分化為血管內皮細胞的前體細胞，在血管新生中發揮著關鍵作用。組織缺血缺氧所產生的信號分子可動員骨髓EPCs至外周循環，并歸巢于損傷組織參與新生血管的形成[34]。

中醫學理論認為，下肢缺血性疾病具有“瘀血、缺血、血管狹窄或閉塞”等“血瘀證”特點[5]。腦心通膠囊（Naoxintong capsule，NXT）屬于復方中藥制劑，是結合“供血不足乃萬病之源”中醫學理論與現代人的病理特點，挑選黃芪、丹參、水蛭、地龍等16味植物藥和蟲類藥精制而成。腦心通膠囊具有益氣活血，化瘀通脈等功效，可用于氣虛無力推動血液運行而導致的血瘀證，現代臨床上廣泛應用于心肌梗死和缺血性腦血管等缺血性疾病的預防和治療[6]，其多種成分具有血管保護作用，可以有效改善組織缺血癥狀，但其對EPCs的動員和歸巢作用尚不明確。小鼠后下肢缺血損傷模型是研究缺血性疾病血管再生的經典模型，與臨床上下肢動脈疾病癥狀類似。因此本實驗采用小鼠單側后肢股動脈缺血模型（unilateral hind limb ischemia，UHLI）聯合GFP轉基因小鼠骨髓移植（bone marrow transplant，BMT）模型，研究NXT對后肢缺血損傷小鼠內皮祖細胞動員和歸巢的作用。GFP轉基因小鼠能全身性穩定表達綠色熒光蛋白，在本實驗中用作骨髓源性EPCs的示蹤工具。

1材料

11動物60只SPF級健康雄性ICR小鼠，12只SPF級GFP（ICR）基因鼠，雌雄各半，體重28～32 g，8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）20120001。實驗動物于天津市中國醫學科學院生物醫學放射工程研究所動物房中分籠飼養，自由進食，飼養溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%。

12藥物與試劑腦心通超微粉（陜西步長制藥有限公司）；辛伐他?。⊿im）（杭州默沙東制藥有限公司，批號L0233822）。avertin （美國Sigma公司）；流式抗體PEFlk1，APCCy7Sca1（Becton，Dickinson and Company，貨號分別為555308，560654）；09%氯化鈉注射液（山東科倫藥業有限公司，批號13151203062）；肝素鈉 （江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號5150211）；檸檬酸鈉粉末，檸檬酸粉末 （天津市科密歐化學試劑有限公司）；5% BSA封閉液 （SW3015100），DAPI溶液（即用型）（C0065），PBS粉末（P1010，2 L/袋），PBS緩沖液 （P1020500），抗熒光淬滅封片劑 （S210025），4%多聚甲醛 （p1100500），紅細胞裂解液 （R1020500）均購于北京Solarbio科技有限公司；實驗用水為去離子水。

13儀器體式顯微鏡LEICA S8APO（德國Leica）；流式細胞儀（美國BD公司）；Nikon倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）；低溫高速離心機（美國BECKMAN，64R型）；生物組織包埋機BMJ1（上海珂淮儀器有限公司）；小動物手術器械包 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；小動物多功能麻醉機 （美國VETEQUIP，COMPAC5）。

2方法

21骨髓移植模型的建立參考文獻方法建立骨髓移植模型[78]。

GFP轉基因小鼠骨髓單個核細胞的提取與分離：頸椎脫臼法處死GFP轉基因供體小鼠，浸泡75%乙醇中消毒，超凈臺中無菌分離雙側股骨和脛骨，剪掉股骨和脛骨兩端。將處理過的股骨和脛骨浸泡在PBS緩沖溶液中，用PBS緩沖溶液反復沖洗骨髓腔，直到沖洗液澄清為止，通過70 μm細胞過濾器將骨髓細胞懸浮液轉移至50 mL無菌離心管中。以小鼠外周血淋巴細胞分離液經密度梯度離心法獲得單個核細胞。移入另一無菌離心管中，加入3～5 倍的PBS緩沖溶液洗滌2次，以1 400 r·min-1離心5 min，制備骨髓單個核細胞懸液，計數。加入PBS緩沖溶液調整細胞濃度約為2×107個/mL，暫時放于冰盒備用。

野生型受體小鼠骨髓移植模型的建立：采用放射源CS137對野生型ICR小鼠全身照射，照射劑量為90 Gy，劑量率采用1 Gy·min-1。照射后2 h內，用乙醚對小鼠行淺表麻醉，通過目內眥迅速注入200 μL供體鼠骨髓單個核細胞懸液。經過移植后小鼠在SPF級實驗室飼養4周，進行骨髓重建，期間飼料及墊料均經高壓高溫消毒處理。

骨髓重建后外周血GFP陽性細胞數量檢測：骨髓重建4 周后，取小鼠外周血制備流式細胞樣本，通過流式細胞術檢測GFP陽性細胞數量，并計算其比例。取ICR野生型小鼠（WT mice）作為陰性對照組，GFP基因鼠（GFP mice）作為陽性對照組。檢測小鼠外周血中GFP陽性細胞數量，據此判斷骨髓移植造模是否成功。

22單側后肢缺血損傷模型的建立根據文獻方法建立小鼠單側后肢缺血損傷模型[9]。以15 g·L-1 avertin（165 mL·kg-1）經腹腔注射對小鼠行全身麻醉后備皮，取仰臥位固定。自右后肢腹股溝處橫向切口，鈍性分離肌肉，暴露起源于髂外動脈，終止于隱靜脈和腘動脈的股動脈，以7/0號絲線結扎血管，離斷并剪掉股動靜脈及其分支，縫合皮膚。采用激光多普勒掃描成像系統檢測小鼠結扎并離斷股動脈前后結扎部位的血流速度，術后血流速度降低到術前的10%以下，且血流的頻譜發生明顯的改變，以此作為后肢缺血模型成功建立的標準，然后將小鼠置于37 ℃電熱毯上直至蘇醒。

23實驗分組與給藥將腦心通超微粉末加入生理鹽水中配成70 g· L-1溶液，分裝備用。辛伐他汀加入生理鹽水中配成1 g·L-1溶液，分裝備用。UHLI成功的54只小鼠，隨機分成3 組，每組18 只。本研究中依據體表面積計算法以及腦心通膠囊臨床應用劑量換算成小鼠給藥劑量。腦心通膠囊臨床劑量為成人（口服）：一日3 次，一次2～4 粒，04 g/粒，以此確定本研究中小鼠腦心通組等效劑量為700 mg·kg-1·d-1。陽性藥組（辛伐他?。﹦┝?0 mg·kg-1·d-1，模型組給予同體積生理鹽水。造模1 h后經灌胃給藥，連續給藥3，7 d分別進行取材。

24流式細胞術檢測外周血EPCs動員參考文獻方法[10]，分別于小鼠HLI術前、術后1，3，7，14 d，采集經肝素鈉抗凝的外周血，分別加入5 μL的PEFlk1和25 μL的APCCy7Sca1，2種小鼠EPC表面標記抗體或同型對照，4 ℃避光孵育30 min，加1 mL紅細胞裂解液，孵育2 min，加入適量緩沖液洗去未結合的抗體和紅細胞碎片，用FACS 流式細胞儀檢測單個核細胞懸液，每份標本檢測10萬個細胞，以GFP，Flk1，Sca1三陽性細胞占單核細胞的比例表示外周血EPCs數量，用Cell Quest軟件分析并記錄外周血單個核細胞中GFP+/Flk1+/Sca1+三陽性EPCs的比例。

25免疫熒光法檢測EPCs歸巢給藥3，7 d后，分別取小鼠缺血側腓腸肌，4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續橫向切片。石蠟組織切片，脫水脫蠟后行DAPI染色，DAPI非特異性與細胞核結合呈現藍色熒光。Nikon倒置熒光顯微鏡下拍照觀察GFP陽性細胞的分布和數量，以綠色熒光蛋白數量來評價EPCs歸巢數量。熒光計數：每張切片隨機取5個不同視野，非肌肉橫切面視野排除在外，以PS軟件（Photo Shop 5）計數每個視野內GFP數量或毛細血管數量，EPCs歸巢以EPCs數/HPF （× 200）表示。

26統計學處理采用SPSS 160統計軟件分析，計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用LSDt法檢驗，以P<005為差異有統計學意義。

3結果

31骨髓移植小鼠后下肢缺血損傷模型的實驗設計第0 周對小鼠進行骨髓移植術，術后將受體鼠飼養于SPF級環境下，進行4 周的骨髓造血重建。骨髓重建4 周后，采用流式細胞術進行GFP骨髓嵌合率的檢測。對骨髓移植成功的小鼠繼續構建單側后下肢缺血損傷模型，術后第1，3，7，14 天采用流式細胞術檢測外周血中EPCs的數量，術前、術后3，7 d對小鼠進行麻醉后取材，獲取損傷側腓腸肌，放于4%多聚甲醛中固定，進行石蠟包埋切片，以便用于后期EPCs歸巢的檢測（圖1）。

32小鼠骨髓移植后造血重建4周后外周血GFP陽性細胞比例使用小動物活體成像系統檢測GFP小鼠的GFP表達，發射波長為520 nm，激發波長為480 nm，曝光時間為1 s，IPP軟件定量分析熒光面積。GFP轉基因小鼠能全身性穩定表達綠色熒光蛋白，裸露于毛發之外的皮膚在小動物活體成像系統下可見綠色熒光，骨髓移植小鼠與GFP小鼠GFP的熒光表達無顯著差異，初步證明骨髓移植模型建立成功（圖2 A）。

用Cell Quest軟件建立獲取模板FSC/SSC雙參數散點圖，設P1門選定外周血中除細胞碎片外的所有細胞為目的細胞，包括中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，其中單核細胞和淋巴細胞統稱為單個核細胞，黑色信號為細胞碎片。再用該軟件建立分析模板SSC/GFP熒光雙參數直方圖點圖，橫坐標代表GFP熒光強度，分析外周血中GFP陽性細胞比例。P2門內為外周血中GFP陽性細胞，是綠色信號（中性粒細胞）和藍色信號（單個核細胞）總和，紅色信號為GFP陰性細胞。骨髓移植后第28天，結果顯示 BMT小鼠（BMT mice）GFP 陽性細胞達到（9029±60）%，GFP基因鼠的GFP陽性細胞的比例達到（9111±672）%，而野生型小鼠未檢測到GFP陽

A BMT 和GFP小鼠活體成像照片；B BMT 和GFP小鼠外周血GFP陽性細胞比例流式細胞分析圖，獲取圖中P1門內為外周血中所有細胞，黑色信號為細胞碎片，分析圖中P2門內為外周血中GFP陽性細胞，是綠色信號（中性粒細胞）和藍色信號（單個核細胞）的總和，紅色信號為GFP陰性細胞；C 對B的熒光強度定量分析。

性細胞?？傻贸鲈诠撬柚亟ǖ?8天小鼠外周血GFP嵌合率與正常GFP基因鼠相比無統計學差異。據此可以確認本研究成功建立了GFP骨髓移植的動物模型（圖2 B，C）。

33腦心通對BMT小鼠HLI后外周血EPCs動員作用本研究運用的是成功建立的 GFP骨髓移植模型小鼠，EPCs為同時表達GFP，Flk1，Sca1的三陽性細胞。術后1，3 d，3 個實驗組外周血中EPCs數量均上調，隨時間延長術后7 d EPCs含量逐漸降低，術后14 d幾乎均降低到術前EPCs的水平。術后1 d，與模型組（073±021）相比，腦心通組（123±021）和辛伐他汀組（103±014）GFP+/ Sca1+/ Flk1+三陽性細胞含量顯著性上調（P< 001）。術后3 d，腦心通組（129±021）和辛伐他汀組（087±017）EPCs含量比模型組（069±012）同樣顯著性上調（P<001，P<005），可知腦心通對EPCs動員的上調作用在術后1 d更顯著，腦心通組上調作用比辛伐他汀組更顯著（圖3）。

34腦心通對EPCs在BMT小鼠缺血腓腸肌的歸巢數目的影響倒置顯微鏡下可見均勻分布的中間散布著GFP綠色熒光，尤其腦心通組和辛伐他汀組熒光表達更強、數量更多；結合取材時，對缺血側腓腸肌形態和色澤觀察比較，可知腦心通組和辛伐他汀組損傷修復較好。術后3 d腦心通組（14550±550）和辛伐他汀組（15133±1451）GFP陽性細胞數目比模型組（3917±564）明顯增多（P<0001），并且GFP陽性細胞分布更均勻（圖4）。術后7 d腦心通組（11325±743）和辛伐他汀組（11450±1184）GFP陽性細胞數目比模型組（3900±542）明顯增多（P<0001），并且GFP陽性細胞分布更均勻（圖5）。

4討論

EPCs是一類循環存在于骨髓和外周血中可分化為血管內皮細胞的前體細胞。Asahara等[11]在1997年首次用免疫磁珠法從外周血單個核細胞中分離出來一種CD34+和血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2+ ） 雙陽性的單核細胞，經體外培養進一步證實其能特異性表達內皮細胞抗原，故命名為EPCs。近代研究發現，EPCs不僅參與胚胎早期血管形成，還是與成年個體中血管新生密切相連的一類成熟干細胞，主要定位于骨髓中，在內源性組織缺血、生長因子和藥物的刺激下，能夠被動員出骨髓，進入外周血循環，進而遷移、歸巢到損傷組織處，并增殖、分化為血管內皮細胞，參與損傷組織修復，起到促進血管新生、修復受損血管、維持損傷血管修復動態平衡等作用[1214]。目前研究表明，骨髓、臍血和外周血三者含量之比約為15∶10∶1，在骨髓和外周血中EPCs的比例也只有001%，機體內EPCs數目有限[15]，機體這種自我修復作用十分有限。因此，尋找副作用小的、能增加骨髓中EPCs數量并且促進其向血液循環中動員的藥物具有重要意義。

缺血性疾病屬中醫血瘀證范疇，《素問·瘺論》云：心主一身之血脈。心氣虛則無力推動血液運行，致瘀血阻滯心腦之絡，引起中風、胸痹等諸多病理變化；下肢動脈疾病具有“瘀血、缺血、瘀斑、腫脹、粥樣斑塊、血栓形成、血管狹窄或閉塞”等“血瘀證”特點，能引起肢體血液循環障礙和微循環障礙，甚至發生潰瘍或壞疽[16]。在中醫學“異病同治、同證同治”的治療原則指導下，心腦血管缺血性疾病、下肢缺血性疾病雖然病位不同，但均具有“血瘀證”共同特點。腦心通膠囊是在“補陽還五湯”的基礎上加上蟲類藥將植物類藥物和蟲類藥巧妙合用，具有益氣活血，化瘀通脈等功效，具有改善心腦血管功能，增加血流量，改善微循環，改善血液流變學，降低血黏度，抑制血小板聚集，改變血液的高凝狀態，增加纖溶活性，抑制血栓形成等作用，緩解心腦缺血癥狀，改善心腦功能[1718]。腦心通膠囊可有效改善和恢復血管內皮細胞損傷的功能，從而改善內皮舒張功能，改善血管收縮功能，顯著減輕缺血引起的心肌細胞變性和壞死[19]?；钛?，恢復缺血區域供血，維持血管形態，促進血管新生是治療缺血性疾病的關鍵因素。組織缺血缺氧所產生的信號分子可動員骨髓EPCs至外周循環，并歸巢于損傷內皮參與新生血管的形成[20]。腦心通膠囊對EPCs動員和歸巢的作用尚未見報道。

作為他汀類藥物辛伐他汀廣泛應用于高脂血癥的治療，同時大量研究表明辛伐他汀可以通過調節血脂、抑制血管內皮炎癥反應、穩定粥樣斑塊、改善血管內皮功能、能通過激活Akt/eNOS 途徑改善急性期心功能等作用，降低患者發生心血管事件的風險，顯著改善預后，在心血管疾病的防治中具有重要臨床價值[2124]。腦心通膠囊是在經方補陽還五湯的基礎上結合大量臨床實踐創制的復方中藥，廣泛應用于心腦血管疾病的一、二級預防，是治療缺血性疾病藥物的大品種，與辛伐他汀有相似的臨床應用。研究證實，辛伐他汀能促進EPCs的動員、增殖、遷移及分化，增加外周循環中EPCs數量，有利于EPCs歸巢到缺血損傷部位參與新血管形成[2526]。因此本實驗選用辛伐他汀作為觀察EPCs動員的陽性對照藥。

小鼠后下肢缺血模型是研究缺血性疾病血管再生和EPCs功能的經典模型。與結扎冠狀動脈所引起的組織缺血模型相比較，結扎股動脈所引起的缺血模型不僅具有操作簡單、死亡率低的優點，而且具備既有明顯缺血性組織損傷，又有血管和實質細胞再生修復條件的特征。因此本研究采用骨髓移植聯合后下肢缺血損傷小鼠模型，觀察腦心通膠囊對EPCs動員和歸巢的影響。實驗數據表明腦心通膠囊可以增加HLI術后1，3 d外周血中EPCs數量，證實腦心通膠囊可以促進EPCs動員。近年來也有研究發現單味藥如黃芪、葛根素、丹參素等對于EPCs具有動員作用，都可通過增加EPCs數量并伴隨其功能的改善，促進局部血管新生，改善缺血組織供血[27]。黃芪作為腦心通膠囊的君藥其有效成分有可能是發揮該作用的物質基礎。本研究采用GFP蛋白示蹤方法發現腦心通膠囊可以增加HLI術后3，7 d EPCs在BMT小鼠缺血腓腸肌的數目，進一步證實了其促進EPCs歸巢的作用。EPCs歸巢于缺血組織主要通過以下3個方面參與新生血管的形成：可直接參與血管形成，修復損傷血管[28]；可分化為成熟內皮細胞，參與血管新生；可分泌血管內皮細胞生長因子、基質細胞衍生因子1等多種細胞因子，募集成熟內皮細胞并促進其增殖，共同參與血管修復及新生血管形成[29]。提示腦心通膠囊可通過增強EPCs功能促進缺血組織損傷修復。

綜上所述，本研究采用骨髓移植后HLI模型，證實NXT可以通過促進EPCs的動員與歸巢，發揮促缺血組織損傷修復作用，為其作為活血化瘀復方中藥用于臨床治療缺血性疾病提供了實驗依據。

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[責任編輯馬超一]