沙漠植物花花柴幼苗對高溫耐受性評價

王彥芹石新建李志軍

（1. 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，阿拉爾 843300；2. 塔里木大學生命科學學院，阿拉爾 843300；3. 塔里木大學植物科學學院，阿拉爾 843300）

沙漠植物花花柴幼苗對高溫耐受性評價

王彥芹1，2石新建1，3李志軍1，2

（1. 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，阿拉爾 843300；2. 塔里木大學生命科學學院，阿拉爾 843300；3. 塔里木大學植物科學學院，阿拉爾 843300）

為開發利用沙漠植物花花柴的耐高溫特性，就花花柴對高溫耐受性進行了探測。采用不同的溫度（40、45和50℃）處理花花柴幼苗，分別在不同溫度的不同處理時間段用傳統方法測定了花花柴幼苗的相對電導率和MDA含量、SOD、POD和CAT的活性變化，臺盼藍組化染色面積，并利用隸屬函數法綜合分析了這幾個指標對評價花花柴對高溫耐受性的可靠性。結果顯示，（1）花花柴幼苗在40℃條件下，隨著脅迫時間延長，葉片相對電導率和MDA含量呈先升高后降低的趨勢，其保護酶系統的活性隨處理時間的延長逐漸升高，臺盼藍染色幾乎無著色。（2）在45℃條件下，處理2-8 h時間段，各項生理指標變化不顯著，而在處理12 h以后，相對電導率、MDA含量顯著增加，保護酶活性顯著降低；臺盼藍染色面積隨著處理時間的延長逐漸增大。（3）在50℃處理時，花花柴幼苗葉片的MDA含量、相對電導率逐漸升高，且呈顯著水平，其保護酶活性在處理1 h時達到最高，之后顯著降低；臺盼藍染色面積隨著處理時間的延長逐漸增大、著色變深。通過隸屬函數法綜合分析表明這5個指標可作為花花柴耐高溫性的評價指標，且花花柴對40℃不敏感，對45℃可耐受8 h左右，對50℃能耐受1 h左右，表明花花柴對高溫具有極強的耐受性。

花花柴；高溫脅迫；高溫耐受

非生物脅迫是導致作物減產甚至植株死亡的重要因素［1］。在非生物脅迫因子中，高溫是影響植物包括生長、發育、生殖及產量等整個生育期的重要逆境因子。隨著全球氣候變化，極端高溫對植物造成的脅迫正日益加劇，人們也越來越多的關注高溫對植物產生的影響。2015年7月，新疆出現歷史罕見的大范圍、長時間、高強度的高溫天氣。全疆平原地區均出現35℃以上的高溫，其中50縣市出現40℃以上的高溫；其中吐魯番東坎兒7月24日最高氣溫達47.7℃。高溫給人們生活、農作物及林果、尤其是棉花產量造成嚴重影響（http://www.xj-agri. gov.cn/nongyeyw/16643.jhtml）。有數據顯示，1980-2008年間，由熱脅迫給小麥和玉米分別造成5.5%和3.8%的減產，僅1980年和1988年的熱浪給美國農業分別造成550億美元和710億美元的損失［2］。

從宏觀上，高溫會導致本就脆弱的生態更加不堪一擊，嚴重時會引起草場退化、植被減少，沙漠擴展；從微觀上，高溫脅迫不同程度地影響著細胞中各種蛋白、膜系統、RNA的種類、細胞骨架結構、酶促反應效率的穩定性，以及細胞滲透壓，進而影響著代謝平衡的狀態［2］。因此，細胞膜透性、膜脂過氧化程度及保護酶系統的活性常被作為評價植物抗逆性的生理指標。而荒漠植物在長期的進化中形成了一整套應對各種自然環境脅迫的適應體系，以重建新的代謝平衡，這可使有機體發揮正常功能、繼續存活、甚至在高溫等逆境條件下保持產量。

花花柴（Karelinia caspia Less）又名胖姑娘、胖娃娃草，是菊科（Asteraceae）花花柴屬（Karelinia Less）多年生草本植物，在中國、蒙古、蘇聯的中亞和歐洲東部、伊朗和土耳其等地都有廣泛的分布，多生于干旱、半干旱地區河谷沖積平原及沙質草甸鹽土上［3］。我國主要分布于新疆準噶爾盆地和塔里木盆地、青海柴達木盆地、甘肅西北部和北部、內蒙古西部，常大片群生，極常見?；ɑú袢~片扁平且明顯肉質化，體內有發達的儲水組織，保水能力強［4］；具有較低的萎蔫系數、較強的繁殖特性以及葉片積累大量游離脯氨酸等特點以適應荒漠高溫干旱環境［5］。作為重要的防風固沙植物，花花柴具耐鹽堿、耐干旱、耐高溫以及耐沙埋等特性，是一種改善荒漠地區生態平衡的重要植物［6］。本研究所選的花花柴長期生長在塔里木盆地，該地區屬暖溫帶荒漠干旱氣候，全年日照時數 2 556.3-2 991.8 h，年平均氣溫8.9-11.4℃，夏季最高溫度達45℃以上，年降水量不足100 mm，年蒸發量（潛勢）在 1 900 mm以上。為了適應這種復雜惡劣的生態環境，花花柴進化形成了對高溫等逆境耐受性的生理特性。因此，本實驗以花花柴為材料，對花花柴幼苗進行持續高溫處理試驗，對高溫脅迫下花花柴幼苗生理生化特性變化進行比較，評價花花柴對高溫的耐受性，旨為花花柴耐高溫的生物學特性發掘和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

種子采集：本實驗所用的花花柴種子于2014年10月在阿拉爾市（40°32'N，81°17'E）的沙漠邊緣采得，種子經干燥后置于紙袋內，室溫通風保存備用。

1.2 方法

1.2.1 種子發芽及幼苗培養 將花花柴種子播種于營養缽（營養土∶蛭石=2∶1）中，每個營養缽播種15粒，待大部分種子萌發后，用自來水澆灌，每周1次，每次澆透。室溫（25±2℃），光照/黑暗為16 h/8 h，光強為600 μmol/（m2·s）培養至兩個月時，選取株高15-20 cm大小長勢良好的幼苗進行高溫脅迫實驗。

1.2.2 高溫處理 將所選取幼苗的花盆分別放入40、45和50℃培養箱中，光照時間及光照強度不變：光照/黑暗為16 h/8 h，光強為600 μmol/（m2·s）。對40℃處理的幼苗，分別在處理6、12、24和48 h時采集幼苗葉片；對45℃處理的幼苗，分別在處理2、4、6、8、12和24 h時采集幼苗葉片；對50℃處理的幼苗，分別在處理1、2、3和4 h時采集幼苗葉片；分別進行丙二醛、電導率、SOD、POD及CAT指標的檢測，每個處理設3次重復。

1.2.3 對照的設置 以高溫處理前采集的幼苗葉片（即25℃條件）為對照（ck），測定丙二醛、電導率、SOD、POD及CAT指標，每個指標設置3個重復。1.2.4 檢測方法 采用硫代巴比妥酸法［7］測定丙二醛。采用浸泡法［8］測定電導率。采用氮藍四唑（NBT）法［7］測定SOD。采用紫外吸收法［7］測定CAT。

臺盼藍染色法：將4 g臺盼藍加少量蒸餾水研磨，用雙蒸水定容至100 mL，并過濾配制成4%（g/v）的臺盼蘭溶液，將待檢測樣品完全浸泡在臺盼藍溶液中染色，30 min后吸盡染色液，用蒸餾水清洗3次，最后在蒸餾水中浸泡1 h，充分洗脫吸附在樣品表面的染料，最后再拍照觀測染色結果。每個處理重復3次，實驗結果為3次實驗的平均值取標準差。利用Excel，SPSS17.0軟件對實驗數據進行差異顯著性分析、相關分析和作圖。

2 結果

2.1 高溫對花花柴幼苗葉片膜脂過氧化及膜透性的影響

2.1.1 高溫處理下花花柴幼苗葉片中MDA含量的變化 在40℃高溫處理6 h內，細胞MDA含量急劇升高，在6 h處達到最高，為對照的2.7倍；隨著脅迫時間延長，MDA含量逐漸降低，并在脅迫12 h后保持穩定，為對照的1.8倍（圖1-A）。在45℃高溫處理下，隨著脅迫時間的延長，MDA含量逐漸增加；在處理前4 h內，幼苗葉片MDA含量逐漸升高，彼此差異顯著；在脅迫4-8 h內，MDA升高緩慢，且無顯著差異，該階段高溫條件下MDA含量為對照的3.1倍；在處理12 h后，MDA含量顯著上升，在處理24 h時，其MDA的含量為對照的6.1倍（圖1-B）。由圖1-C看出，在50℃高溫處理下，花花柴幼苗葉片MDA含量隨著脅迫時間的延長而增加，在處理的各時間段，其MDA含量與對照相比差異顯著；在處理4 h時幼苗MDA含量達到最高，為對照的7.4倍。

圖1 高溫處理下花花柴幼苗葉片MDA含量的測定結果

2.1.2 高溫處理下花花柴幼苗葉片中相對電導率的變化 在40℃處理下，花花柴葉片相對電導率呈先升高后降低趨勢，在處理12 h時達到最高，為對照的4.9倍，在處理6 h和12 h時其值無顯著差異；隨著處理時間的延長，相對電導率顯著下降，為對照3.1倍左右，在處理24 h后其電導率變化不顯著（圖2-A）。在45℃處理條件下，隨著脅迫時間延長相對電導率逐漸增加；在脅迫前2 h內，相對電導率急劇升高；在隨后的2-8 h內，相對電導率彼此無顯著差異，為對照的4.8倍左右；在處理12 h后，相對電導率急劇上升，且在處理8 h、12 h和24 h時的相對電導率彼此差異顯著，在24 h處達到最高，為103.5%，是對照的7.4倍（圖2-B）。在50℃處理條件下，花花柴幼苗葉片相對電導率隨著脅迫時間的延長而顯著增加，且各處理時間段的相對電導率與對照差異顯著；在高溫脅迫3 h內，幼苗相對電導率為77.4%-92.3%，脅迫4 h時達到最高，為233%，是對照的16.6倍（圖2-C）。

圖2 高溫處理下花花柴幼苗葉片相對電導率的測定結果

2.2 高溫對花花柴幼苗葉片保護酶系統的影響

2.2.1 高溫脅迫對花花柴幼苗葉片SOD活性的影響 通過對保護酶SOD活性的測定，結果（圖3-A）顯示在40℃處理下，花花柴幼苗葉片SOD活性隨處理時間的延長逐漸升高。在處理前24 h內，SOD活性顯著升高。在此時間內各脅迫時間段的SOD活性與CK相比差異顯著；脅迫24 h后，SOD活性趨于穩定，在24 h和48 h時的SOD活性無顯著差異，為CK的4.8倍。在45℃條件下（圖3-B），隨著處理時間的延長幼苗SOD活性呈先上升后降低趨勢。在處理前8 h內，葉片SOD活性隨著脅迫時間延長顯著上升，在此時間段內的各脅迫時間處的SOD活性與CK差異顯著，并在8 h處達到最大，為CK的6.4倍；在脅迫12 h后，SOD活性迅速下降，在24 h是為對照的91.1%。在50℃高溫處理下（圖3-C），幼苗葉片SOD活性在處理1 h內急劇升到最高，為對照的5.9倍；隨著脅迫時間的延長SOD活性又迅速下降，在脅迫4 h時降到最低，僅為對照的78.8%。

圖3 高溫處理下花花柴幼苗葉片SOD活性的測定結果

2.2.2 高溫處理對花花柴幼苗葉片POD活性的影響 通過對保護酶POD活性的測定，在40℃條件下，花花柴幼苗葉片POD隨著高溫脅迫時間延長呈先升高后降低趨勢。在脅迫前12 h內，POD活性迅速升高，在6 h和12 h處的POD活性與CK差異顯著，脅迫12 h后，POD活性下降，在12 h和24 h處的POD活性無顯著差異。POD活性在12 h處的達到最高，為CK的1.6倍；在48 h處降到最低，為CK的84.9%。因此，40℃脅迫下（圖4-A）花花柴的POD耐熱時間臨界值為12 h。在45℃高溫脅迫下（圖4-B），隨著脅迫時間延長幼苗POD活性呈先上升后降低趨勢。在脅迫前4 h內，葉片POD活性在2 h處略有下降后，隨著脅迫時間延長急劇上升，并在4 h處達到最大，為CK的1.16倍；在脅迫6 h后，POD活性迅速下降，在24 h處降到最低，為對照的9.6%；在此時間內的各脅迫時間處的POD活性差異顯著。因此，45℃脅迫下花花柴的POD耐熱時間極限值為4 h。在50℃高溫脅迫下（圖4-C），幼苗葉片POD活性在脅迫1 h內急劇升到最高，為對照1.3倍；隨后隨著脅迫時間的延長POD活性又迅速下降，在脅迫4 h時降到最低，為對照的12.7%。因此，50℃脅迫下花花柴的POD耐熱時間極限值為1 h。

圖4 高溫處理下花花柴幼苗葉片POD活性的測定結果

2.2.3 高溫處理對花花柴幼苗葉片CAT活性的影響 通過對各溫度處理下花花柴葉片CAT活性的測定結果比較發現，40℃條件下（圖5-A），花花柴幼苗葉片CAT隨著高溫脅迫時間延長逐漸升高，在處理24 h時，CAT活性達到最高，為對照的2.2倍，且在此時間內的各脅迫時間處的CAT活性差異顯著；脅迫24 h后，CAT活性趨于穩定，且在24 h和48 h處無顯著差異。在45℃和50℃處理下，隨著處理時間的延長，花花柴幼苗葉片的CAT活性呈先上升后降低趨勢。45℃條件下（圖5-B），在處理前8 h內CAT活性達到最大，為對照的1.8倍。在此時間內的各脅迫時間處的CAT活性與對照差異顯著，但在處理2 h、4 h和6 h彼此無顯著差異；在處理12 h后，CAT活性迅速降低，在24 h處降到最低，為對照的29.5%。在50℃處理下（圖5-C），幼苗葉片CAT活性在處理1 h內與對照沒有差異，隨著處理時間的延長CAT活性迅速下降，且各處理時間段的CAT活性差異顯著。

圖5 高溫處理下花花柴幼苗葉片CAT活性的測定結果

2.3 高溫脅迫下花花柴幼苗葉片臺盼藍染色觀察結果分析

在40℃的條件下，臺盼藍染色結果（圖6）顯示48 h內花花柴幼苗葉片未著色；在45℃處理花花柴幼苗，6 h后，葉片出現藍色斑點，隨著脅迫時間的延長，斑點越多、著色面積越大；在50℃的高溫脅迫下，脅迫1 h葉片就出現藍斑，脅迫時間越長，葉片染色范圍越大、顏色越深。

圖6 高溫處理下花花柴幼苗葉片臺盼藍染色結果

2.4 利用隸屬函數法綜合評價花花柴對高溫的耐受性

采用模糊數學隸屬函數法綜合評價花花柴對高溫的耐受性［9］。結果顯示，評價指標中相對電導率、丙二醛和臺盼藍染色相對面積與花花柴的抗高溫呈負相關性，而POD，CAT，SOD均屬于保護酶與抗高溫呈正相關性，表明這6個指標都可以作為評價花花柴對高溫的耐受性指標。在40℃處理下，6 h和12 h時隸屬函數值小于0.5，其他處理的隸屬函數值大于0.5；在45℃處理下，12 h和24 h時隸屬函數值小于0.5，其他處理的隸屬函數值大于0.7；在50℃處理下，3 h和4 h時的隸屬函數值小于0.5，1 h和2 h時隸屬函數值大于0.5。

3 討論

植物在高溫脅迫下，產生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），致使細胞膜膜脂發生過氧化、膜蛋白變性、生理生化代謝失衡和異常［2，10］，并產生有害物質，如丙二醛MDA；同時高溫還會引起生物膜的疏水鍵斷裂，導致細胞膜流動性和通透性增加，膜的選擇性吸收功能喪失，細胞內電解質外滲，電導度升高［11］。因此，MDA和相對電導率被作為評價細胞膜膜脂過氧化程度和細胞膜完整性的重要指標。臺盼藍是一種高分子量的活性染色劑，作為一種細胞染料，可以穿過受損或者死亡的全透細胞膜，使不完整或死亡的細胞著色。因此臺盼藍染色的著色面積和染色深度也可以作為評價細胞死亡的指標。本實驗結果表明，在40℃條件下，幼苗MDA含量和相對電導率隨著脅迫時間延長均呈先升高后降低趨勢，表明花花柴幼苗在脅迫初期細胞膜系統受到損害［12］，隨后在一系列應激和保護系統的調節下，花花柴細胞重建了ROS等的平衡，并快速修復了細胞損傷［13］，臺盼藍染色的結果也表明在40℃條件下受損失細胞很少。但隨著溫度的進一步升高（如45℃和50℃），MDA含量和相對電導率在處理一定的時間內達到一定的平衡狀態，但隨著處理時間的延長，這種高強度長時間的高溫脅迫導致細胞膜的過氧化程度和膜透性發生了不可修復性的損傷，致使其MDA和相對電導率急劇升高，直至細胞凋亡［14，15］，相應的臺盼藍的相對染色面積也隨著處理時間的延長逐漸增大。這與研究人員關于高溫脅迫下水稻（Oryza sativa）［16］、芹菜（Apium graveolens）［17］膜穩定性影響的研究一致。而且這種結果符合沙漠植物花花柴的生態環境。本實驗所選花花柴長期生長在塔克拉瑪干沙漠邊緣，本地的溫度在夏季午時經常在45℃左右，因此40℃對花花柴不會造成不可逆的傷害，這與本研究的實驗結果一致。在自然狀態下，45℃高溫發生的時間大約在夏季白天13：00-17：00之間，最高溫度約在15：00-16：00之間，因此，在45℃和50℃處理下，花花柴分別可以耐受8 h和1 h，這種結果不僅與自然條件相符，也為花花柴高溫處理過程的溫度及處理時間設置提供了可靠的實驗支撐。

高溫對植物主要造成氧化脅迫。細胞內ROS的上升與保護酶清除ROS活性的增強，處在動態平衡狀態［2，10，11］。因此，保護酶系統（SOD、POD、CAT等）的活性則是評價細胞防止過氧化能力的重要指標。高溫脅迫致使RNA和蛋白質的種類發生變化，酶活性降低，大量活性氧（O2-、OH-和H2O2）生成并積累，這都會對植物造成不可逆轉的損傷［2］。植物為避免活性氧的損害，在一定范圍內會主動調控抗氧化保護酶（POD、SOD和CAT）系統的活性，清除過多的ROS，修復受損細胞［18］。從本實驗可以看出，在40℃脅迫下，3種酶活性在處理24 h時皆達到最高，隨后趨于穩定。說明花花柴的這3種酶在40℃條件下其活性不受影響。但在45℃和50℃條件下，SOD和CAT酶活性都隨著脅迫時間延長呈先升高后降低趨勢，說明在極端溫度處理下，葉片內抗氧化酶的活性在一定時間內具有防護作用，但隨著處理時間的延長，其活性受到影響而降低，這種結果進一步導致ROS產生不能及時清除從而大量積累，從而造成細胞死亡，最終致使植株死亡。從SOD和CAT的活性變化，隨著脅迫溫度的升高和脅迫時間的延長呈現出不同的差異性，對高溫脅迫的敏感性SOD＞POD＞CAT；這與研究人員對柑橘［19］、杜鵑花（Rhododendron simsii）的研究一致［20，21］。

4 結論

通過對花花柴幼苗生物膜膜脂過氧化程度（MDA）、膜透性（相對電導率）以及保護酶系統（SOD、POD及CAT）的測定結果比較分析以及與臺盼藍染色的相關性分析，結果顯示相對電導率、丙二醛和臺盼藍染色相對面積與花花柴的耐高溫性呈負相關性，而POD、CAT、SOD均屬于保護酶與耐高溫呈正相關性，說明這5個指標可以作為花花柴耐高溫性評價的有效指標。另外，實驗結果也說明花花柴可以耐受40℃，而對45℃的耐受時間拐點在8 h左右，對50℃的耐受極限時間在1 h左右。結果表明花花柴具有很強的耐高溫特性。

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（責任編輯 馬鑫）

An Evaluation on Heat Tolerance of a Desert Plant Karelinia caspia Seedlings

WANG Yan-qin1，2SHI Xin-jian1，3LI Zhi-jun1，2
（1. Xinjiang Production & Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin，Alar 843300；2. The College of Life Science in Tarim University，Alar 843300；3. The College of Plant Science in Tarim University，Alar 843300）

In order to explore and utilize the feature of heat tolerance of a desert plant Karelinia caspia，its heat tolerance during K. caspia seedling was evaluated. The 5 physiological indexes，relative conductivity，MDA content，activity variation of SOD，POD and CAT，as well as trypan blue staining in the K. caspia seedling leaves were measured at varied timeslots under different temperature treatments（40，45 and 50℃）by traditional methods. The reliability of using these indexes in the evaluation of the heat tolerance of K. caspia was comprehensively analyzed by subordinate function method. Results showed that：（1）Under 40℃，the relative conductivity and MDA content tended to increase during early stage of treatment and then reduce in K. caspia seedling with the stress time increasing. The activities of SOD，POD and CAT rose with treatment time longing. There was no coloration on the leaves of K. caspia by trypan blue staining.（2）Under 45℃，each index remained stable at 2-8 h after treatment. The MDA content and relative conductivity rose sharply at 12 h after treatment，but the enzymatic activities declined. With the extension treatment time，the relative coloration area of K. caspia leaves by trypan blue staining enlarged gradually.（3）Under 50℃，the MDA content and relative conductivity rose gradually to the significant level. The activities of SOD，POD，and CAT reached peak at 1 h after treatment，but rapidly decreased as treating time extending. With the extension of treatment time，the relative coloration area of K. caspia leaves by trypan blue staining enlarged gradually，and the color became heavily. The results of subordinatefunction method showed that these 5 physiological indexes could be used as the indicators of evaluating the feature of heat tolerance in K. caspia. In addition，the K. caspia was not susceptible to 40℃，and the tolerant time was 8 h under 45℃ and 1 h under 50℃，indicating that K. caspia is a highly tolerant plant to high temperature.

Karelinia caspia L.；high temperature stress；tolerance to heat stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.020

2016-08-16

國家自然科學基金項目（31460071），新疆生產建設兵團科技計劃項目（2012BB045）

王彥芹，女，博士，研究方向：植物逆境生物學；E-mail：wyqwxf@126.com

李志軍，女，博士，研究方向：干旱區生物多樣性保育；E-mail：lizhijun0202@126.com