犬圓環病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立

孫文超，解長占，趙冠宇，曹 亮，鄭 敏，曹慧慧，張紅云，韋顯凱，韓繼成，溫樹波，肖朋朋，靖 杰，張 萍，魯會軍，金寧一

(1.廣西大學動物科技學院，廣西南寧 53001；2.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001；3.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林長春 130122；4.廣西玉林市動物疫病預防控制中心，廣西玉林 537000)

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犬圓環病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立

孫文超1,3，解長占3，趙冠宇3，曹 亮3，鄭 敏2*，曹慧慧1,2，張紅云4，韋顯凱2，韓繼成3，溫樹波3，肖朋朋3，靖 杰3，張 萍3，魯會軍3，金寧一3

(1.廣西大學動物科技學院，廣西南寧 53001；2.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001；3.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林長春 130122；4.廣西玉林市動物疫病預防控制中心，廣西玉林 537000)

犬圓環病毒(DogCV)是圓環病毒科新發現的圓環病毒，旨在建立犬圓環病毒實時熒光定量PCR檢測方法。試驗用PCR方法克隆犬圓環病毒ORF2基因保守區域，構建標準陽性質粒pClon007-ORF2。以標準陽性質粒pClon007-ORF2為模板對熒光定量PCR反應體系進行優化。結果表明，所建立的方法Ct值與標準品在4.67×109copies/μL～4.67×103copies/μL范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.998，斜率為-3.445。該方法檢測靈敏度為4.67×101copies/μL。該方法對狂犬病病毒、犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常見病原的檢測均無交叉反應；所有稀釋度標準品模板均在83.35℃出現窄的特異性熔解峰。臨床樣品檢測表明，所建立的實時熒光定量PCR對犬圓環病毒的陽性檢測率為12.50%(4/32)。

犬圓環病毒；SYBR GreenⅠ；實時熒光定量 PCR

犬圓環病毒(Dog circovirus，DogCV)于2012年美國首次報道[1]，隨后研究發現該病毒是犬壞死性血管炎和肉芽腫性淋巴結炎的病原體。病犬以嘔吐、出血性腹瀉等為主要癥狀[2-3]。犬圓環病毒是圓環病毒科圓環病毒屬成員，為無囊膜的單股DNA病毒[4]，基因組約為2 063 bp。該病毒具有2個主要的閱讀框(ORF)，分別編碼復制酶Rep蛋白和衣殼Cap蛋白。

目前動物病毒流行病學調查應用最多的是普通PCR方法，但普通PCR存在無法對病毒核酸進行定量分析、靈敏性也較熒光定量PCR差，而諸如免疫組化、原位雜交等方法存在操作復雜、耗時長等缺點。實時熒光定量PCR (real-time PCR)技術不僅可以將樣品中的病毒核酸進行定量分析，而且具有操作簡單、重復性好等優點[5]。目前針對犬圓環病毒流行毒株的分離鑒定、遺傳進化等研究較少。本文建立的DogCV real-time PCR 檢測方法，為DogCV快速診斷、病毒持續性感染動態分析及防治效果評價等方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 犬圓環病毒；狂犬病病毒(Rabies virus，RV)、犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)、犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2，CAV-2)均由軍事獸醫研究所病毒學與免疫學實驗室保存。

1.1.2 樣品采集 32份犬血清來自廣西壯族自治區玉林市，由廣西動物疫病預防控制中心采集，并在-80℃保存。

1.1.3 主要儀器與試劑 NANODROP2000分光光度計，ABI Prismr 7500型熒光定量PCR儀，SYBR Green I real-time PCR Master Mix購自普洛麥格公司；血液/組織/細胞基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；pClon007載體購自北京擎科新業生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank DogCV JZ98/2014 (登錄號：KT946839.1)基因序列，利用Primer5.0軟件設計特異性的引物，針對ORF2基因的保守區域的引物ORF2F/ORF2R和real-time PCR引物P1/P2，引物由吉林省庫美生物工程有限公司合成。

1.2.2 標準質粒的制備 提取DogCV基因組，通過PCR方法擴增保守區序列基因ORF2。目的基因純化后克隆到pClon007載體，轉化工程菌DH5α，經酶切鑒定正確陽性質粒，由吉林省庫美生物有限公司進行測序，并命名為pClon007-ORF2。利用核酸蛋白檢測核酸濃度和純度。根據質粒濃度計算得到重組質?？截悶?.67×1010copies/μL。對重組質粒進行10的倍比稀釋，取10-1～10-9個稀釋度的重組質粒作為標準品模板。

表1 Real-time PCR引物

1.2.3 實時熒光定量PCR方法的優化 根據稀釋好的模板，分別對引物濃度、循環數和退火溫度等進行優化，通過比較熔解曲線、Ct值等判定出最適合的引物濃度、退火溫度等。

1.2.4 標準曲線的建立 將10倍梯度稀釋的7個梯度(10-1～10-7)的標準質粒DNA為模板進行real-time PCR反應。選取不同稀釋度模板的Ct值為橫坐標，拷貝數的對數為縱坐標，建立標準曲線。

1.2.5 靈敏度試驗 將標準質粒做10倍系列稀

釋，以不同稀釋度的標準質粒DNA為模板進行real-time PCR反應，以檢測該方法能夠檢出標準質粒的最小拷貝數，同時設置陰性對照。

1.2.6 特異性試驗 以狂犬病病毒(RV)、犬腺病毒2型(CAV-2)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬細小病毒(CPV)等核酸為模板，進行real-time PCR反應分析其特異性。并設置陰性對照。

1.2.7 重復性試驗 以5個梯度(4.67×108copies/μL～4.67×104copies/μL)的標準質粒為模板，進行real-time PCR反應。分別以標準質粒為模板進行組內和組間差異分析，分析試驗的重復性，計算組間和組內的變異系數。

1.2.8 犬血清檢測 采用優化的反應體系和條件進行臨床樣品的檢測。根據DNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA，用本試驗建立的real-time PCR方法和常規PCR方法對樣品進行檢測，比較兩種方法的陽性檢出率。

2 結果

2.1 目的基因的克隆及鑒定

利用ORF2F/ORF2R PCR擴增ORF2基因，克隆到pClon007載體構建重組質粒pClon007-ORF2。利用引物P1/P2對所構建的質粒進行PCR擴增，得到一條146 bp左右的DNA片段。將酶切pClon007-ORF2鑒定正確的質粒送吉林省庫美生物工程有限公司測序，測序結果與目的片段序列完全一致。

2.2 Real- time PCR 反應條件的確定

通過對反應的引物物濃度、退火溫度和循環數進行優化，最終確定real-time PCR反應總體積為20 μL，其中上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，2×SYBR Green熒光PCR反應液10 μL，質粒模板1 μL，補超純水至20 μL。同時設陰性對照。反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增40個循環。

2.3 標準曲線的建立

將標準質粒pClon007-ORF2 10倍系列稀釋后，進行real-time PCR擴增。結果顯示，標準曲線Ct值和標準DNA濃度間呈現良好的線性關系(圖2),斜率為-3.445,截距為41.861,相關系數為0.998。

圖2 標準質粒pClon007-ORF2的real-time PCR標準曲線

2.4 靈敏度試驗

以10倍系列稀釋的10個梯度的質粒DNA為模板，對標準品進行real-time PCR。結果顯示，當PCR體系中含有4.67×101copies/ μL (PCR)標準質粒DNA時，仍能產生特異性擴增(圖3)。陰性對照未出現特異性擴增。

圖3 Real-time PCR的敏感性分析

2.5 特異性

以狂犬病病毒(RV)、犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒2型(CAV-2)基因組為模板，用建立的real-time PCR進行擴增反應，驗證方法的特異性。結果顯示，均未出現特異性擴增(圖4)。

圖4 Real-time PCR的特異性分析

2.6 重復性檢測

將不同稀釋度的標準品pClon007-ORF2進行real-time PCR，用統計學軟件分析擴增結果，表明建立的real-time PCR方法組間和組內都具有良好的重復性，組間變異系數在0.584%～1.14%之間，組內變異系數在0.338%～1.642%之間。陰性對照無特異性擴增。

2.7 熔解曲線分析

本實驗利用優化的條件進行real-time PCR，標準品各濃度均在83.35℃處出現單一的特異性峰，波峰單一，無引物二聚體及未出現非特異性的擴增(圖5)。

圖5 Real-time PCR的熔解曲線

2.8 臨床樣品檢測結果

應用建立的real-time PCR方法檢測32份犬血清，共檢測出陽性樣品4份，陽性率約為12.50%，而本實驗建立的常規PCR[6]鑒定出陽性樣品3份，陽性率9.36%，說明所建立的SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測方法的靈敏度更高一些。

表2 實時熒光定量PCR檢測DogCV的組間統計

表3 熒光定量PCR檢測DogCV的組內統計

圖6 Real-time PCR臨床樣品檢測

3 討論

實時熒光定量PCR方法作為一種新技術，在動物傳染病中已被成功地應用豬圓環病毒2型、日本腦炎、禽流感等檢測及流行病學調查[7]。本研究采用的是實時熒光定量PCR方法中的染料法，相比較探針法需要設計出序列特異的引物且價格低廉。引物二聚體和非特異性擴增可以通過熔解曲線排除干擾[8]。實時熒光定量方法與普通PCR相比較可以實時監控整個PCR過程，該方法自動程度高，比較直觀的進行定量分析，同時也可以解決交叉污染等問題[9]。而普通PCR存在污染和假陽性問題，操作過程中因靈敏度不夠造成漏檢等問題[10]。

犬圓環病毒作為新發現的一種哺乳動物圓環病毒，被認為是犬的腹瀉、嘔吐和出血性腸炎的致病因子。臺灣Hsu HS等對2012年-2014年間收集的207只腹瀉犬和160只健康犬糞便樣本進行檢測，發現58只腹瀉犬(28.0%)和19只健康犬(11.9%)檢測出犬圓環病毒陽性[11]，腹瀉犬感染DogCV的陽性率要比健康犬陽性率高。

Linlin L等[2]建立的PCR方法發現腹瀉犬與犬圓環病毒共感染率為68%(13/19)，通過原位雜交技術和投射電鏡技術檢查4只狗的脾臟和淋巴結發現血管損傷和組織細胞炎癥。ORF2基因為DogCV的衣殼蛋白，是主要的抗原基因，也是PCR鑒別診斷的首選基因。本研究針對GenBank DogCV JZ/98株ORF2基因序列設計引物，通過反應條件優化建立了DogCV的檢測real-time PCR方法。結果表明方法的靈敏度高達到4.67×101copies/ μL，與狂犬病病毒、犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型無交叉反應，標準曲線Ct值和標準DNA濃度間呈現良好的線性關系,斜率為-3.445,截距為41.861，相關系數為0.998，組間變異系數在0.584%～1.14%之間，組內變異系數在0.338%～1.642%之間。用本研究建立的DogCV的real-time PCR對32份犬血清進行DogCV檢測，檢出的陽性樣品4份，其靈敏度高于普通PCR，可用于犬圓環病毒病快速診斷和流行病學調查。

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Development of a Real-time PCR Method for Detection of Dog Circovirus

SUN Wen-chao1,3,XIE Chang-zhan3,ZHAO Guang-yu3,CAO Liang3,ZHENG Min2,CAO Hui-hui1,2,ZHANG Hon-gyun4,WEI Xian-kai4,HAN Jic-heng3,WEN Shu-bo3,XIAO Peng-peng3,JIN Jie,ZHANG Ping3,LU Hui-jun3,JIN Ning-yi3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China；2.GuangxiCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Nanning,Guangxi,530001,China；3.InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine,TheAcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun,Jilin,130122,China; 4.YulinCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Yulin,Guangxi,537000,China)

Dog circovirus was found as a member of the family Circoviridae.This study was to establish a real-time fluorescence quantitative PCR method which can detect dog circovirus quickly and accurately in clinic．The conserved region of the ORF2 gene of dog circovirus was amplified by PCR and cloned into pClon007 vector.The pClon007-ORF2 plasmid DNA was used as template to optimize assay condition of developing a SYBR Green I real-time PCR for detection of dog circovirus.The standard curve produced a good linear relationship between Ct value and initial amounts of total DNA at a range of 4.67×109-4.67×103copies per microlitre,and the correlation coefficient and slope were 0.998 and -3.445 respectively.The sensitivity of this method was 4.67×101copies/μL.The specificity assay showed no amplification of RABV,CPV,CDV,CPIV,CAV-2.All standards are specific narrow melting peak at 83.35℃.The positive rates were 12.50%(4/32) of samples from Guangxi.

Dog circovirus; SYBR Green I; real-time PCR

2016-09-07

廣西自然科學基金項目(2012GXNSFAA053073)

孫文超(1987-)，男，山東泰安人，博士，主要從事分子病毒學研究。*通訊作者

S852.659.2

A

1007-5038(2017)05-0006-05