STZ誘導糖尿病大鼠新物體識別能力的動態監測

吳 雪，周 游，李佳麗，劉 蕊，趙 瑛

(哈爾濱商業大學 藥學院，哈爾濱 150076)

STZ誘導糖尿病大鼠新物體識別能力的動態監測

吳 雪，周 游，李佳麗，劉 蕊，趙 瑛

(哈爾濱商業大學 藥學院，哈爾濱 150076)

研究鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病(DM)大鼠模型在造模80 d內，新物體識別能力的動態變化.60 mg/kg腹腔注射STZ，72 h后檢測空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型復制成功，記錄DM模型的成模率；模型制備第40、55、70天采用大鼠行為儀以接觸次數、相對識別指數為指標，檢測大鼠新物體識別行為的變化并記錄空腹血糖變化及整個實驗期間的死亡率.結果表明, 造模72 h后DM的成模率為90%，整個實驗期間的死亡率為21.7%；模型組的空腹血糖在造模第3、30、60、80天顯著高于對照組(P<0.01)；模型組大鼠在造模第40d對新物體的相對識別指數與對照組無顯著性差異(P>0.05)，在造模第55、70天顯著低于對照組(P<0.05)，模型組大鼠在造模第40、55、70天對新物體的探究次數均顯著低于對照組(P<0.05). 以60 mg/kg的劑量腹腔注射STZ造模的DM大鼠在造模第55天開始出現新物體識別障礙，持續至70 d.

糖尿??；認知損害；新物體識別

DM致認知損害的發病過程隱秘，進一步發展就會形成癡呆，因此DM所致的認知功能障礙引起越來越多人的關注[1]，在癡呆發生之前認知損害常常是被忽略的，如果在認知障礙的初級階段加以干預，可以有效延緩癡呆的發生.由于目前多采用Morris水迷宮檢測學習記憶能力，但其記憶保持時間長的特殊性，不能對動物學習記憶行為進行連續的動態監測，因此我們嘗試選用新物體識別方法動態觀察認知損害的發病過程 .新物體識別方法是在自然狀態下測量動物非空間工作記憶的行為模型[2].目前通過新物體識別方法研究DM致認知損害的發病過程未見報道[3-4].因此本實驗通過60 mg/kg腹腔注射STZ復制DM大鼠模型，采用新物體識別方法動態監測DM致認知損害的發病過程.

1 實驗材料

1.1 實驗動物及飼養條件

雄性Wistar大鼠46只，8～11周齡，體重(250±20)g由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，合格證號201600013063.實驗動物采用獨立通氣籠飼養，溫度(20～22) ℃，濕度45%～55%，換氣次數34次/h，每籠4只，實驗動物采用標準飼料喂養，實驗期間可自由攝食、飲水.

1.2 實驗試劑及設備

STZ(北京博愛科貿有限公司，Sidma-S0130)，葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業有限公司，20141105147)，血糖儀(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，悅準血糖儀11型)，獨立通氣籠(S8蘇州市蘇杭科技器材有限公司)，精密pH計(上海虹益儀器儀表有限公司，PHS0-3C)，分析天平(上海越平科學儀器有限公司，FA1004)，酶標分析儀(RAYTO公司，RT-6000)，新物體識別裝置箱(64cm*43cm*30cm)，三套新物體(每套分別含兩種物體，自制)，計時器.

2 實驗方法

2.1 STZ溶液配制

檸檬酸(A)：2.10 g檸檬酸溶于100 mL蒸餾水；檸檬酸鈉(B)：2.94 g檸檬酸鈉溶于100 mL蒸餾水；A液、B液按1∶1.32比例混合，測定pH值，調節pH值為4.2～4.5，微孔濾膜(Φ=0.22 μm)過濾除菌，置于4 ℃冰箱備用.STZ粉末以上述緩沖溶液配成1%的溶液，現用現配，避光冰浴，溶解后立即注射，在10 min內注射完畢.

2.2 動物分組及模型復制

動物適應性喂養1周后，按體重隨機分為對照組(n=16)，模型組(n=30).實驗動物禁食不禁水12 h，模型組以“2.1”項下配制的STZ按60 mg/kg的劑量腹腔注射，對照組注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，注射2 h后給食.以72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準[5-6]，達到此標準的動物納入實驗.

2.3 血糖測定

取造模72 h時的空腹血，3 500 r/min離心10 min取上清，采用葡萄糖氧化酶法進行血糖測定，空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L為造模成功.且分別在造模后的第30、60、80天用血糖儀對大鼠進行空腹血糖測定，超出血糖儀檢測限的記為33.3 mmol/L.

2.4 新物體識別能力檢測

2.4.1 大鼠新物體興趣測試

將3套(每套均含1號物體和2號物體)新物體同時置于箱內，用秒表記錄大鼠對幾個不同物體的探究次數及探究時間，結果顯示同一只鼠對三套物體的探究次數及探究時間無顯著性差異(P>0.05).因此在正式試驗中選用這三套物體進行新物體識別能力測試.

2.4.2 新物體識別方法

新物體識別實驗過程分為3個階段：適應期、熟悉期和測試期[7].適應期為2 d，每天上下午分別將動物依次放入沒有任何物體的實驗箱內，適應環境5 min.第3天，熟悉期實驗，將兩個完全相同的物體放入實驗箱內對稱的位置處，兩物體距離側箱壁、箱后壁的距離均為10 cm.讓大鼠在試驗箱內自由探索5 min[8].24 h之后進行測試期實驗，將其中一個熟悉期使用的物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新物體，分別記錄動物對新物體探究的平均速度、路程、探究次數及對兩個不同物體的探究時間.用相對識別指數(relative discrimination index)來評價動物的學習記憶能力[9].相對識別指數的計算為N/(N+F)×100%，其中N(new)為新物體探索時間，F(familiar)為熟悉物體探索時間.在每次進行實驗時，需清理上次實驗時大鼠在活動箱內的排泄物，并用酒精擦拭活動箱，以消除對下只鼠實驗的影響[10].

2.5 代謝情況考察

代謝籠中放入定量的食、水，動物放入代謝籠中自由攝食、飲水，12 h后計算大鼠的食量、水量、尿量及體重.分別在模型成立后第6、30、60、80天對以上指標進行檢測[11].

2.6 數據統計

應用SPSS 17.0 For Windows統計軟件，正態分布采用方差分析進行數據資料處理，作方差齊性檢驗，P>0.05為方差齊性，P<0.05為方差不齊.方差齊性時，組間比較采用LSD檢驗.方差不齊時，采用多重比較Tamhane檢驗.結果均以平均值±標準差(X±S)表示.P<0.05為有顯著性差異；P<0.01為有非常顯著性差異.

3 實驗結果

3.1 成模率、死亡率及代謝情況

本次實驗以造模72 h空腹血糖≥16.7 mmol/L為成模標準，有27只大鼠成模，成模率為90%，80 d時兩組大鼠共死亡10只(對照組死亡2只，模型組死亡8只)，死亡率為21.7%，且模型組大鼠在成模第3、30、60、80天，空腹血糖與對照組均有非常顯著差異(P<0.01).模型組的食量與體重，在造模第6天與對照組無顯著性差異(P>0.05)，在造模第30、60、80天均與對照組有顯著性差異(P<0.05)，模型組的水量與尿量在造模第6、30、60、80天顯著高于對照組(P<0.05)見表1,2.

表1 空腹血糖變化(FBG/(mmol·L-1))

注：與對照組相比，**P<0.01說明有非常顯著性差異

表2 大鼠食量、水量、尿量、體重變化

注：與對照組相比，*P<0.05說明有顯著性差異，**P<0.01說明有非常顯著差異

3.2 新物體識別能力

與對照組相比，模型組大鼠對新物體探究路程與平均速度在造模第40、55、70天無顯著性差異(P>0.05)，故可排除運動能力的影響，對新物體的探究次數在造模第40、55、70天顯著降低(P<0.01)，相對辨別指數在造模第40天無顯著性差異(P>0.05)，在造模第55、70天顯著降低(P<0.05).見表3.

表3 測試期兩組大鼠對新物體的探究次數與相對辨別指數

注：與對照組相比，*P<0.05說明有顯著性差異，**P<0.01說明有非常顯著性差異

4 討 論

本實驗前期根據動物體重范圍，通過腹腔注射STZ以55、60、65 mg/kg的劑量進行預實驗，結果證明60 mg/kg的劑量成模率高，故正式實驗以60 mg/kg劑量一次性腹腔注射復制DM模型.空腹血糖顯示，全部造模動物一直維持高血糖狀態，且模型組大鼠一直維持“三多一少”癥狀，可以看出本實驗所建立的DM模型在80 d內穩定.

新物體識別實驗在近些年應用廣泛，在國內外的研究日趨增多.它主要用于嚙齒類動物非空間及短期對物體的辨別記憶能力的檢測.整個實驗過程分為：適應期，熟悉期及測試期，由于熟悉期與測試期之間的間隔時間文獻中不盡相同，大多以間隔2h和24h居多，因此本實驗前期通過設置間隔2h和24h分別進行預實驗，結果證明間隔24h時，模型組與對照組的實驗結果差異性更加明顯，故正式實驗采用熟悉期與測試期間隔24h.

綜上所述，以60mg/kg腹腔注射STZ造模的DM大鼠在造模第40d，模型組大鼠的相對辨別指數與對照組無顯著性差異，而在第55、70天顯著減少，說明DM大鼠在造模第55天開始出現新物體識別障礙，并持續至70d.本實驗的進行，為DM認知損害的早期發現、預防及藥物干預的研究提供了一定實驗依據.

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Dynamic monitoring of new object recognition ability of STZ induced diabetic rats

WU Xue, ZHOU You, LI Jia-li, LIU Rui, ZHAO Ying

(School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To study the dynamic change of new object recognition ability of streptozotocin(STZ)-induced diabetic rat model in 80 days. Normal rats were treated with intraperitoneal injection of STZ of 60 mg/kg to establish model. On the 3rd day, fasting plasma glucose levels was detected, when the value was over 16.7 mmol/L the modeling was successful. The success rate of MD model was recorded. Preparation model 40 d, 55 d, 70 d with large mouse behavior to contact the instrument number, relative identification index as an indicator to detect changes in rat new object recognition behavior, in addition, record the mortality rate and fasting glucose during the experiment. The mold forming rate was 90% in third days, the mortality rate during the experiment was 21.7%; The model group of fasting blood glucose in third days, 30 days, 60 days, 80 days were significantly higher than control group (P<0.01)；control group and model group there was no significant difference in 40 days of relative recognition index(P>0.05), the model group, in 55 days，70 days was significantly lower than control group (P<0.05)；the model group, in 40 days，55 days，and 70 days of the new object exploring times were significantly lower than control group (P<0.05). The diabetic rat model established by intraperitoneal injection with the dose of 60 mg/kg in 55 days began to appear new object recognition obstacle, and continued to 70 days.

diabetes mellitus; cognitive impairment; new object recognition

2016-11-17.

國家自然科學基金資助項目(81373548)

吳 雪(1990-)，女，碩士，研究方向：中藥防治重大疾病

趙 瑛(1960-)，女，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：中藥防治重大疾病

R285

A

1672-0946(2017)02-0135-03