EC-SOD在腎缺血再灌注損傷大鼠腦內的表達變化

郝 斌，王 切，王素玲，王 磊*

(1.河北省滄州市中心醫院泌尿外科,河北 滄州 061001； 2.河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科， 河北 石家莊 050071)

·論 著·

EC-SOD在腎缺血再灌注損傷大鼠腦內的表達變化

郝 斌1，王 切2，王素玲3，王 磊2*

(1.河北省滄州市中心醫院泌尿外科,河北 滄州 061001； 2.河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科， 河北 石家莊 050071)

目的觀察細胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutases，EC-SOD)在腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI) 大鼠腦內的表達變化,探討EC-SOD在腦抗氧化應激反應中的作用。方法選用健康雄性Wistar大鼠12只，隨機分為對照組和RIRI組各6只，RIRI組切除大鼠右腎后,用無損傷動脈夾夾閉大鼠左腎動脈,45 min后移去動脈夾,恢復大鼠左腎血液供應，建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。待左腎動脈再灌注24 h后麻醉大鼠取材(血、腎、腦)。對照組大鼠只分離左腎動脈并不夾閉。選用苦味酸和酶偶聯速率法,檢測2組大鼠血清中血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)濃度；蘇木精-伊紅染色光鏡觀察實驗大鼠腎組織形態變化；采用硫代巴比妥酸比色法檢測2組大鼠腦內丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；應用逆轉錄聚合酶鏈反應和western blot法,測定大鼠腦內EC-SOD mRNA與蛋白的表達水平。結果RIRI組大鼠血清中BUN和SCr濃度明顯高于對照組,RIRI組大鼠腦內MDA含量、H2O2濃度、EC-SOD mRNA水平相對表達量以及EC-SOD蛋白水平相對表達量均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。RIRI組腦組織MDA、H2O2含量與EC-SOD mRNA水平以及EC-SOD蛋白水平表達呈正相關。結論大鼠RIRI后,腦內出現過氧化損傷；EC-SOD在RIRI大鼠腦內的表達升高,可能發揮了抗氧化應激的作用。

再灌注損傷;超氧化物歧化酶;丙二醛

缺血再灌注損傷是指器官在缺血缺氧時出現的細胞損傷，會在器官的血液和氧含量恢復時加重的現象[1-2]。腎缺血再灌注損傷(renal ischaemia reperfusion injury，RIRI)是腎臟在臨床治療過程中經常發生的病理生理過程，也是影響腎功能恢復以及發生腎衰竭的重要原因之一[3-5]。腎在缺血再灌注過程中會有大量活性氧族(reactive oxygen species,ROS)產生，使腎處于高度的氧化應激狀態，損傷腎功能[6-7]。已有研究發現在腎功能損傷時，會影響機體其他器官如肝、肺等的功能[8]。細胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutases，EC-SOD)是在組織的細胞外基質中被發現的，被認為能有效地阻止細胞外ROS所引發的細胞和組織損傷[9]。腦是對缺血缺氧高度敏感的器官，本研究旨在觀察RIRI發生時腦組織是否會受到RIRI的影響？腦內EC-SOD的表達是否發生改變？現將觀察結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 大鼠RIRI模型的建立及取材 選用健康雄性Wistar大鼠12只(來自河北省實驗動物中心，合格證編號：1510165)，體質量190～210 g，隨機分為對照組和RIRI組各6只。6%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉下，將大鼠固定于手術臺上，常規備皮、消毒、鋪單。自劍突向下做腹部正中切口4 cm，暴露并結扎右側腎蒂后切除右腎。RIRI大鼠分離左腎動脈,用無創動脈夾將其夾閉,觀察左腎顏色，由鮮紅漸變為暗紅，顯示夾閉成功。45 min后松開動脈夾,恢復血液供應,可見左腎動脈充盈,顏色迅速轉為鮮紅色,顯示再灌注成功。對照組大鼠只分離左腎動脈并不夾閉。術后單籠飼養、自由進食飲水。

術后24 h再次麻醉大鼠，自頸總動脈取血約5 mL，將血液3 000 r/min離心10 min，分離血清去除紅細胞，用于血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，SCr)濃度測定；取腎并用4%多聚甲醛浸泡固定，組織切片蘇木精-伊紅(hematoxylin eosion,HE)染色光鏡觀察其形態學變化；取腦置于液氮中，用于丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和EC-SOD mRNA及蛋白水平測定。

1.2 主要試劑及PCR引物 RT試劑盒購于Promega公司，SCr和BUN測定試劑盒均購于中生北控生物科技有限公司，MDA和H2O2測定試劑盒均購于南京建成科技有限公司。兔抗EC-SOD抗體和辣根過氧化物酶標記抗兔IgG抗體均購于Abcam公司。所有引物均采用primer 5.0軟件設計。GAPDH(gene bank: NM _017008)：由北京三博遠志生物技術公司合成。上游：5′GCT GAG TAT GTC GTG GAG T 3′;下游：5′TCT TCT GAG TGG CAG TGA T 3′;擴增產物長度為286 bp(344～629 bp)。EC-SOD(gene bank:NM_057114)：由北京三博遠志生物技術公司合成。上游：5′CCT GGG TAA AGG TGG CA3′;下游：5′TGG GAG CAA ACT CAA AGA C3′;擴增產物長度為573 bp(711～1 283 bp)。

1.3 血清SCr和BUN濃度測定 根據試劑盒說明書，采用苦味酸法測定血清樣本SCr濃度，酶偶聯速率法測定BUN濃度。將R1和R2按照1∶1的比例混合成工作液，校準品開瓶即可使用，用于測定SCr濃度；用R2溶解R1，溶解后即為工作液，校準品為廠家提供，用于測定BUN濃度。各取3只直徑為1 cm的比色管，分別作為空白管、校準管和樣本管。在空白管內加入1 mL工作液和0.1 mL生理鹽水，在校準管內加入1 mL工作液和0.1 mL校準品,在樣本管內加入1 mL工作液和0.1 mL血清樣本，分別混勻待檢測。測定其在波長505 nm(SCr)和340 nm(BUN)、溫度37 ℃條件下的吸光光度值?；靹蚝?0 s所測吸光光度值為A1，再過20～60 s所測吸光光度值為A2，用2次吸光光度的差值，以空白管調零，計算吸光光度的變化值，即△A樣本和△A校準。根據公式C樣本=△A樣本×C校準/△A校準，計算每個血清樣本的SCr和BUN濃度。

1.4 腎組織形態學觀察 將腎臟組織置于4%多聚甲醛固定液內固定，按常規組織切片制作步驟進行操作：脫水、透明、浸蠟、包埋，切片厚約5 μm，HE染色后封片，奧林巴斯光學顯微鏡觀察腎組織的形態變化并攝像。

1.5 腦組織勻漿的制備和MDA、H2O2含量測定 將從-70 ℃冰箱中取出的腦組織，按照20 mg/100 μL加入預冷的勻漿緩沖液(50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.4，1 mmol/L鹽酸苯甲脒，1 mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTANa3，5 mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴中勻漿，勻漿液4 000 r/min(約3 500 g)，4 ℃離心20 min，收集150 μL上清液，于上清液內加入150 μL勻漿緩沖液即制成10%腦勻漿，用于MDA及H2O2含量測定。根據試劑盒操作說明，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，以每克樣本蛋白所含MDA的量表示(mmol/g pro)；H2O2含量采用鉬酸比色法測定，以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。

1.6 腦組織EC-SOD mRNA水平與蛋白水平相對表達量的測定 采用Trizol(Invitrogen公司)法，提取腦組織總RNA。用3 μgRNA 反轉錄生成cDNA，GAPDH作為內參照，進行逆轉錄聚合酶鏈反應。用EC-SOD與內參的擴增產物灰度值之比，表示EC-SOD mRNA相對表達量。采用免疫印跡分析法測定大鼠腦組織內EC-SOD蛋白的相對表達量。將腦組織制成勻漿后，離心取上清。采用改良Lowry法測定腦組織蛋白總量。電泳時上樣量為62 μg。經電泳、轉膜、封閉后，在聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上滴加一抗，室溫(18～24 ℃)過夜，漂洗后加HRP標記的二抗。按照發光試劑的操作說明進行顯影、定影、晾干。影像掃描后進行數據分析(以條帶吸光光度值與內參之比表示相對表達量)。

1.7 統計學方法 應用SPSS 14.0統計學軟件處理數據。計量資料比較采用成組設計的t檢驗；相關性采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腎組織形態學改變 光學顯微鏡下，對照組大鼠腎小囊、腎血管球、近曲小管、遠曲小管以及集合管的形態結構均清晰規整。RIRI大鼠腎血管球萎縮，體積減小，腎小囊腔出現擴張，腎小管管腔也擴張明顯，偶爾可見近曲小管上皮細胞呈現水腫、胞漿疏松化改變；腎小管間隙擴大，腎間質水腫，集合管也呈現管腔擴張、上皮水腫等改變(圖1,2)。

圖1 正常組腎小球、腎小管形態結構(HE ×400)
Figure 1 Morphology of glomeruli and tubules in control group(HE ×400)

圖2 RIRI腎小球、腎小管形態改變(HE ×400)
Figurea 2 Morphological changes of glomeruli and tubules in RIRI group(HE ×400)

2.2 2組SCr和BUN水平比較 RIRI組SCr和BUN水平均較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組血清中SCr和BUN水平比較Table 1 Comparison of SCr and BUN level between two groups

2.3 腦組織勻漿內MDA、H2O2、EC-SOD mRNA和EC-SOD蛋白的表達 RIRI組腦組織勻漿內MDA、H2O2、EC-SOD mRNA和EC-SOD蛋白的表達均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2,圖3,4。

表2 2組MDA、H2O2和EC-SOD mRNA、蛋白水平表達比較表2 Comparison of MDA、H2O2、EC-SOD mRNA and protein expression level between two groups

圖3 腦組織EC-SOD mRNA的相對表達量
Figurea 3 The mRNA expression of EC-SOD in brain

圖4 腦組織EC-SOD蛋白的相對表達量
Figure 4 The protein expression of EC-SOD in brain

2.4 相關性分析 RIRI組腦組織MDA含量與EC-SOD mRNA表達水平和EC-SOD 蛋白表達水平、腦組織H2O2含量與EC-SOD mRNA表達水平和EC-SOD 蛋白表達水平，均呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 RIRI組腦組織MDA、H2O2含量與EC-SODmRNA和EC-SOD蛋白的相關性Table 3 Correlation between the content of MDA,H2O2, the mRNA and protein expression of EC-SOD in brain tissue of RIRI group

3 討 論

腎臟通過對水、離子、葡萄糖、營養物質等的重吸收，以及去除代謝產物，在維持血流動力學、電解質、水平衡和機體內環境的平衡穩定中具有重要作用。RIRI是很多臨床治療過程中不可避免的事件，如腎臟移植、腎擠壓傷以及部分腎切除等。由于能導致急性腎損傷、腎移植后功能恢復延遲、急性腎衰竭的發生，而且具有較高的發病率和病死率，關于RIRI的發病機制和防治方法研究，已引起高度重視[10-12]。研究表明，到達腎臟的血液供應被突然暫時性阻斷，隨后再重新恢復其血液供應，再灌注階段，被重新充血充氧的腎組織中會有大量ROS產生，使腎臟處于高度氧化應激狀態，從而啟動有害的細胞級聯反應，導致細胞死亡和急性腎衰竭[13]。本研究目的是觀察在腎臟缺血再灌注損傷發生且處于高度氧化應激狀態時，腦組織是否也處于氧化應激狀態并遭受過氧化損傷？抗氧化酶EC-SOD的表達如何改變？在此過程中是否發揮抗氧化作用？首先，本研究采用無損傷血管夾夾閉大鼠左腎動脈，45 min后再重新灌注，建立大鼠RIRI模型。RIRI可導致血中氮代謝產物的積累，如BUN和SCr[1]。本研究結果與此一致。此外，與對照組相比，RIRI組大鼠的腎小球和腎小管形態結構發生明顯改變。表明RIRI大鼠腎臟的結構和功能均已受損，RIRI模型是成功的。

在RIRI發生時，腦組織是否也處于高度氧化應激狀態并遭受過氧化損傷？ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等;其中，H2O2是ROS成員中含量最豐富最穩定的形式之一[14-15]。參與炎癥、細胞功能障礙和細胞凋亡的發生，最終導致組織和器官損傷。本研究結果顯示，RIRI組大鼠腦組織中的H2O2高于對照組，表明在RIRI發生時，腦組織也出現大量ROS，處于氧化應激狀態。MDA是脂類物質與ROS發生過氧化反應所形成的一種終末代謝產物,其含量的高低能反映脂類物質發生過氧化反應的速度和強度,因此MDA常被作為評價過氧化損傷程度的客觀指標[16]。腦組織含有豐富的脂類物質，故更容易遭受ROS襲擊發生過氧化損傷。本研究結果顯示，與對照組相比，RIRI組大鼠腦組織的MDA含量明顯升高。結合H2O2檢測結果表明，在RIRI發生時，腦組織不僅處于氧化應激狀態，并且已遭受過氧化損傷。

機體內氧化還原反應失衡，可引起ROS在細胞水平的升高，導致疾病的發生[17]。EC-SOD是超氧化物歧化酶的家族成員之一。在組織間質和細胞外液(血漿、淋巴、流體和滑膜液)中，EC-SOD能催化超氧自由基發生歧化反應轉變為過氧化氫和氧氣。它消除了來自細胞環境的超氧自由基，防止ROS和它們的衍生物的形成，在維持血管張力、肺功能、一氧化氮代謝，以及在動脈粥樣硬化、糖尿病和關節炎等疾病的病理學中，也起著重要作用[18]。有研究表明，放射線照射后，EC-SOD依靠其抗氧化作用，對于維持認知功能和海馬神經形成是至關重要的；EC-SOD在新生兒大腦過度表達，在對抗高氧誘導的腦損傷中提供了顯著的保護作用[19]。本研究結果顯示，在RIRI發生時，EC-SOD的mRNA和蛋白表達水平均明顯增強，并且與腦組織MDA、H2O2含量均呈正相關。從而推測，當RIRI發生后，腦組織內產生大量ROS并與脂類物質發生過氧化反應，導致過氧化損傷。為了清除過多的ROS以維持機體氧化還原平衡，機體通過上調抗氧化酶EC-SOD的表達來清除過多的ROS，保護腦組織免遭過氧化損傷。

總之，在RIRI發生時，伴有腦組織處于氧化應激狀態并發生過氧化損傷，抗氧化酶EC-SOD在清除ROS、防治RIRI誘發腦組織過氧化損傷中，可能發揮重要作用，也為防治RIRI所誘發的腦損傷提供了一條新思路。

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(本文編輯：許卓文)

Expression changes of EC-SOD in the brain of the renal ischemia reperfusion injury in rats

HAO Bing1, WANG Qie2, WANG Su-ling3, WANG Lei2*

(1.DepartmentofUrology,CangzhouCentralHospital,HebeiProvince,Cangzhou061001,China; 2.DepartmentofAnatomy,theSchoolofBasicMedicalSciences,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China； 3.DepartmentofLaboratory,HebeiBloodCenter,Shijiazhuang050071,China)

Objective To observe the expression of extracellular superoxide dismutases(EC-SOD) in renal ischemia reperfusion injury(RIRI) rats and to investigate the role of EC-SOD in the brain oxidative stress response. Methods The male Wistar rat were divided randomly into RIRI group and control group ，6 rats in each group. After the right kidney was removed in RIRI rats, the left renal artery was clamped with a non injured artery clamp. After 45 min, the rats were removed and the blood supply was restored. After 24 hours of reperfusion, the blood, kidney and brain were taken. The left renal artery were only separated, but not cliped in the control group rats. The urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(SCr) in the serum blood of two groups were detected by picric acid method and enzyme coupling rate method. The malondialdehyde(MDA)content in the brain tissue of two groups was determined by thiobarbituric acid colorimetric method. the renal morphological change was observed by HE staining. The EC-SOD mRNA and protein expression in brain were evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction and western blot. Results Compared with the control group, the BUN and SCr in serum of RIRI group were significantly increased. The content of MDA, H2O2, the relative expression level of EC-SOD and the relative expression level of EC-SOD protein in RIRI group were higher than those in control group. The difference was statistically significant(P<0.05). The content of MDA and H2O2was positively correlated with the expression of EC-SOD mRNA and protein in the brain tissue of RIRI group. Conclusion After the RIRI, oxidative damage in the brain was occured. The increase of EC-SOD expression in the brain of RIRI rats may play an important role in anti oxidative stress.

reperfusion injury; superoxide dismutase; malondialdehyde

2016-11-11；

2016-12-20

河北省醫學科學研究重點課題(20160088)

郝斌(1981-)，男，河北滄州人,河北省滄州市中心醫院主治醫師，醫學碩士，從事泌尿外科疾病診治研究。

R619.9

A

1007-3205(2017)05-0552-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.013