新型負載型催化劑在植物甾醇酯合成工藝中的應用

潘丹杰，張 斌，蔣曉杰，葉 沁，孟祥河

(1.杭州市糧油中心檢驗監測站，杭州 310009； 2.浙江工業大學 海洋學院，杭州 310014)

油脂化工

新型負載型催化劑在植物甾醇酯合成工藝中的應用

潘丹杰1，張 斌2，蔣曉杰1，葉 沁2，孟祥河2

(1.杭州市糧油中心檢驗監測站，杭州 310009； 2.浙江工業大學 海洋學院，杭州 310014)

開發了一種新型、高效的納米羥基磷灰石負載氧化銅催化劑，初步表征了負載型催化劑的性質(比表面積、孔結構、微觀形貌及晶體結構)，并優化了其催化植物甾醇、脂肪酸合成植物甾醇酯的工藝參數。結果表明：納米羥基磷灰石經水蒸氣擴孔、Cu(NO3)2浸漬、焙燒可有效制備氧化銅-納米羥基磷灰石(CuO-NHAP)催化劑；酯化最佳條件為催化劑用量0.6%、酸醇摩爾比1.4∶1、反應溫度160℃、反應時間6 h，在此條件下酯化率為99.3%；催化劑重復使用6個批次后，催化劑相對活力仍保持在85%以上。

甾醇酯；催化劑；氧化銅-納米羥基磷灰石；重復使用

植物甾醇又稱植物固醇，是一種天然的功能活性物質。有研究表明[1]，植物甾醇及其酯化物可有效抑制膽固醇在小腸中的吸收，同時降低血漿中膽固醇濃度。此外，植物甾醇還具有獨特的消炎、退熱、抗腫瘤、抗氧化、美容、抑制血小板凝聚及調節動物生長等功能[2]。但是植物甾醇在水和油脂中的溶解度都相當有限，并且常溫下為結晶形式，生理活性不高，因此在食品工業中的應用受到限制。而植物甾醇酯可大大改善植物甾醇的脂溶性，同時具有熔點低、生物利用率高等特點。植物甾醇酯可通過胰膽固醇脂酶水解成為游離甾醇被人體吸收，降膽固醇效果優于植物甾醇[3-4]。

目前，用于植物甾醇酯合成的方法主要有酶催化合成法[5-6]和化學合成法[7-8]兩大類。Weber等[9]采用Candidarugosa固定化脂肪酶催化谷甾醇與油酸進行酯化合成，反應溫度30～40℃，但是需要在真空下進行，且反應時間長達48 h；李瑞等[10]以固定化脂肪酶Chirazyme L-2催化合成共軛亞油酸β-谷甾醇酯，反應在正己烷介質中進行，72 h后的酯化率僅為72.63%。鑒于過高的酶成本、較低的酯化率及較長的反應時間，工業化酶法合成甾醇酯的優勢不明顯。陳茂彬[11]以硫酸氫鈉為催化劑合成油酸甾醇酯的酯化率為84.13%。王明霞[12]則借助于微波技術進行α-亞麻酸的改性研究，研究表明當催化劑甲醇鈉的添加量僅為0.75%時，α-亞麻酸甾醇酯的產率即達60.8%。但是，由于化學法反應溫度高，容易發生副反應，從而導致不飽和脂肪酸氧化和植物甾醇脫水等。因此，尋找一種高效、環保且重復利用率高的催化劑對于植物甾醇酯工業化生產至關重要。

本實驗選用納米羥基磷灰石(NHAP)作為催化劑載體，自制負載型CuO催化劑，通過比表面積和孔徑分布、掃描電子顯微鏡和X-射線衍射等催化劑表征手段對催化劑的制備效果進行評價；同時將自制新型催化劑應用于植物甾醇酯的催化合成，通過酯化反應的酯化率評判該負載型催化劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

羥基磷灰石，納米級；三水合硝酸銅，分析純；混合植物甾醇(純度>95%，主要成分為豆甾醇24%、β-谷甾醇45%、菜油甾醇21%、菜籽甾醇5%)、混合脂肪酸(酸值(KOH)205 mg/g)，購自江蘇春之谷生物制品有限公司；薄層層析用硅膠板(G板)；NaOH-CH3OH溶液(0.5 mol/L)；正己烷，色譜純。

1.1.2 儀器與設備

GS-0.1高壓反應釜，RV5機械真空泵(英國愛德華)，ASAP2010比表面積和孔徑測定儀(美國麥克公司)，S-4700型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi 公司)，XRD-600 X-射線衍射儀(日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 負載型催化劑CuO-NHAP的制備

1.2.1.1 載體水熱擴孔預處理

稱取2 g NHAP載體于100 mL反應釜中，加入60 mL去離子水，在溫度120℃、壓力1.2 MPa、N2作為保護氣體條件下，載體水蒸氣擴孔處理2 h后將其放入110℃真空干燥箱內，干燥6 h后除水分，在600℃馬弗爐中焙燒4 h，冷卻至室溫后抽真空 30 min。

1.2.1.2 等體積浸漬

稱取0.398 g Cu(NO3)2·3H2O并加入3.72 mL蒸餾水溶解，得到Cu(NO3)2溶液(Cu質量分數為5%)[13]，加入2 g擴孔處理的NHAP，同時劇烈攪拌，保證載體和活性組分充分接觸，間歇超聲輔助浸漬2次，每次1 h，浸漬處理總時間24 h，將其放入120℃電熱真空干燥箱，干燥12 h，形成多孔狀蜂窩固體，再于600℃下焙燒3 h，得到負載型催化劑CuO-NHAP。

1.2.2 負載型催化劑表征

1.2.2.1 比表面積和孔結構的測定(BET-BJH)

BET-BJH測定是在-196℃液氮溫度下用N2吸附法測得的。從吸附等溫線以及滯后環的類型可以看出孔的結構與孔徑分布情況，并可根據BET模型計算出催化劑的比表面積，再根據BJH等效圓柱模型計算出催化劑樣品相應的孔徑分布曲線。

1.2.2.2 掃描電鏡(SEM)

在Hitachi S-4700型掃描電子顯微鏡上完成樣品測定。

1.2.2.3 X-射線衍射(XRD)

X-射線衍射測試條件：入射光源CuKα1靶(λ=0.154 06 nm)，管電流40 mA，管電壓40 kV，掃描速率4(°)/min，掃描范圍2θ5°～100°，步徑0.02°。結果由JCPDS數據庫判斷物質晶相類型。

1.2.3 植物甾醇酯的制備

稱取10 g混合植物甾醇于50 mL三口燒瓶內，在60℃烘箱干燥24 h，然后按一定的酸醇摩爾比加入混合脂肪酸(混合脂肪酸的平均摩爾質量按180 g/mol 計，混合植物甾醇的平均摩爾質量按400 g/mol 計)，在抽真空狀態下油浴加熱，同時通過磁力攪拌至反應混合物完全溶解。待反應混合物升溫至設定值后，加入一定量負載型催化劑CuO-NHAP開始計時，以薄層色譜監測反應進程[14]。最終酯化率根據高效液相色譜分析計算。

1.2.4 產物分析

1.2.4.1 植物甾醇酯的分離純化

酯化合成的產物采用薄層色譜法(TLC)進行分離純化。反應開始計時后，每隔1 h取樣進行TLC分析以判斷反應進程，每次點3個平行樣。TLC所用硅膠板固定相為0.5 mm的硅膠，展開劑和顯色劑參考張娟聰[15]和張斌[16]的方法。

1.2.4.2 植物甾醇酯的測定

產物中的植物甾醇酯通過高效液相色譜法測定。色譜條件為：Silica分析柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相為正己烷-異丙醇(體積比 95∶5)；流速1.2 L/min；柱溫90℃；放大系數2；蒸發光散射檢測器(ELSD 2000)。

酯化率=酯化植物甾醇物質的量/反應初始時原料中植物甾醇物質的量×100%

1.2.5 催化劑重復使用性能測試

反應結束后，將粗產物趁熱快速抽濾，分離出的負載型催化劑CuO-NHAP用無水乙醇沖洗，并在120℃的電熱真空干燥箱內經干燥后重復使用，由催化劑相對活性變化趨勢評定該催化劑重復使用性能。

2 結果與討論

2.1 催化劑表征結果

2.1.1 比表面積和孔結構

表1為NHAP在擴孔前和擴孔后的比表面積、總孔容、平均孔徑和介孔數據結果。由表1可以看出，擴孔后NHAP的比表面積與擴孔前相比，減小了45%，然而總孔容和平均孔徑卻分別提高了65%和197%，這說明在擴孔處理之后載體的孔徑被高壓釜中的水蒸氣強烈沖擊導致小孔間的孔壁被破壞，因此導致載體總孔容和介孔均增大。此外，研究還表明擴孔處理確實有利于載體孔徑的增大，便于活性組分的進入。

表1 NHAP擴孔前后的BET-BJH性質對比

2.1.2 表面形貌

圖1、圖2為活性組分負載前后載體NHAP在放大倍數為5 000倍下的SEM圖。從圖1、圖2可以清晰看到，催化劑載體主要呈現出疏松多孔的表面結構，這說明在擴孔處理之后的載體表面孔徑有利于活性組分的負載。而經過負載后的NHAP載體表面孔徑不再是疏松空洞的，而是出現了大量的碎片，這很有可能是經過活性組分Cu(NO3)2在焙燒下產生的金屬氧化物CuO碎片。

圖1 活性組分負載前NHAP的SEM圖

圖2 活性組分負載后NHAP的SEM圖

2.1.3 衍射峰晶面分析

活性組分負載前后NHAP的XRD圖見圖3、圖4。

圖3 活性組分負載前NHAP的XRD圖

圖4 活性組分負載后NHAP的XRD圖

由圖3可以看出，在2θ=25.864°、31.786°、32.186°、32.908°、34.054°、46.701°和49.478°，有較明顯的衍射峰，由Jade軟件分析可知分別對應為NHAP的(002)、(211)、(112)、(300)、(202)、(222)和(213)晶面，表明NHAP是密集的六方結構晶體。但在圖4中可以看出，由于負載了Cu(NO3)2溶液，載體NHAP在2θ=25.864°和31.786°時所對應的最強衍射峰強度發生了明顯的下降，而在2θ=35.462°和38.642°時分別出現了明顯的CuO衍射峰，分別對應CuO(002)和(111)晶面。這說明CuO是催化劑的主要活性組分，其碎片在NHAP表面高度分散，導致NHAP本身的衍射峰強度減弱。

2.2 單因素實驗優化工藝參數

2.2.1 反應溫度對酯化反應酯化率的影響

在酸醇摩爾比1.5∶1、催化劑用量0.5%、反應時間5 h的條件下，分別選擇反應溫度為130、140、150、160、170、180℃，考察反應溫度對酯化率的影響。結果見圖5。

圖5 反應溫度對酯化率的影響

由圖5可以看出，在160℃以下，隨著反應溫度的升高，酯化率明顯增大，當反應溫度到160℃時，酯化率達到最大值，為98.9%。當反應溫度達到160℃以后，酯化率下降，主要是因為當反應溫度升高至一定值時，反應的熱動能不再是主導酯化反應速率的關鍵因素[13]。同時在160℃之后，由于溫度過高會大大增加反應副產物產生的幾率[15]。因此，確定該酯化反應的最佳反應溫度為160℃。

2.2.2 反應時間對酯化反應酯化率的影響

在酸醇摩爾比1.5∶1、反應溫度160℃、催化劑用量0.5%的條件下，分別選擇反應時間為3、4、5、6、7、8 h，考察反應時間對酯化率的影響。結果見圖6。

圖6 反應時間對酯化率的影響

由圖6可以看出，在反應的前6 h內，酯化率的增加幅度很大。當反應進行到6 h時，酯化率達到最大值，為99.8%。隨后酯化率出現了下降的現象，這可能是由于反應達到了動態平衡，此時若正向反應產生的少量水未及時抽離，將會導致反應逆向進行，降低反應酯化率。因此，確定該酯化反應的最佳反應時間為6 h。

2.2.3 酸醇摩爾比對酯化反應酯化率的影響

在反應溫度160℃、反應時間5 h、催化劑用量0.5%的條件下，分別選擇酸醇摩爾比為1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1、1.8∶1、2.0∶1，考察酸醇摩爾比對酯化率的影響。結果見圖7。

圖7 酸醇摩爾比對酯化率的影響

由圖7可以看出，當酸醇摩爾比在1.4∶1以下，隨酸醇摩爾比的增大，酯化率明顯增大，當酸醇摩爾比為1.6∶1時，酯化率為99.2%，但相比1.4∶1時的酯化率相差不大。因此，確定該酯化反應的最佳酸醇摩爾比為1.4∶1。

2.2.4 催化劑用量對酯化反應酯化率的影響

在研究催化劑用量對于酯化反應酯化率的影響時，發現并不是催化劑用量越大，酯化率越高。在反應溫度160℃、酸醇摩爾比1.4∶1、反應時間5 h的條件下，分別選擇催化劑用量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，考察催化劑用量對酯化率的影響。結果見圖8。

圖8 催化劑用量對酯化率的影響

由圖8可以看出，當催化劑用量為0.6%時，酯化率達到最大值，為99.2%，而催化劑用量過多或者過少，其酯化率都低于99.2%。這是因為催化劑只是加快了反應速率，并不是直接影響酯化率高低的決定性因素。因此，確定該酯化反應的最佳催化劑用量為0.6%。

2.3 催化劑活性的穩定性研究

為了考察催化劑在酯化過程中的穩定性，每次反應結束后將催化劑從產物中分離出來重新利用到下一批次。實驗條件為：催化劑用量0.6%，酸醇摩爾比1.4∶1，反應溫度160℃，反應時間6 h。在實驗條件下，酯化率為99.3%。重復10次實驗的催化劑相對活性如圖9所示。

由圖9可以看出，在負載型催化劑CuO-NHAP按實驗條件反應6個批次以后，催化劑相對活性仍能保持85%以上，酯化率為86.9%，催化劑理論半衰期可達99.1 h，反映了負載型催化劑CuO-NHAP良好的穩定性。催化劑使用時相對活性降低可能是由于催化活性中心會被一些反應產物或者雜質吸附從而導致催化活性的下降，或者活性組分在重復使用和清洗過程中，脫附于載體表面。

圖9 CuO-NHAP催化劑重復利用時的穩定性

3 結 論

本實驗主要開發了一種新型、高效的納米羥基磷灰石負載氧化銅催化劑，并研究了此新型催化劑在植物甾醇酯合成工藝中的應用。研究結果表明，納米羥基磷灰石(NHAP)經水蒸氣擴孔、Cu(NO3)2浸漬、焙燒可有效制備氧化銅-納米羥基磷灰石(CuO-NHAP)催化劑。此外，CuO-NHAP作為酯化反應的催化劑，實驗得到最佳酯化反應條件為反應溫度160℃、反應時間6 h、酸醇摩爾比1.4∶1、催化劑用量0.6%，在此條件下酯化率為99.3%，并且該催化劑具有較好的穩定性。由此可得該酯化反應所采用的反應體系具有反應時間短、酯化率高、催化劑可重復利用率高、與產物易分離等優點。

[1] TRAUTWEIN E A，DUCHATEAU G S M J E，LIN Y G，et al. Proposed mechanisms of cholesterol-lowering action of plant sterols[J]. Eur J Lipid Sci Technol，2003，105：171-185.

[2] 許青青，金文彬，蘇寶根，等. 植物甾醇酯的化學合成及其分離研究進展[J]. 中國糧油學報，2014，29(3)：120-128.

[3] 博迪克D C，莫伊尼G，雷德斯多夫D，等. 植物甾醇和植物甾烷醇衍生物：CN1256277A [P]. 2000-06-14.

[4] BERRY C J，BIERENBAUM M L. Anticholesterolemic edible oil：US6277431 [P]. 2001-08-21.

[5] KIM B H，AKOH C C. Modeling and optimization of lipase-catalyzed synthesis of phytosteryl esters of oleic acid by response surface methodology[J]. Food Chem，2007，102(1)：336-342.

[6] ZHENG M M，DONG L，LU Y，et al. Immobilization ofCandidarugosalipase on magnetic poly (allyl glycidyl ether-co-ethylene glycol dimethacrylate) polymer microsphere for synthesis of phytosterol esters of unsaturated fatty acids[J]. J Mol Catal B Enzym，2012，74(1/2)：16-23.

[7] ROBLES-MANUEL S，BARRAULT J，VALANGE S. Selective synthesis of phytosterol esters from natural sterols and fatty methyl esters over Mg-containing solid catalysts[J]. C R Chim，2011，14(7/8)：656-662.

[8] YANG Y B，HE W S，JIA C S，et al. Efficient synthesis of phytosterol esters using the Lewis acidic ionic liquid[J]. J Mol Catal A Chem，2012，357：39-43.

[9] WEBER N，WEITKAMP P，MUKHERJEE K D. Fatty acid steryl，stanyl，and steroid esters by esterification and transesterification in vacuo usingCandidarugosalipase as catalyst [J]. J Agric Food Chem，2001，49(1)：67-71.

[10] 李瑞，張曉鳴. 有機相脂肪酶催化合成共軛亞油酸β-谷甾醇酯的研究[J]. 中國油脂，2006，31(2)：56-59.

[11] 陳茂彬. 植物甾醇酯的制備、生物活性及應用研究 [D]. 武漢：華中農業大學，2005.

[12] 王明霞.α-亞麻酸的純化和改性研究 [D]. 北京：中國農業科學院，2007.

[13] CHARKRABORTY R，ROYCHOWDHURY D. Fish bone derived natural hydroxyapatite-supported copper acid catalyst：taguchi optimization of semibatch oleic acid esterification [J]. Chem Eng J，2013，215：491-499.

[14] 潘秋月，周曉紅，孟祥河. 植物甾醇酯的綠色合成技術研究[J]. 中國糧油學報，2009，24(5)：115-118.

[15] 張娟聰. 植物甾醇的改性研究[D]. 杭州：浙江工業大學，2009.

[16] 張斌. 負載型催化劑合成植物甾醇酯及其結晶純化工藝的研究[D]. 杭州：浙江工業大學，2014.

Application of novel supported catalyst in synthesis process of phytosterol ester

PAN Danjie1, ZHANG Bin2, JIANG Xiaojie1, YE Qin2, MENG Xianghe2

(1.Hangzhou Grain and Oil Center Inspection Station, Hangzhou 310009, China；2.Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

A novel and high efficient copper oxide-nano hydroxyapatite (CuO-NHAP) catalyst was developed. The properties of supported catalyst(specific surface area, pore structure、mcro-morphology and crystal structure) were characterized and the process parameters of synthesis of plant sterol ester with plant sterol and fatty acid catalyzed by CuO-NHAP were optimized. The results showed that the CuO-NHAP catalyst was prepared effectively by pores-broading of nano-hydroxyapatite with vapour, impregnation with Cu(NO3)2and calcination. The optimal conditions of esterfication were obtained as follows：dosage of catalyst 0.6%, molar ratio of oleic acid to phytosterol 1.4∶1, reaction temperature 160℃ and reaction time 6 h. Under these conditions, the esterification rate was 99.3%. When the catalyst was reused for six times, its activity kept more than 85%.

sterol ester； catalyst； copper oxide-nano hydroxyapatite； reuse

2016-05-26；

2016-11-23

潘丹杰(1984)，男，工程師，碩士研究生，研究方向為油脂分析檢測(E-mail)1726471762@qq.com。

孟祥河，教授，博士生導師，博士(E-mail)mengxh@zjut.edu.cn。

TQ645；TQ426

A

1003-7969(2017)03-0059-05