一株不產“透明圈”解磷菌的初篩及其溶磷能力的初步測定

葉勁松+衛新來+郭夢瑤+江雅琪+戴佳秀

摘 要：該文以Ca3（PO4）2為唯一磷源，以固體平板上是否出現溶磷“透明圈”為指標來初篩解磷菌時，發現一株霉菌，平板上長勢良好，未產生明顯“透明圈”；經液體搖瓶培養，發現其具有較強的解磷能力，上清液中有效磷在第6天達到極值10.66mg/L，pH值從起始7.21下降到4.52。以“透明圈”作為解磷菌的初篩標準，可能會丟失部分解磷菌。

關鍵詞：不產透明圈；解磷菌；初篩；溶磷能力

中圖分類號 S154 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）23-0038-02

解磷菌是一類能夠溶解土壤中難溶態磷素，釋放出能夠被植物吸收的有效磷的微生物[1]。和傳統的化學磷肥相比，它具有改善土壤質量和結構，提高土壤中磷的有效利用率，節肥增產，對保持生態環境平衡具有重要意義等優點[2-4]，日益受到學者們的關注[5-8]。在初篩此類微生物時，常以磷酸鈣為唯一磷源的選擇性培養基，以在固體平板上是否出現透明的溶磷圈為指標，來判斷其是否為解磷菌[7，9]。若有明顯的透明圈，則初步認為是解磷菌，否則被丟棄。本研究小組在篩選過程中，發現有的菌株在固體平板上不產溶磷透明圈，但液體培養顯示具有一定溶磷能力，研究結果對于解磷菌初篩方法的改進完善具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種：昆明山區土壤。初篩固體培養基和液體搖床發酵培養基：見文獻[10]

1.2 方法 初篩方法：稀釋涂布方法，28℃培養，3～5d。逐日觀察，以平板上是否有溶磷圈出現，來初步判斷其溶磷能力。液體發酵測定解磷能力方法：1mL霉菌孢子菌懸液（108個/mL），接入100mL液體培養基，另取滅活的霉菌孢子菌懸液作為對照。28℃，轉速150r/min，培養10d。每48h取出，5 000r/min離心10min，取上清液測定有效磷含量和pH值。有效磷測定方法：鉬銻抗比色法[11]；pH測定方法：pH酸度計。

3 結果與分析

一般來說，“透明圈”是初步判斷一菌株是否具有溶磷能力的標準方法[12-13]。一直以來，本研究小組都是按照這個方法進行篩選的。在初篩平板上，會經常出現不產“透明圈”的菌落，多數菌落小，但是有一株霉菌，不產透明圈，卻長勢很旺。對于這看似奇特的現象，決定進一步研究，故純化后進行液體搖床繼續培養。

3.1 初篩 如圖1所示，該青綠色霉菌在平板上長勢旺盛。既然在磷酸鈣為唯一磷源的培養基上長勢良好，那么該菌肯定能從外界中攝取磷源滿足自身生長需要，也就是說它應該具有溶磷能力，只是沒顯示出“透明圈”，于是繼續對其研究。

3.2 無“透明圈”解磷圈的上清液pH變化 圖2顯示，初始日，霉菌和滅活霉菌的液體培養基pH在7.21左右。2d后兩者pH值都開始下降，但霉菌pH值下降更快速，且接種霉菌的上清液的pH值在第6天下降到最低點4.52，這說明此株霉菌確實產酸；而與此同時滅活霉菌的上清液pH值，始終在6.8左右。

3.3 無“透明圈”溶磷圈上清液中有效磷變化 從圖3可以看出，上清液中有效磷一直在快速上升，并在第6天達到最高點10.66mg/L。說明此霉菌確有溶磷能力，能將難溶磷酸三鈣溶解，使得溶液中有效磷含量上升。本實驗只是測定了上清液中的有效磷，若加上菌體內的磷素，實際總共溶解的有效磷將更可觀[14-15]。在第6天之后有效磷含量下降，可能是隨著時間推移，營養物質不斷被消耗，使得其溶磷能力下降或部分溶磷菌死亡。前6d，有效磷變化趨勢和pH變化趨勢呈現負相關，即pH下降，有效磷上升。似乎是由于產酸，導致不溶磷酸鈣溶解，釋放出有效磷，這也和多數學者報道的溶磷機制相同[14，16]。此株溶磷霉菌，之所以在平板上沒有明顯的“透明圈”，原因可能是因為該菌產酸酸性不夠強，導致溶磷透明圈不明顯，或是由于生長旺盛的氣生菌絲將很小的溶磷圈覆蓋了，也可能尚存在其他原因。

4 結論與討論

以“透明圈”判斷菌落是否為解磷菌，可能會丟失部分解磷菌。平板“透明圈”方法只是進行溶磷微生物篩選的較為初步的方法，它并不能作為評判某微生物是否具有溶磷能力的絕對標準方法，測定液體有效磷才是準確測定其溶磷能力的可靠方法，因為不產“透明圈”的溶磷菌也極可能有較強的溶磷能力。如對平板上的所有微生物都進行液體搖床有效磷測定，工作量太大，而“透明圈”法簡單快捷，卻不完全可靠。如何解決這一對矛盾，今后仍需要作進一步的探討研究。

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（責編：張宏民）