維藥阿里紅中2個新三萜酸成分

韓建欣　袁濤

[摘要] 該研究旨在闡明維藥阿里紅的藥效物質基礎。采用各種現代色譜手段（MCI，ODS，硅膠等柱色譜以及半制備高效液相色譜）從阿里紅甲醇提取物中分離得到2個新的羊毛甾烷型三萜酸成分，通過一維，二維核磁共振、高分辨質譜等波譜手段鑒定其結構為12β， 15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid （1），3α， 12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid （2）。體外抗炎和細胞毒活性測試顯示，化合物1和2均未表現出抑制LPS誘導RAW264.7細胞NO的產生，以及抑制肝癌細胞HepG2生長的活性。

[關鍵詞] 維藥； 阿里紅； 三萜酸； 抗炎； 細胞毒

Two new triterpenoid acids from Uighur medicine Fomes officinalis

HAN Jianxin 1，2， YUAN Tao 1*

（1. The Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Arid Zone， Chinese Academy of Sciences，

State Key Laboratory of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization， Xinjiang Technical

Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China；

2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

[Abstract] Two new lanostane triterpenoid acids， 12β， 15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid （1）， and 3α， 12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid （2）， were isolated from the methanolic extract of Uighur medicine Fomes officinalis. Their structures were elucidated based on the analysis of spectroscopic data （1D， 2D NMR and HRMS）. Antiinflammatory and cytotoxicity assays revealed that both compound 1 and 2 show no inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideinduced RAW264.7 cells， and no cytotoxicity activities against HepG2 cells.

[Key words] Uighur medicine； Fomes officinalis； triterpenoid acid； antiinflammatory； cytotoxicity

阿里紅Fomes officinalis （Vill. Ex Fr.） Ames，又名苦白蹄、落葉松茸，維吾爾語音譯為“哈里坤”，為一種藥用真菌子實體，屬于多孔菌科Polyporaceae層孔菌屬Fomes，主要分布于新疆、東北、內蒙古等地[1]。阿里紅是我國新疆維吾爾民族醫生常用的治療藥物之一，民族醫生認為其入藥性燥、熱，有溫胃祛痰、降氣平喘、祛風除濕等功效，常用于治療慢性支氣管炎及哮喘等癥狀[1]。前期文獻調研發現，阿里紅中的化學成分主要包括三萜酸類成分、倍半萜、甾體類化合物、多糖以及一些其他的直鏈烷烴類結構，其中以三萜酸類成分最多[26]。阿里紅中分離得到的單體化合物的藥理活性的研究很少，大多集中在提取物以及阿里紅多糖的藥理作用研究，主要有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫以及平喘祛痰等作用[1]?；诒菊n題組對維吾爾醫常用藥材藥效物質基礎的研究興趣，前期已經從阿里紅的甲醇提取物中分離得到9個三萜酸類成分，且部分化合物表現出顯著的抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生NO作用[7]。在前期工作的基礎上，本課題組進一步對阿里紅的化學成分進行了研究，通過采用各種現代色譜手段（MCI，ODS，硅膠等柱色譜以及半制備高效液相色譜），從中又分離得到2個新的羊毛甾烷型三萜酸類成分，它們的結構經一維，二維核磁共振、高分辨質譜等波譜手段鑒定為12β，15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid（1），3α，12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid（2）。對化合物1和2進行了LPS誘導RAW264.7細胞產生NO的抑制作用以及HepG2細胞毒活性的評價。

1 材料

Varian 400 MHz核磁共振儀；美國魯道夫Autopol VI旋光儀；美國Thermo Fisher Nicolet 6700紅外光譜儀；ABsciex TripleTofTM 5600+高分辨質譜儀；日立Chromaster高效液相色譜儀；瑞士步琦旋轉蒸發儀；Phenomenex Luna C18 column （10 mm×250 mm，5 μm）半制備色譜柱；ODS （50 μm，日本YMC）；凝膠Sephadex LH20 （瑞典GE Healthcare BioSciences）； MCI （CHP20P，75～150 μm，日本三菱化工）；柱色譜硅膠（200～300目）及薄層色譜用GF254硅膠預制板，均為青島海洋化工廠生產；提取分離所用分析純試劑均購于探索平臺（上海）；半制備所用色譜純試劑為SigmaAldrich；SANYO MCO18AIC細胞培養箱；SpectraMax M2多功能酶標儀為美國Molecular Devices 公司；DMEM培養基為美國Hyclone；陽性對照地塞米松購于中檢所；腹腔巨噬細胞RAW264.7和肝HepG2購于中科院上海細胞所。

阿里紅2014年11月購于新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院，經新疆農業科學院微生物研究所楊新平副研究員鑒定為F. officinalis子實體，其憑證標本存放于中科院新疆理化技術研究所中科院干旱區植物資源化學重點實驗室，標本號為FO201411。

2 提取與分離

室溫干燥的阿里紅子實體（1.0 kg），粉碎，用純甲醇室溫浸提3次，每次用4.5 L甲醇浸泡7 d。提取液減壓濃縮得浸膏575.9 g。甲醇提取物浸膏分散在蒸餾水中依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到2個萃取物浸膏。乙酸乙酯萃取浸膏（135.8 g）經過MCI柱色譜，以甲醇水（50∶50～100∶0）梯度洗脫得到5個流分（A～E）。B流分（8.4 g）采用正相硅膠柱色譜，以氯仿甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脫得到7個流分（B1～B7）。B5（2.5 g）經反相C18硅膠柱色譜分離甲醇水（6∶4～1∶0）洗脫得到8個流分（B5a～B5h）。B5a（462.5 mg）經凝膠Sephadex LH20柱色譜分離純甲醇洗脫得到7個流分（B5a1～B5a7）。B5a4（182.0 mg）經正相硅膠柱色譜分離氯仿甲醇（30∶1～10∶1）梯度洗脫得到6個流分（B5a4a～B5a4f）。B5a4a（103.2 mg）經半制備HPLC（0～25 min， 60%～80%甲醇，流速為3 mL·min-1）制備得到化合物1（7.8 mg）。B5b（562.4 mg）經正相硅膠柱色譜分離氯仿甲醇（100∶1～5∶1）梯度洗脫得到6個流分（B5b1～B5b6）。B5b6（48.8 mg）經半制備HPLC（0～20 min，65%～77%甲醇，流速為3 mL·min-1）制備得到化合物2（5.1 mg）。

3 抗炎和細胞毒活性篩選

一氧化氮（NO）含量測定是采用Griess方法。具體如下：取對數生長期的RAW264.7細胞，按每孔7×105個細胞數接種于6孔板中，24 h后加入受試化合物（終濃度分別為40，13.3，4.33 μmol·L-1），1 h后加入LPS （1 mg·L-1）刺激24 h，無細胞上清液（50 μL）和50 μL 1%磺胺在5%磷酸溶液混合后在暗室下室溫孵育5 min，然后加入0.1%N（1萘基）乙二胺溶液50 μL，在酶標儀540 nm波長下讀數，以NaNO2標準曲線校準。地塞米松作為陽性對照藥品。細胞毒活性測試采用的是常規的MTT法。抑制率按照以下計算：抑制率=（A模型-A給藥）/A模型×100%。

4 結構鑒定和抗炎活性

化合物1 白色無定型粉末，[α]20D +10° （c 0.200，MeOH）；UV （MeOH） λmax 246 nm； IR νmax 3 376，2 926，1 699，1 566，1 453，1 408，1 022 cm-1；HRESIMS m/z 513.319 8 [M-H]-（計算值C31H45O6，513.321 6），結合核磁數據確定其分子式為C31H46O6，不飽和度為9。

從該化合物的1HNMR譜，見表1，可以清晰的觀察到5個叔碳甲基（δ 1.26，1.14，1.07，0.97，0.97，each 3H，s），3個仲碳甲基（δ 1.08，1.00，0.99，each 3H，d），2個烯氫信號（δ 6.00，br d，J=6.9 Hz，H7； 5.24，br s，H11），以及2個連氧次甲基質子信號（δ 4.29，dd，J=8.9，6.3 Hz，H15； 4.24，br s，H12）。該化合物的13CNMR，見表1，顯示了31個碳信號，結合HSQC譜將其分別歸類為8個甲基、5個亞甲基、9個次甲基（其中包括2個sp2雜化碳）和9個季碳（其中包括3個羰基碳）。綜合分析以上數據推測該化合物可能為24甲基羊毛甾烷型三萜[8]。在以上這些信息的基礎上，進一步詳細分析二維NMR（包括1H1H COSY，HSQC和HMBC）譜，該化合物的結構得以確定。首先由HSQC完成氫和與之相連的碳的歸屬，然后由1H1H COSY譜得出，見圖2，自旋偶合結構片斷（粗線表示的），然后這些片斷再通過一些關鍵的HMBC 相關和其他一些官能團連接起來。在HMBC譜中，可以觀察到Me19和C1（δ 36.3），C5（δ 50.6），C9（δ 145.4），C10（δ 36.8）；Me28（Me29）和C3（δ 217.5），C4（δ 47.1），C5，C29（C28）；H7和C9；H11和C8（δ 140.2）；Me18和C12（δ 73.5），C13（δ 49.3），C14（δ52.4），C17（δ 48.6）；Me30和C8，C13，C14，C15（δ 72.8）；Me21和C17，C20（δ 29.7），C22（δ 48.0）；H22和C23（δ 216.0）；Me31和C23，C24（δ 49.5），C25（δ 44.3）；Me27和C24，C25，C26（δ 182.7），見圖2a；以上這些HMBC相關就此構建了化合物1的平面結構。

化合物1的相對構型主要采用NOESY譜確定，見圖2b。首先通過觀察NOESY譜可以發現H329和H319，H319和H318；H318和H15之間的相關，表明Me29，Me19，Me18和H15處于同一面，將它們定為β構型；那么根據NOESY觀察到的H328和H5；H12和H330，H17之間的相關可以推測出Me28，H5，H12，Me30和H17為α構型。C17側鏈的立體構型則通過生源關系并對比它們的核磁數據得以確定[7]。因此，化合物1的結構確離得到的化合物officimalonic acid D非常相似[6]，唯一的區別在于化合物2缺少officimalonic acid D的3位丙二酸半酯的核磁信號，且化合物2的3位氫信號和碳信號均向高場分別位移了1.33和4.2（2：δH3.38，δC 74.0，officimalonic acid D：δH 4.71，δC 78.2），因此，推測化合物2的3位OH沒有被?；?。HMBC相關信號Me28（Me29）和C3，C4，C5和C29（C28）進一步支持了上述推斷。最后經過綜合分析詳細分析2D NMR（包括1H1H COSY，HSQC，HMBC，NOESY）譜最終確定了化合物2的結構見圖1，命名為12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid，經Scifinder檢索為新化合物。

化合物1和2的絕對構型是通過生源關系以及和已知類似化合物[9]的核磁數據對照得以確定見圖1。

5 結果與討論

24甲基羊毛甾烷型三萜為多孔菌科真菌的特征性成分，前期從該科真菌中分離得到了大量的該類成分[10]，結構變化主要集中在C17側鏈，C3，C12和C15的取代基，C7，C8，C9和C11是否以雙鍵形式存在。前期其他課題組對阿里紅的研究也報道了該類三萜成分[25]，課題組前期已經從阿里紅中分離得到9個該類型的三萜結構（其中8個為新化合物）[7]，很有意思的是前期分離得到的化合物的3位都取代了1個丙二酸半酯的結構片斷，這種結構特征在多孔菌科的其他種中報道過[11]，但很少在阿里紅中有報道，并且部分化合物表現出了很強的抗炎活性，而本次報道的2個化合物的3位都沒有丙二酸半酯的片斷，且沒有表現出抗炎活性，所以推測抗炎活性可能與這一結構特征有相關性。但是這種相關性需要進一步的實驗來驗證。通過本研究的結果表明阿里紅中的具有豐富的24甲基羊毛甾烷型三萜，其結構變化多樣，非常值得深入發掘。

[參考文獻]

[1] 張慧鋒，郭淑英，申蕾，等. 維藥阿里紅的研究現狀[J]. 吉林醫藥學院學報，2014，35（5）：354.

[2] Wu X， Yang J， Zhou L， et al. New lanostanetype triterpenes from Fomes officinalis [J]. Chem Pharm Bull， 2004， 52（11）： 1375.

[3] Wu X， Yang J， Yan M. Four new triterpenes from fungus of Fomes officinalis [J]. Chem Pharm Bull， 2009， 57（2）： 195.

[4] Anderson C G， Epstein W W， VanLear G. Minor triterpenoids of Fomes officinalis [J]. Phytochemistry， 1972， 11： 2847.

[5] 吳霞. 維吾爾藥阿里紅、阿育魏實的化學成分和生物活性研究[D]. 北京：中國醫學科學院北京協和醫學院，2005.

[6] 尤努斯江·吐拉洪，木妮熱·依布拉音，吐爾洪·買買提.阿里紅中總三萜酸的提取工藝優選及含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）：24.

[7] Han J， Li L， Zhong J， et al. Officimalonic acids AH， lanostane triterpenes from the fruiting bodies of Fomes officinalis [J]. Phytochemistry， 2016， 130： 193.

[8] 馮薇，楊峻山. 天然產物中羊毛甾烷型三萜的發現和活性研究進展[J]. 中國藥學雜志，2010，45（5）：321.

[9] Quang D N， Arakawa Y， Hashimoto T， et al. Lanostane triterpenoids from the inedible mushroom Fomitopsis spraguei [J]. Phytochemistry， 2005， 66： 1656.

[10] Grienke U， Zll M， Peintner U， et al. European medicinal polyporesA modern view on traditional uses [J]. J Ethnopharmacol， 2014， 154： 564.

[11] Sorribas A， Jimenez J I， Yoshida W Y， et al. Daedalols AC， fungalderived BACE1 inhibitors [J]. Bioorg Med Chem， 2011， 19： 6581.

[責任編輯 丁廣治]