液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的不確定度評估

藍 草，鄒 游，歐陽少倫，吳映璇，邵琳智

（廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州 510623）

液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的不確定度評估

藍 草，鄒 游，歐陽少倫，吳映璇，邵琳智

（廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州 510623）

建立了液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中5種硝基咪唑類藥物殘留量的不確定度評估數學模型，以甲硝唑為例，分別對測量過程中的樣品稱量、樣品前處理、標準曲線定量、重現性和偏差及儀器定量等不同來源的不確定度進行分析評定，計算得到該方法測定硝基咪唑類藥物殘留量的相對合成不確定度和擴展不確定度。結果表明，標準曲線定量和儀器定量對該方法不確定度的貢獻最大。

不確定度；液相色譜-串聯質譜法；硝基咪唑類

硝基咪唑（Nitroimidazoles）類藥物是近年來廣泛使用的一類抗菌素和抗原蟲藥，能抑制細胞DNA合成、破壞DNA的雙螺旋結構或阻斷其轉錄復制，從而使細胞死亡，達到殺菌和控制感染的目的。但是，由于硝基咪唑類藥物含有的硝基雜環類化合物具有細胞誘變性，從而導致此類藥物具有致癌和潛在致畸作用，被大多數國家列為禁止使用或允許使用但必須嚴格監控的藥物[1]。

試驗建立了同時檢測動物源性食品中5種硝基咪唑類藥物殘留量的液質聯用法，并對分析測試結果的不確定度進行評定，以驗證方法的準確性[2]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數，是度量化學分析工作結果的可信度，即期望結果與分析結果的相吻合程度，以此來證明結果適宜性的有用方法[3]。

測量不確定度是對測量結果質量的定量表征[4]，一個完整的測量結果，除了給出被測量的最佳估計值之外，還應同時給出測量結果的不確定度[5]。檢測結果的不確定度反映了結果的可靠性，同時可以反映出檢測實驗室人員的技術和儀器設備的水平[6]。試驗參考《CNALS-GL06化學分析中不確定度的評估指南》中不確定度的理論依據，建立了液質聯用法檢測動物源性食品中5種硝基咪唑類藥物殘留量的不確定度評估數學模型，分別對測量過程中的樣品稱量、樣品前處理、標準曲線定量、重現性和偏差及儀器定量等不同來源的不確定度進行分析評定，計算得到該方法測定硝基咪唑類藥物殘留量的相對合成不確定度和擴展不確定度。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

QTRAP5500型四極桿串聯質譜儀，美國AB質譜公司產品；LC-20AD型液相色譜儀（二元高壓梯度輸液泵，自動進樣器，柱溫箱，電噴霧離子源，Valco二位流路切換閥），島津公司產品；Analyst儀器控制及數據處理軟件，AB公司產品；CPA22SD型分析天平、BT 124S型分析天平，Sartorius公司產品；Zymark TurboVapLV吹氮濃縮儀，配有35 mL大號氮吹濃縮管、16 mL中號氮吹濃縮管；SiGMA 3-18K型低溫高速離心機、1-14型高速離心機；肉類組織搗碎機；勻漿機，轉速滿足12 000 r/min以上，配備直徑19 mm勻漿刀；MS3 basic型漩渦振蕩器，IKA公司產品；Heidolph型水平振蕩器；固相萃取裝置及真空泵。

1.2 試劑與材料

甲硝唑、羥基甲硝唑、二甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑和洛硝噠唑等5種標準物質純度均大于98%，德國Dr.E公司提供；乙腈、甲醇為HPLC級，Fisher Scientific公司提供；甲酸為專業分析級，Merck公司提供；所用試劑除注明外均為分析純；水為超純水；混合型陽離子交換固相萃取柱（MCX），60 mg/mL（Waters OasisMCX）。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 標準儲備液

分別稱取10 mg（準確至0.01 mg）硝基咪唑類標準品至25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻。此儲備液質量濃度為400 mg/L，置于-18℃冰箱中保存，保存期1年。

1.3.2 標準中間液

分別吸取0.625 mL各標準儲備液（詳見1.3.1）至25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，混勻。此標準中間液質量濃度為10.0 mg/L，保存期6個月。

1.3.3 標準混合工作液A

準確吸取0.250 mL標準中間液（詳見1.3.2）至25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，混勻。此標準混合液質量濃度為100 μg/L，保存期3個月。

1.3.4 標準混合工作液B

在玻璃試管中準確加入0.900 mL甲醇溶液和0.100 mL標準混合工作液A（詳見1.3.3），混勻。此標準混合液質量濃度為10.0 μg/L，現配現用。

1.3.5 同位素內標儲備液

分別稱取10 mg（準確至0.01 mg）硝基咪唑類同位素內標至25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻。此同位素內標儲備液質量濃度為400 mg/L，置于-18℃冰箱中保存，保存期1年。

1.3.6 同位素內標中間液

分別吸取0.625 mL各同位素內標儲備液（詳見1.3.5）至25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，混勻。此同位素內標中間液質量濃度為10.0 mg/L，保存期0.5年。

1.3.7 同位素內標混合工作液

準確吸取0.250 mL同位素內標中間液（詳見1.3.3）至25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，混勻。此同位素內標混合工作液質量濃度為100 μg/L，保存期3個月。

1.3.8 標準曲線配制

標準曲線配制見表1，標準曲線配制見表2。

表1 標準曲線配制

表2 標準曲線配制

按表1和表2準確吸取一定量的硝基咪唑類標準混合工作液A（詳見1.3.3）和標準混合工作液B（詳見1.3.4）、同位素內標混合工作液（詳見1.3.7）、定容液于液相色譜進樣瓶中，搖勻備用。該標準曲線溶液即配即用。

1.4 提取與凈化

稱取5 g制備好的樣品（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，準確加入100 μL質量濃度為100 μg/L的同位素內標混合工作液，靜置10~30 min。加入12 mL乙酸乙酯，在勻漿機中以轉速12 000 r/min勻漿30 s，取另1個50 mL離心管，加入12 mL乙酸乙酯洗滌勻漿刀10 s，不合并。提取液以轉速4 500 r/min離心5 min，上清液轉移至35 mL氮吹濃縮管中，40℃氮吹濃縮至大約剩余2 mL。洗滌液轉入前1個含樣品的離心管中，用玻棒搗碎下層殘渣，在水平振蕩器上振蕩10 min，以轉速4 500 r/min離心5 min，上清液合并至氮吹濃縮管中，于40℃條件下繼續吹氮濃縮至干。

向上述已吹干的濃縮管中加入5 mL正己烷，渦旋振蕩1 min溶解殘渣，轉移至50 mL離心管中。再向氮吹濃縮管中加入5 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液，渦旋振蕩1 min，合并至正己烷的離心管中。水平振蕩離心管10 min，以轉速4 500 r/min離心5 min，將上層正己烷去除干凈，下清液備用。

將下清液通過已用3 mL甲醇和3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液活化的MCX柱中，流速維持在1 mL/min。然后依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、2 mL淋洗液（2%甲酸+甲醇，95+5，V/V）淋洗，真空抽干。用3 mL洗脫液（甲醇+水+氨水，80+20+2，V/V）洗脫，流速維持在1 mL/min，真空抽干，收集洗脫液，于40℃條件下氮氣吹干。殘渣用1.0 mL定容液（5 mmol/L甲酸溶液+甲醇，9+1，V/V）溶解定容，漩渦振蕩器上振蕩2 min，經0.2 μm濾膜過濾后上機測定。

2 數學模型

式中：X——樣品中被測組分的質量分數，μg/kg；

C——回歸方程擬合得到的樣品溶液質量濃度，μg/mL；

V——樣液最終定容體積，mL；

m——所稱樣品的質量，g；

D——稀釋因子，該方法中D=1；

fr——重現性和偏差影響因子，由方法規定其值為1；

fQ——液質聯用儀定量校正影響因子，由方法規定其值為1。

3 不確定度來源及其評定

參考相關文獻[7-8]，以甲硝唑為例，根據試驗方法和數學模型分析，測量的不確定度主要來源于樣品稱量、樣品前處理、標準曲線定量、重現性和偏差及儀器定量。

不確定度分量來源見圖1。

圖1 不確定度分量來源

3.1 樣品稱量引入的不確定度Umrel

3.1.1 取樣

試驗將待測樣品用組織粉碎機搗碎，均分成2份，作為試樣，可認為樣品是均勻的、代表性充分，由此導致的不確定度忽略不計。

3.1.2 稱質量

精度為0.01 g的天平計量檢定證書給出的擴展不確定度Um為0.03 g，屬于正態分布，對于大約95%的置信水平，包含因子k值為2，稱質量5.00 g，按B類評定，其相對不確定度為：

3.2 樣品前處理引入的不確定度Uvrel

分析該方法樣品前處理過程，可以發現影響試驗不確定度的操作主要有3個，即內標溶液的加入，標準工作液的加入和樣品的定容，分別對這3個來源進行分析。

3.2.1 樣品溶液同位素內標混合工作液加入引起的不確定度

樣品溶液同位素內標混合工作液加入引起的不確定度主要包括移液槍誤差、實驗室溫度不同引起的體積差異所帶來的不確定度。已知200 μL移液槍的容量允差為±1.33 μL，移液槍誤差引入不確定度屬于矩形分布，按B類評定，

實驗室溫度變化為±3℃，甲醇在20℃的膨脹系數為0.001 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（K=1.96） 體積變化區間為±（100×3×0.001 2）= ±0.36 μL，轉換成標準偏差即：

故樣品溶液同位素內標混合工作液加入引起的相對不確定度為：

3.2.2 樣品溶液標準工作液加入引起的不確定度

與同位素內標混合工作液加入引起的不確定度相同，標準工作液加入引起的不確定度包括移液槍誤差、溫度不同引起的體積差異所帶來的不確定度。省略計算過程，得到標準工作液加入引起的相對不確定度為：

3.2.3 樣品溶液定容引起的不確定度

樣品溶液定容引起的不確定度同樣包括移液槍誤差、溫度不同引起的體積差異所帶來的不確定度。1 000 μL移液槍的容量允差為±4.44 μL，屬于矩形分布，按B類評定，

實驗室溫度變化為±3℃，水溶液在20℃的膨脹系數為0.000 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（K=1.96）體積變化區間為±（1 000×3×0.000 2）=± 0.6 μL，轉換成標準偏差即：

樣品溶液定容引起的相對不確定度為：

故樣品前處理引入的相對不確定度為：

3.3 標準曲線定量引入的不確定度Ucrel

標準曲線定量引入的不確定度主要包括原始標準物質、標準溶液配制、標準曲線配制和標準曲線擬合等所帶來的不確定度，內標溶液的配制過程不影響結果的不確定度。

3.3.1 原始標準物的不確定度

甲硝唑標準物質證書標明的純度為98.7%，給出的擴展不確定度U為0.5%，屬于正態分布，對于大約95%的置信水平，包含因子k值為2。按B類評定，故甲硝唑原始標準物的不確定度為：

3.3.2 標準溶液配制過程引入的不確定度

標準溶液配制過程主要分為標準儲備液配制、標準中間液配制、標準混合工作液A配制及標準混合工作液B配制，分別對這4個過程的不確定度進行評估。

（1）標準儲備液配制引入的不確定度。標準儲備液配制引入的不確定度主要包括標準物質稱質量和容量瓶定容所帶來的不確定度，其中標準物質稱質量采用的是精度為0.1 mg的天平，其計量檢定證書給出的是其擴展不確定度Ux為0.05 mg，屬于正態分布，對于大約95%的置信水平，包含因子k值為2。

稱質量10 mg，按B類評定，其相對不確定度為：

采用25.00 mL容量瓶定容，A級容量允差為±0.000 04 mL，屬于矩形分布，按B類評定，容量瓶誤差帶來的不確定度：

容量瓶定容變異系數為0.000 24，定容至刻度變動性引起的不確定度：

u2(2)=容量瓶體積×定容變異系數

=25.00 mL×0.000 24=0.006 0 mL.

實驗室溫度變化為±3℃，甲醇在20℃的體積膨脹系數為0.001 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（K=1.96）體積變化區間為±（25.00×3×0.001 2）=±0.09 mL，溫度變化引起的不確定度為：

故25.00 mL容量瓶定容過程引起的相對不確定度為：

標準儲備液配制引入的不確定度為：

（2）標準中間液配制引入的不確定度。標準中間液配制引入的不確定度主要包括容量瓶定容及1 mL移液槍移液625 μL所產生的不確定度，其中25.00 mL容量定容引入的相對不確定度計算方法同上；而移液槍移液引入的不確定度主要包括移液槍誤差、溫度不同引起的體積差異所帶來的不確定度。1 mL移液槍的容量允差為±4.44 μL，屬于矩形分布，按B類評定，

實驗室溫度變化為±3℃，甲醇在20℃的體積膨脹系數為0.001 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（K=1.96）體積變化區間為±（625×3×0.001 2）= ±2.25 μL，轉換成標準偏差即：

由1 mL移液槍移液625 μL引起的相對不確定度為：

故標準中間液配制引起的相對不確定度為：

（3）標準混合工作液A配制引入的不確定度。標準混合工作液A配制引入的不確定度同樣包括容量瓶定容及移液槍移液所產生的不確定度，計算方法同3.3.2（2），結果如下：

由1 mL移液槍移液250 μL引起的相對不確定度為：

標準混合工作液A配制引起的相對不確定度為：

（4）標準混合工作液B配制引入的不確定度。標準混合工作液B配制引入的不確定度主要包括1 mL移液槍移液900 μL及200 μL移液槍移液100 μL所產生的不確定度。

1 mL移液槍的容量允差為±4.44 μL，屬于矩形分布，按B類評定，

實驗室溫度變化為±3℃，甲醇在20℃的體積膨脹系數為0.001 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（K=1.96）體積變化區間為±（900×3×0.001 2）=±3.24 μL，轉換成標準偏差即：

由1 mL移液槍移液900 μL引起的相對不確定度為：

200 μL移液槍容量允差為±1.33 μL，屬于矩形分布，按B類評定，

實驗室溫度變化為±3℃，甲醇在20℃的膨脹系數為0.001 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（K=1.96）體積變化區間為±（100×3×0.001 2）= ±0.36 μL，轉換成標準偏差即：

由200 μL移液槍移液100 μL引起的相對不確定度為：

故標準混合工作液B配制引起的相對不確定度為：

3.3.3 標準曲線配制引入的不確定度

標準曲線配制的不確定度主要是移液槍移液所產生，實驗室溫度變化為±3℃，水溶液在20℃的膨脹系數為0.000 2℃-1，屬于正態分布，則95%置信概率時（k=1.96）吸取900，850，800，700 μL體積變化區間分別為±0.54 μL，±0.51 μL，±0.48 μL，±0.42 μL，計算其標準偏差分別為0.28，0.26，0.24，0.21 μL。由此可得1 mL移液槍分別吸取900，850，800，700 μL水溶液時的相對不確定度分別為0.29%，0.30%，0.32%，0.37%。同理，已知甲醇在20℃的膨脹系數為0.000 2℃-1，可得200 μL移液槍分別吸取200，100，50 μL甲醇溶液時的相對不確定度分別為0.42%，0.79%，1.55%。

根據其移液次數，可得標準曲線配制引入的相對不確定度為：

3.3.4 標準曲線擬合引入的不確定度

測定5個濃度水平的標準溶液，得到相應的待測物峰面積與內標峰面積的比值，用最小二乘法擬合得到直線方程y=a+bx。

最小二乘法擬合標準曲線結果見表3。

對樣品液進行15次測定，由直線方程求得平均質量濃度xpred=7.59μg/kg，則xpred的標準不確定度為yobs

表3 最小二乘法擬合標準曲線結果

式中：uXpred——最小二乘法擬合曲線引入的不確定度；

S(y)——標準溶液待測物質信號殘差的標準差（貝塞爾公式）；

P——樣品溶液測定次數；

n——標準溶液測定次數；

a——截距；

b——斜率；

xpred——樣品溶液中待測物質的含量；

x——標準溶液中待測物質含量的測定平均值；

xpredi——標準溶液各點的待測物質含量；

yobs——標準溶液各點的待測物質信號響應值；

y——根據標準曲線計算得到的待測物質信

號響應回歸值。

其中，a=-0.005 65，b=0.093 2，P=15，n=6，

故標準曲線定量引起的相對不確定度為：

3.4 重現性和偏差引入的不確定度

3.4.1 精密度研究

在樣品中添加0.5 μg/kg的混合標準工作液，做6個平行樣品測定甲硝唑的回收率。標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

6個平行樣品中甲硝唑的加標回收及相對標準偏差見表4。

3.4.2 偏差引入的不確定度

表4 6個平行樣品中甲硝唑的加標回收及相對標準偏差

分析程序的偏差是通過在實驗室內部確認研究中使用標準添加樣品來進行研究的。將收集的2015年連續12個月共36個批次的標準添加回收。

甲硝唑標準添加回收結果見表5。

表5 甲硝唑標準添加回收結果

故重現性和偏差引起的相對不確定度為：

3.5 液相色譜-串聯質譜儀定量引入的不確定度urel(fQ)

參照JJF 1317—2011液相色譜-質譜聯用儀校準規范用5 μg/L的硝基咪唑標準溶液和10 μg/L的內標溶液對液質聯用儀進行校準，連續進樣6次，每次進樣體積為5 μL。

6次信噪比比值結果見表6。

表6 6次信噪比值結果

試驗標準偏差S=0.032。其中，測量重復性為A類不確定度，其他為B類不確定度。

3.5.1 測量重復性urA

測量重復性可以通過計算6次測量平均值的相對標準偏差得到

式中：z——甲硝唑信噪比測量結果與甲硝唑內標信噪比測量結果的比值，為6次測量的平均值；

zj——第j次測量的信噪比比值；

j——測量次數

s——試驗標準偏差。

3.5.2 溶液標準物質質量濃度的相對不確定度ur(c)

包括前面標準溶液配制所帶來的所有誤差、稀釋至5 μg/L移液槍誤差、溫度不同引起的體積差異所帶來的不確定度，以及內標溶液稀釋至10 μg/L移液槍誤差、實驗室溫度不同引起的體積差異所帶來的不確定度，計算過程同上，結果如下：

標準工作液加入引起的相對不確定度為：

內標溶液加入引起的相對不確定度為：u9rel=0.79%故溶液標準物質質量濃度的相對不確定度為：

3.5.3 進樣體積的相對不確定度

采用的進樣量V=5 μL，容量允差為±0.015 μL，屬于矩形分布，按B類評定，

3.5.4 噪聲強度測量的不確定度ur(Hn)

噪聲強度的A類不確定度已經在“測量重復性”中計算，該項為噪聲強度的B類不確定度。在實際計算中，將譜圖放大后從軟件上讀取噪聲強度，該項不確定度極小，可忽略。

故液質儀器校準引起的不確定度為：

3.6 相對合成標準不確定度和相對擴展不確定度

甲硝唑測量不確定度分量見表7。

表7 甲硝唑測量不確定度分量

不考慮以上各不確定度的相關性，可得動物源性食品中甲硝唑殘留的相對合成標準不確定度為：

在95%置信區間，取包含因子k=2，甲硝唑的測定含量相對擴展不確定度為：

通過同樣的計算過程可以得到在95%置信區間，羥基甲硝唑、二甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑和洛硝噠唑的相對擴展不確定度分別為11.0%，11.4%，11.2%，11.3%。

4 結論

通過對動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留檢測方法不確定度各來源的評定，可以知道該方法的不確定度主要是由標準曲線定量和液質聯用儀器定量引起，樣品稱量的不確定幾乎可以忽略不計。因此在實際工作中，應加強標準操作規程訓練，減少試驗過程中人為因素產生的誤差，并定期對試驗儀器進行校準和維護，保持穩定的狀態。在實際檢測中，某動物源性食品的液相色譜-串聯質譜法測量甲硝唑的含量結果為0.49 μg/kg，經考慮其測量不確定度=0.49 μg/kg×10.6%=0.05 μg/kg，則其結果應表達為0.49±0.05 μg/kg。

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Evaluation of Uncertainty in Determination of Nitroimidazoles Residues in Foodstuffs of Animal Origin by LC-MS/MS

LAN Cao，ZOU You，OUYANG Shaolun，WU Yingxuan，SHAO Linzhi
（Inspection and Quarantine Technology Center，Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510623，China）

This study establish a mathematical model for evaluation of the uncertainty in determination of 5 kinds of nitroimidazoles residues in foodstuffs of animal origin by high performance liquid-MS/MS（LC-MS/MS），and analyze the uncertainty of different sources such as sample weighting，filtrating，the standard curve fitting，measuring repeatability and LC-MS/MS quantify.By calculating the components of all uncertainties，relative combined standard uncertaintyand expand uncertainty，we obtain a report of uncertainty of nitroimidazoles.The results show that the main source of the uncertainty comes from the standard curve fitting and LC-MS/MS quantify.

uncertainty；liquid chromatography-tandem mass spectrometry；nitroimidazoles

TS254.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.038

1671-9646（2017）02b-0035-06

2017-01-18

廣東省省級科技計劃項目（2015A030401075）；廣東檢驗檢疫局科技計劃項目（2015GDK10）。

藍 草（1988— ），女，碩士，助理工程師，研究方向為獸藥殘留檢測。