5種不同鐮刀菌的酶學特性分析

王桂清，馬 迪

(聊城大學 農學院，山東 聊城 252059)

5種不同鐮刀菌的酶學特性分析

王桂清，馬 迪

(聊城大學 農學院，山東 聊城 252059)

采用比色法和電泳技術對引起成年國槐根莖腐爛病的5 種鐮刀菌的酶學特性進行了分析，為鐮刀菌的分類和生理分化研究等提供理論依據。結果表明，5 種鐮刀菌的可溶性蛋白含量及4種保護酶(EST、SOD、PPO和POD)活性的測定結果與電泳結果相一致，如5種鐮刀菌的SOD活性都很高，介于2 263.09～6 134.42 U/mg，電泳圖譜清晰，譜帶顏色較深、較明亮，說明電泳法可半定量地確定保護酶活性的大??；供試的5種鐮刀菌在可溶性蛋白和EST、SOD、PPO等同工酶水平上存在差異，不同鐮刀菌之間某些同工酶譜帶數和同一遷移率譜帶的亮度和色澤差異非常明顯，既存在共同譜帶又有特異性譜帶，如5種鐮刀菌EST同工酶圖譜的共同譜帶占23.5%，特異性譜帶占76.5%，說明5種供試病原菌均屬于鐮刀菌屬，但分屬于不同的鐮刀菌種。

鐮刀菌； 酶學； 可溶性蛋白； 同工酶； 酶活性

國槐(SophorajaponicaLinn.)是我國特有樹種，也是目前我國園林綠化的主要樹種之一。近年，國槐根莖腐爛病在山東聊城地區發病較重，導致成年國槐樹勢衰弱甚至死亡，嚴重影響了城市綠化和園林建設。聊城大學國槐衰弱原因研究小組前期研究證明，鐮刀菌(Fusariumsp.)是引起國槐根莖腐爛病的重要致病菌之一。

鐮刀菌是重要的植物病害致病菌，由于其種類多、變異性強，對其分類、防治等均比較困難。鐮刀菌作為一種生物，由細胞構成，每個細胞又由于酶的存在表現出種種生命活動，確保其新陳代謝正常進行。鐮刀菌體內酶越多、越完整，酶活性越高，其生命越健康，適應性、侵染能力、致病能力和抗逆能力等越強。同工酶是催化相同的化學反應，但酶蛋白的分子結構、理化性質等各不相同的一類酶，其分子構型的相似性可反映出生物種群間的親緣關系，表現出明顯的種屬、組織和發育階段的特異性，可為種和種以下分類提供理論依據[1-2]。本試驗以引起國槐根莖腐爛病的5種鐮刀菌為靶標，采用分光光度技術和同工酶技術，從酶學角度研究不同鐮刀菌的差異，為鐮刀菌的分類和生理分化研究、國槐根莖腐爛病的防治及相關研究等提供有力的理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌及培養

供試病原菌為從國槐根莖腐爛病發病部位分離得到的5種鐮刀菌：多隔鐮刀菌(F.decemcellulare)、層生鐮刀菌(F.proliferatum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、F.keratoplasticum和腐皮鐮刀菌(F.solani)，由聊城大學植物病理學研究室提供。利用PDA培養基于(25±1) ℃光照恒溫培養箱培養5 d，備用。

1.2 酶蛋白的提取

用直徑7 mm的打孔器自菌落邊緣打取菌片，接種于PA培養液(250 mL三角瓶中裝有培養液100 mL)中，每瓶15個菌片，于(25±1)℃、150 r/min振蕩培養箱中培養6 d。真空抽濾，剔除菌片，獲取菌絲，濾紙壓干。按王桂清等[3]的方法提取酶蛋白。

1.3 蛋白質含量的測定

參照周先婉等[4]的考馬斯亮藍G-250染色法進行蛋白質含量測定，以白蛋白為標準蛋白制作標準曲線。準確吸取3倍稀釋的樣品0.1 mL，加入3 mL考馬斯亮藍G-250試劑，混合均勻后放置2 min。在595 nm波長下測定OD值，在標準蛋白曲線上查得被測樣品的蛋白質含量。

1.4 保護酶活性測定

酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性測定參照王桂清等[5]、姬蘭柱等[6]的方法，多酚氧化酶(PPO)活性的測定參照肖婷等[7]的方法。

1.5 蛋白質及同工酶電泳凝膠染色

參照胡能書等[8]的方法制膠并進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離。分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為3%；濃縮膠內電泳電壓為80 V，分離膠內電泳電壓為90 V?？扇苄缘鞍准巴っ改z染色方法參照王桂清等[3]的方法。

1.6 電泳圖譜的聚類分析

電泳后測量凝膠圖譜各譜帶的泳動距離，計算每條譜帶的遷移率(Rf)。將電泳獲得的每一條譜帶的有無作為統計參數，采用有酶帶記為“1”、無酶帶記為“0”的方法，得到電泳的“0、1”矩陣。

Rf的計算公式如下：

Rf=固定染色后凝膠中酶蛋白區帶的遷移距離/固定染色后指示劑的遷移距離。

2 結果與分析

2.1 不同鐮刀菌可溶性蛋白含量及保護酶活性比較

5種鐮刀菌的可溶性蛋白含量差異顯著，多隔鐮刀菌的含量最高，為0.031 8 mg/mL，木賊鐮刀菌的含量最低，為0.008 9 mg/mL，前者是后者的3.57倍；腐皮鐮刀菌、層生鐮刀菌和F.keratoplasticum的含量依次為0.025 2 mg/mL、0.013 6 mg/mL和0.011 9 mg/mL，后兩者的可溶性蛋白含量比較接近，差異不顯著(圖1)。

標注不同字母代表差異顯著(P<0.05),下同圖1 不同鐮刀菌的可溶性蛋白含量

多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum和腐皮鐮刀菌5種鐮刀菌的SOD活性依次為5 119.99 U/mg、2 263.09 U/mg、3 219.20 U/mg、5 182.41 U/mg和6 134.42 U/mg，除多隔鐮刀菌和F.keratoplasticum差異不顯著外，其余菌之間均差異顯著，其中，腐皮鐮刀菌的SOD活性最高，層生鐮刀菌的最低，前者是后者的2.71倍(圖2)。

供試的5種鐮刀菌的EST活性均很高且差異顯著。其中，多隔鐮刀菌的EST活性最高，為80 109.01 U/mg，木賊鐮刀菌的活性最低，為44 224.72 U/mg，前者是后者的1.81倍；層生鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的EST活性均為75 000 U/mg左右，差異不顯著；F.keratoplasticum的EST活性為58 571.43 U/mg，相對較低(圖3)。

圖2 不同鐮刀菌的SOD活性

圖3 不同鐮刀菌的EST活性

與SOD和EST 2種酶的活性比較，供試鐮刀菌的PPO活性整體水平較低。不同鐮刀菌間PPO活性差異顯著，其中，層生鐮刀菌的PPO活性最高，為191.18 U/mg，F.keratoplasticum的活性最低，為82.77 U/mg，前者是后者的2.31倍(圖4)。

供試5種鐮刀菌的POD活性遠遠低于SOD、EST和PPO的活性，變化幅度為0.77～2.58 U/mg。菌種間POD活性存在差異，其中，多隔鐮刀菌的活性最高，層生鐮刀菌的活性最低，前者是后者的3.34倍(圖5)。

圖4 不同鐮刀菌的PPO活性

圖5 不同鐮刀菌的POD活性

2.2 不同鐮刀菌的同工酶圖譜分析

供試5種鐮刀菌的可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜見圖6，根據圖譜統計出的電泳譜帶數量見表1。圖6和表1表明，5種鐮刀菌在可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜的譜帶數量上存在一定的差異。

圖譜從左到右依次為多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum、腐皮鐮刀菌圖6 不同鐮刀菌可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜表1 5種鐮刀菌可溶性蛋白及同工酶電泳圖譜分析結果

項目譜帶編號Rf鐮刀菌種類12345項目譜帶編號Rf鐮刀菌種類12345可溶性蛋白10.00510101EST10.0211100020.0111000020.0270100030.0271111130.0961111140.0331000140.1910001050.0381001150.2451000060.0431110160.2661000070.0541111170.2771111180.0651111180.33000011

續表1 5種鐮刀菌可溶性蛋白及同工酶電泳圖譜分析結果

注：鐮刀菌1、2、3、4、5分別為多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum、腐皮鐮刀菌。

可溶性蛋白標記比較豐富，5 種鐮刀菌共分離出了30 條譜帶，其中，多隔鐮刀菌的譜帶最多，為25 條，其次為腐皮鐮刀菌(23條)、木賊鐮刀菌(15條)，層生鐮刀菌和F.keratoplasticum均13 條。共同譜帶有6 條，Rf值分別為0.027、0.054、0.065、0.087、0.130和0.913，占所有譜帶的20%；特異性譜帶有24 條，占所有譜帶的80%。由此可見，在可溶性蛋白方面供試5 種鐮刀菌間差異較大，生理分化明顯。

EST電泳圖譜共分離出了17條清晰且顏色比較深的譜帶，其中，共同譜帶有4 條，Rf值分別為0.096、0.277、0.383和0.511，占所有譜帶的23.5%，特異性譜帶有13條，占所有譜帶的76.5%，是標記最豐富的同工酶圖譜之一。不同菌株之間譜帶數量差異較大，多隔鐮刀菌的譜帶最多，為11 條，木賊鐮刀菌的譜帶最少，為5條，譜帶在凝膠的上、中、下各部位都有分布。

SOD同工酶電泳產生的條帶數較少，共分離出了6 條清晰透明的譜帶，每種鐮刀菌的譜帶數均在3～5 條，其中，共同譜帶3 條，Rf值分別為0.333、0.417和0.479，占所有譜帶的50%。

病菌PPO電泳圖譜共分離出5 條譜帶，無共同譜帶，均為特異性譜帶。POD電泳結果表明，5 種鐮刀菌均沒有POD同工酶譜帶。

從電泳圖譜(圖2)還可以看出，不同鐮刀菌的可溶性蛋白和同工酶譜帶不僅數量上有差異，同時相同譜帶的顏色和寬度也有差異，表明酶活性不同，酶帶越寬、顏色越深，其酶活性越高。如EST，圖譜中多隔鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的譜帶顏色最深、酶帶最寬，兩者的酶活性也最高，分別為80 109.01 U/mg和76 034.39 U/mg；再如POD，圖譜中5種鐮刀菌均無譜帶，酶活性測定結果表明，五者的酶活性也均很低，均不高于2.58 U/mg。說明同工酶圖譜與酶活性測定結果相一致。

3 結論與討論

采用分光光度法和同工酶技術對引起成年國槐根莖腐爛病的5種鐮刀菌的酶學特性進行了分析，結果表明，5 種鐮刀菌之間可溶性蛋白含量及4 種保護酶(EST、SOD、PPO和POD)活性存在顯著差異，其中，可溶性蛋白含量較低，EST和SOD的活性較高，SOD活性在2 263.09～6 134.42 U/mg，EST活性在44 224.72～80 109.01 U/mg，PPO活性較低，在82.77～191.18 U/mg，而POD的活性最低，在0.77～2.58 U/mg；5 種鐮刀菌的可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜在譜帶數量上存在差異，可溶性蛋白和EST的譜帶數量多，而POD無同工酶譜帶，同時不同菌在譜帶顏色和寬度上也存在差異，電泳結果與酶活性測定結果相一致，說明用電泳法既可鑒定某種保護酶有無同工酶，也可根據凝膠上電泳分離的酶帶的著色深淺與面積大小，半定量地確定該保護酶的活性大小。

可溶性蛋白是重要的滲透調節物質和營養物質，其積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用。多隔鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的可溶性蛋白含量相對較高，說明這2種鐮刀菌的適應能力相對較強。

酶是生物體的組成成分，不斷在體內新陳代謝，其催化作用包括正催化和負催化，活性受多方面的調控，以保障生命活動中的各種化學反應有條不紊、協調一致地進行。絕大多數酶為蛋白質，酶促反應需要溫和的條件，高溫、強酸、強堿、紫外線、有機溶劑、重金屬鹽、劇烈振蕩等易使蛋白質變性的理化因素均可導致酶變性而失去催化活性。本研究所用靶標——5種鐮刀菌，同一時間分離于國槐根莖腐爛部位，培養基及培養條件一致，繼代次數相同，其酶蛋白提取和酶活性測定方法一致，酶活性調控因子和不利的理化因素不存在或系統誤差可忽略不計。研究結果表明，供試的5 種鐮刀菌在EST、SOD、PPO和POD等酶活性指標上均存在差異，說明5 種供試鐮刀菌的適應性、侵染能力、致病能力和抗逆能力等存在差異。

SOD在生物界的分布極廣，是重要的抗氧化酶，是氧自由基的自然天敵，可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，其在生物體內的水平高低意味著機體的抗氧化能力大小和衰老程度高低；SOD參與了生物體中幾乎所有的對抗各種環境脅迫的生理生化反應，不良條件都會引起SOD活性的升高[9]。由SOD活性測定結果可以看出，5 種鐮刀菌菌體內SOD活性都很高，介于2 263.09～6 134.42 U/mg，電泳圖譜清晰，譜帶顏色較深、較明亮，其原因可能是，5種鐮刀菌均來源于腐爛病發病嚴重的國槐莖和根，營養物質含量比較低，不能為病原菌提供適宜的水分、營養物質及鹽分條件，病原菌處于逆境中，故SOD活性很高，以抵抗氧自由基對病原菌細胞造成的損害。至于具體是哪種或哪幾種逆境條件導致病原菌的SOD活性升高，有待于進一步的研究。尤其是優勢致病菌腐皮鐮刀菌的SOD活性高于其他4 種致病菌，也說明了腐皮鐮刀菌的致病性比較強。

PPO是廣泛存在于植物、動物、真菌和細菌中的金屬蛋白酶，在生物體酶促褐變、色素的合成等過程中起著關鍵的作用，能有效催化多酚類化合物氧化生成相應的醌類物質。真菌等微生物產生PPO，需要適宜的碳源、氮源、pH值、溫濕度等環境條件。供試5種鐮刀菌雖然均來源于成年國槐，但分離部位不同，且寄主植物發病的嚴重程度不同，故5種鐮刀菌的PPO活性和同工酶圖譜存在一定的差異。

POD具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的作用，供試菌株的POD活性較SOD、EST和PPO都低，說明供試鐮刀菌體內過氧化氫、酚類及胺類物質的含量比較低，供試菌株所處的環境不利于病原菌POD的合成或者不利于POD底物的形成。

種間親緣關系可以用同工酶酶譜相似度預判，相似性系數越大，酶譜差異越小，表明物種間親緣關系越近[10]。EST常被用于物種的分類鑒定，EST同工酶圖譜和形態特征一樣，也是物種的基因型與環境效應相互作用的表現型之一，其差異反映了基因型的差異，顯示出了物種間親緣關系的遠近[11]。本研究結果顯示，供試5種鐮刀菌的EST活性都比較高，同工酶圖譜譜帶數量多、顏色深，共同譜帶占23.5%，表明5種供試病原菌均屬于鐮刀菌屬；特異性譜帶占76.5%，說明5種供試病原菌分屬于不同的鐮刀菌種。李萍等[12]采用電泳技術分別對安徽不同地區的46個辣椒疫霉進行EST同工酶分析發現，辣椒疫霉EST同工酶圖譜與致病力相關。本研究在采樣分離鑒定過程中發現，國槐根莖腐爛較嚴重，說明其病原菌或部分病原菌的致病性比較強，由于本試驗沒有進行致病性強弱的研究，故較高的EST活性和清晰的同工酶圖譜是否與致病性有關還有待于進一步研究。

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Enzymatic Properties of Five DifferentFusariumSpecies

WANG Guiqing，MA Di

(College of Agronomy，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China)

The enzymatic analysis of fiveFusariumspecies causing root rot disease of adult Chinese scholar tree was carried out by colorimetry and electrophoresis,to provide a theoretical basis for classification and study on physiological differentiation ofFusarium.The results showed that the assay results of soluble protein content and enzymatic activity of four protective enzymes (EST,SOD,PPO and POD) were consistent with their electrophoresis results of the fiveFusariumspecies.For example,the SOD enzyme activities of fiveFusariumspecies were very high,in the range of 2 263.09—6 134.42 U/mg,meanwhile,their electrophoretic patterns were clear,and the color of the spectra was darker and brighter,which indicated that the activity of protective enzymes could be semi-quantitatively determined by electrophoresis.The results also showed that a significant diversity ofFusariumspecies was found in terms of spectrum change of soluble protein and isozyme including EST,SOD and PPO among those strains,and the obvious difference in the number of bands and brightness and color of bands with the same Rf value was also detected,so there were both common bands and specific bands.The common bands of EST isozyme patterns of fiveFusariumspecies accounted for 23.5%,and the specific bands accounted for 76.5%.This indicates that the five pathogens are all members of the genusFusarium,but respectively belong to differentFusariumspecies.

Fusariumsp.; enzymology; soluble protein; isozyme; enzymatic activity

2016-10-19

山東省自然科學基金項目(ZR2012CL17)；聊城市科技發展計劃項目(2014GJH10)

王桂清(1968-)，女，河北泊頭人，教授，博士，主要從事植物保護的教學與科研工作。 E-mail:wangguiqing@lcu.edu.cn

Q936

A

1004-3268(2017)04-0084-05