原花青素白藜蘆醇漿亞慢性毒性評價及抗氧化功能研究

楊艷，張揚，汪春梅，陳璐，何華鎣，溫敏，謝惠波,*

（1.西南醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，四川瀘州646000；2.西南醫科大學公共衛生學院，四川瀘州646000）

原花青素白藜蘆醇漿亞慢性毒性評價及抗氧化功能研究

楊艷1，張揚1，汪春梅1，陳璐2，何華鎣2，溫敏2，謝惠波1,*

（1.西南醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，四川瀘州646000；2.西南醫科大學公共衛生學院，四川瀘州646000）

評價原花青素白藜蘆醇漿亞慢性毒性，并初步研究其抗氧化功能，為開發其保健功效提供科學依據。采用大鼠90天喂養試驗對原花青素白藜蘆醇漿的亞慢性毒性進行評價，并在實驗末采血測定血清抗氧化指標。90天喂養試驗結果顯示花青素白藜蘆醇漿對大鼠各項指標未產生毒副作用，其最大無作用劑量（NOAEL）大于7.5 g/kg·BW。雌、雄大鼠各劑量組血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平均有2個～3個劑量組顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），高劑量組雌、雄大鼠血清丙二醛（MDA）含量低于對照組（P＜0.01）。原花青素白藜蘆醇漿在本實驗條件下未見有亞慢性毒性，血清抗氧化指標檢測結果提示原花青素白藜蘆醇漿具有一定抗氧化功能。

原花青素白藜蘆醇漿；亞慢性毒性；大鼠；血清；抗氧化

野生山枇杷，又名皺葉莢蒾、枇杷葉莢蒾、山枇杷、毛羊屎樹、野枇杷、黑漢條子等，屬忍冬科莢蒾屬植物，一般高4米，生命力旺盛，耐旱、耐熱、耐澇，花期4月～5月，果熟期9月～10月。根據有關古籍記載，具有一定的保健功效。以野生山枇杷為主要原料的原花青素白藜蘆醇漿（因檢測含有原花青素和白藜蘆醇而命名）被研制成功，經近5年的少量志愿者人群試用，未發現不良反應。為了解原花青素白藜蘆醇漿大劑量及長期食用是否安全，本研究選擇90天喂養試驗評價其亞慢性毒性，并對其抗氧化功能進行初步研究，為其保健食品的闡明提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 受試物

原花青素白藜蘆醇漿，為暗紅色的粘稠液體，由四川省古藺縣吉利果品有限公司提供，其生產工藝已獲得國家發明專利。

1.2 實驗動物

清潔級健康SD大鼠（80只，體重90 g～110 g，雌雄各半。）：由由西南醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證SCXK（川）2013-17；實驗動物使用許可證SYXK（川）2013-06。動物飼養環境溫度20℃～25℃、相對濕度50%～70%。

1.3 儀器與試劑

BC-6900全自動血液細胞分析儀：深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；SELECTRA Junior全自動生化分析儀：荷蘭威圖公司；Versamax連續波長酶標儀：美國分子儀器公司。

谷丙轉氨酶（ALT），谷草轉氨酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、血糖（Glu）、總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）和白蛋白（Alb）測定試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 動物分組方法[1]

大鼠適應性喂養7 d后，將動物隨機分成4組：即低、中、高劑量組和對照組，每組20只，雌雄各半。原花青素白藜蘆醇漿低、中、高劑量組分別按人推薦劑量的50、100、150倍按2.5、5.0、7.5 g/kg·BW劑量的原花青素白藜蘆醇漿灌胃90 d，對照組給予等體積純凈水。每天每只大鼠按1mL/100g·BW定時經口灌胃。連續喂養90 d。實驗期間所有動物單籠飼養，自由進食、飲水。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 一般情況、體重及食物利用率

每日觀察動物的一般活動、癥狀和死亡情況，每周記錄體重和進食量并計算食物利用率。

1.5.2 血常規、血清生化指標、血清抗氧化功能指標檢測

實驗期末各組大鼠禁食16 h，準確稱取大鼠體重，按體重腹腔注射2%戊巴比妥鈉45mg/kg（2.25ml/kg）麻醉，腹主動脈采血，進行血常規檢測，離心分離血清進行血清生化指標、抗氧化功能相關指標的檢測。

1.5.3 臟器重量、臟器系數及病理組織學觀察

采血后，取肝、腎、脾、胃、十二指腸和性腺（睪丸或卵巢）進行大體解剖學觀察，并對大鼠臟器進行稱重，根據公式計算其臟器系數：臟器系數/%=臟器重量/體重×100。然后以10%甲醛固定，按常規切片、HE染色，進行病理組織學檢查。

1.6 統計方法

所有數據用EpiData3.0建立的數據庫進行數據錄入，采用SPSS22.0統計軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，各指標采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠生長發育的影響

實驗期間各組大鼠生長良好，一般狀況如行為、活動、毛色光澤、精神狀況、飲水及糞便均未見明顯異常。雌、雄鼠試驗期間體重增長值、進食量、食物利用率總體比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠體重變化及進食情況Table1 Weightgain and food-intakeof rats in 90-days feeding test（n=10，±s）

表1 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠體重變化及進食情況Table1 Weightgain and food-intakeof rats in 90-days feeding test（n=10，±s）

性別劑量/（g/kg·BW）增重/g進食量/g食物利用率/%雄對照組331.0±36.0 2 012.3±41.6 16.4±1.7 2.5 305.6±35.8 2 006.3±28.7 15.2±1.6 5.0 309.4±25.3 1 985.6±29.4 15.6±1.2 7.5 307.5±25.1 1 987.0±40.4 15.5±1.2雌對照組172.6±18.3 1 649.4±42.9 10.6±1.2 2.5 162.3±14.4 1 619.8±38.6 9.9±0.8 5.0 168.9±27.2 1 610.1±44.6 10.5±1.7 7.5 161.7±11.2 1 597.6±29.7 10.1±0.7

2.2 對大鼠血液學指標的影響

各項血常規指標總體比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗末期各組大鼠血常規指標檢查結果Table2 Routineblood cellexam ination at theend of 90-days feeding test（n=10，±s）

表2 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗末期各組大鼠血常規指標檢查結果Table2 Routineblood cellexam ination at theend of 90-days feeding test（n=10，±s）

性別劑量/（g/kg·BW）白細胞/（109個/L）紅細胞/（1012個/L）血紅蛋白/（g/L）血小板/（109個/L）淋巴細胞/%雄對照組4.95±1.44 8.53±0.36 155.40±7.45 1045.00±104.31 76.98±6.31 2.5 5.18±1.74 8.42±0.22 151.70±3.71 1057.20±90.33 71.60±5.42 5.0 6.58±2.04 8.38±0.26 153.80±4.57 967.50±151.47 71.76±7.32

續表2 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗末期各組大鼠血常規指標檢查結果Continut table2 Routineblood cellexam ination at theend of90-days feeding test（n=10，±s）

續表2 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗末期各組大鼠血常規指標檢查結果Continut table2 Routineblood cellexam ination at theend of90-days feeding test（n=10，±s）

性別劑量/（g/kg·BW）白細胞/（109個/L）紅細胞/（1012個/L）血紅蛋白/（g/L）血小板/（109個/L）淋巴細胞/%雄7.5 6.46±2.05 8.52±0.29 153.50±6.58 1 007.40±121.50 71.24±8.34雌對照組3.18±0.77 7.52±0.28 141.90±3.45 994.80±101.25 71.54±4.49 2.5 3.96±2.16 7.54±0.46 145.10±6.24 983.70±75.90 73.60±4.38 5.0 4.54±1.61 7.55±0.21 141.10±4.43 1 006.30±108.26 74.38±5.83 7.5 4.19±1.20 7.57±0.29 144.10±6.33 1 007.80±103.36 74.77±7.94

2.3 對大鼠生化指標的影響

實驗末各項血生化指標總體比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 對大鼠臟體比值的影響

各劑量組大鼠的臟體比與對照組比較，差異均無顯著性（P＞0.05），見表4，表明該樣品對大鼠的臟器/體重比值無顯著影響。

表3 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠血清生化指標檢查結果Table3 Serum biochem icalanalysis in 90-days feeding test（n=10，±s）

表3 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠血清生化指標檢查結果Table3 Serum biochem icalanalysis in 90-days feeding test（n=10，±s）

性別劑量/（g/kg·BW）血糖/（mmol/L）雄對照組59.57±2.40 29.30±2.01 1.25±0.22 0.57±0.15 65.46±11.42 175.64±49.62 6.02±1.15 40.25±13.14 6.48±1.37 2.5 57.22±2.57 28.06±2.07 1.17±0.26 0.64±0.16 65.79±6.72 168.79±42.89 6.15±1.10 36.21±14.55 6.25±1.27 5.0 57.36±1.77 28.06±0.70 1.08±0.11 0.48±0.22 65.31±4.00 190.21±25.35 6.16±0.68 38.70±15.94 5.48±0.77 7.5 57.84±3.52 28.43±1.82 1.17±0.18 0.58±0.11 64.04±5.42 193.70±36.79 6.17±0.65 44.20±13.92 5.75±1.17雌對照組64.61±4.94 33.37±2.64 1.27±0.31 0.48±0.08 63.14±12.48 180.38±59.13 5.87±1.12 38.04±14.98 5.26±1.26 2.5 64.41±2.35 32.93±1.67 1.34±0.25 0.51±0.07 61.98±11.59 174.11±37.81 5.98±0.95 44.05±13.95 5.17±1.08 5.0 62.54±5.15 32.51±3.92 1.30±0.25 0.54±0.11 64.18±9.25 200.41±37.77 6.30±1.13 41.05±5.29 4.75±0.74 7.5 60.90±3.29 32.15±2.44 1.42±0.24 0.51±0.06 60.16±5.25 160.98±29.30 5.95±1.24 45.02±9.39 5.58±1.05總蛋白/（g/L）白蛋白/（g/L）總膽固醇/（mmol/L）甘油三酯/（mmol/L）谷丙轉氨酶/（U/L）谷草轉氨酶/（U/L）尿素氮/（mmol/L）肌酐/（μmol/L）

表4 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠臟器系數Table4 Organ coefficientof ratsin 90-days feeding test（n=10，±s）

表4 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠臟器系數Table4 Organ coefficientof ratsin 90-days feeding test（n=10，±s）

注：-表示無數據。

性別劑量/（g/kg·BW）肝臟系數/%脾臟系數/%腎臟系數/%睪丸系數/%卵巢系數/%雄對照組2.80±0.13 0.16±0.02 0.59±0.03 0.68±0.08-2.5 2.73±0.22 0.17±0.02 0.59±0.06 0.70±0.05-5.0 2.69±0.20 0.17±0.03 0.60±0.04 0.70±0.09-7.5 2.65±0.12 0.16±0.01 0.60±0.04 0.71±0.05-雌對照組3.04±0.35 0.21±0.02 0.65±0.04-0.09±0.02 2.5 2.86±0.12 0.22±0.03 0.60±0.04-0.09±0.02 5.0 2.98±0.22 0.22±0.02 0.63±0.04-0.09±0.02 7.5 2.88±0.23 0.21±0.02 0.62±0.05-0.08±0.01

2.5 大體解剖及組織學檢查結果

解剖時大體觀察，各劑量組實驗大鼠均未見異常改變。病理切片檢查發現有對照組和各劑量組個別出現肝細胞輕度脂肪變性，腎間質毛細血管輕度充血，血管旁少許炎細胞侵潤，差別無顯著性（P＞0.05）；其他器官均未見異常形態學改變。

2.6 血清抗氧化功能

雌、雄大鼠均有2-3個劑量組血清SOD、GSH-Px值顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），高劑量組雌、雄大鼠血清MDA值顯著低于對照組（P＜0.01），見表5。表明樣品可提高大鼠體內SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平。

3 結論與討論

本研究通過90天喂養試驗對以野生山枇杷為主要原料的原花青素白藜蘆醇漿亞慢性毒性進行研究，探討原花青素白藜蘆醇漿長期服用的安全性。試驗結果顯示：90 d喂養試驗期內各劑量組大鼠生長發育良好，體重增重、食物利用率、血常規、血生化、臟器系數等各項指標均在正常值范圍內[2-3]，與對照組之間差異均無統計學意義，病理組織學檢查各劑量組也未發現受試物質造成的病理學改變和損傷。試驗各項結果均未顯示樣品毒作用，最大未觀察到有害作用劑量（NOAEL）大于7.5 g/kg·BW，已達人體推薦每日攝入量（3 g/人，為生產者提供的人均量）的150倍，由此可初步認為，在本實驗條件下長期服用原花青素白藜蘆醇漿對機體并無明顯不良反應，是安全的。

表5 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠血清氧化指標檢測結果Table5 Serum antioxidant indexes in 90-days feeding test（n=10±s）

表5 原花青素白藜蘆醇漿90天喂養試驗各組大鼠血清氧化指標檢測結果Table5 Serum antioxidant indexes in 90-days feeding test（n=10±s）

注：*與對照組比較差異顯著，P＜0.05；**與對照組比較差異極顯著，P＜0.01。

性別劑量/（g/kg·BW）MDA/（nmol/mL）雄對照組211.48±31.89 321.74±40.49 8.46±1.20 2.5 231.71±15.36 383.04±51.34*8.41±1.18 5.0 236.64±34.77*411.30±59.60**7.28±1.85 7.5 254.90±13.05**412.83±77.81**5.38±1.23**雌對照組158.21±18.55 351.96±51.16 9.32±1.28 2.5 180.66±13.65*362.83±40.33 8.51±2.25 5.0 178.68±25.97*418.21±92.07*8.72±1.90 7.5 186.71±26.85**428.04±79.08*6.83±1.25** SOD/（U/mL）GSH-Px/（U/mL）

原花青素白藜蘆醇漿中含有兩大抗氧化成分——原花青素和白藜蘆醇，這兩大成分均具有抗氧化、調節免疫活性、保肝、抗癌等多種生物活性作用[4-8]。因此，原花青素白藜蘆醇漿應具有抗氧化功能，本試驗對原花青素白藜蘆醇漿的抗氧化功能進行了初步探索。傳統的抗氧化試驗實驗動物為老年大鼠或衰老模型大鼠，本試驗旨在探索，所以只檢測血清中相應指標，未對其他組織進行檢測。本著動物實驗“3R”原則，充分利用亞慢性試驗結束時的大鼠，檢測其體內的抗氧化指標。結果顯示，各劑量組雄、雌大鼠血清中SOD、GSH-Px活性均顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），且體現出一定的劑量-反應關系，提示原花青素白藜蘆醇漿可以提高大鼠體內抗氧化酶的活性；高劑量組大鼠血清中MDA含量顯著低于對照組，提示原花青素白藜蘆醇漿可以降低輕大鼠體內的脂質過氧化反應程度。因此，抗氧化指標檢測結果提示原花青素白藜蘆醇漿發揮保健作用可能與增強機體清除自由基能力，防止脂質過氧化有關。

綜合以上結果，可以認為在本試驗條件下，原花青素白藜蘆醇漿無亞慢性毒性，且具有一定的抗氧化功能。

[1]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會. GB15193.13-2003 30天和90天喂養試驗食品安全性毒理學評價程序和方法[S].北京：中國標準出版社,2003

[2]孫勁,徐元宏.SD大鼠常見血液學檢測指標參考范圍的建立[J].臨床輸血與檢驗,2008,10(3)：253-255

[3]李罡,劉建勛,葛爭艷,等.清潔級SD大鼠血液學指標及生化指標正常值的大樣本分析[J].中藥藥理與臨床,2009,25(2)：128-131

[4]張波,沈新南,張亞東,等.原花青素對小鼠乙醇性肝損傷的保護作用機制[J].衛生研究,2007,36(3)：295-298

[5]鄒金發,劉曉光.原花青素在肝損傷中的作用[J].中國醫學工程, 2012,20(6)：62-63

[6]李泓燁.紫甘薯花青素對酒精性肝損傷和對肝癌的影響及其機制的研究[D].成都：西南交通大學,2015

[7]王筱婧,林煥冰,祝倩,等.白藜蘆醇對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].免疫學雜志,2015,31(11)：954-958

[8]張澤生,賀偉,劉甜甜,等.白藜蘆醇的體外抗氧化活性[J].食品科學,2012,33(11)：266-268

Subchronic Toxicity Assessment and Study on the Antioxidant Function of Procyanidins Resveratrol Pulp

YANGYan1，ZHANGYang1，WANGChun-mei1，CHEN Lu2，HEHua-ying2，WENMin2，XIEHui-bo1，*
（1.DepartmentofNutrition and Food Hygiene，SchoolofPublic Health，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.SchoolofPublic Health，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou 646000，Sichuan，China）

To study the subchronic toxicity of procyanidins resveratrolby 90-day feeding test in rats，and to explores the antioxidative function in serum of procyanidins resveratrol pulp.90-day feeding test in ratswas used toassess the subchronic toxicity ofprocyanidins resveratrolpulp，and antioxidant indexes in ratserum were also determined.No obviousadverse effectwasobserved in the 90-day feeding test in rats.No obvious adverse effectswere observed at the dose level of 7.5 g/kg·BW.The activities of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in serum for2-3 dosagegroups in ratswere significantly higher than those in the controlgroup（P＜0.05 or P＜0.01）.Therewas significantdifference onmalondialdehyde（MDA）levelsbetween high groups and the control group（P＜0.05）.Procyanidins resveratrol pulp was not toxic tested by subchronic toxicity.The change of antioxidant indexes in rat serum indicated that the antioxidant function of procyanidins resveratrolpulp.

procyanidinsresveratrolpulp；subchronic toxicity；rat；serum；antioxidant function

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.002

2016-05-16

瀘州市-瀘州醫學院聯合基金（2013LZLY-K75）

楊艷（1974—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品安全與營養，保健食品研發。

*通信作者：謝惠波（1961—），男，教授，研究方向：保健食品研發。