一株海洋產電菌產堿性蛋白酶的初步研究

李鵬　苗增良　王建鑫

摘 要：從浙江省舟山海域潮間帶中得到一株產電細菌M2，經過16S rRNA分子鑒定及生理生化試驗，初步鑒定該菌為Shewanella屬細菌，并命名為Shewanella sp. M2。菌株M2在脫脂奶平板上能產生明顯且較大的水解透明圈，通過Folin-酚法進行酶活測定，初始蛋白酶酶活為110 U/mL，對其進行紫外誘變處理，最終得到酶活為205 U/mL的突變株，酶活提高了86.4%，傳代試驗結果顯示該菌株具有較好的遺傳穩定性能。

關鍵詞：產電菌；蛋白酶；Folin-酚法；紫外誘變

堿性蛋白酶在環保、絲綢、飼料、洗滌劑、食品、醫藥等領域廣泛應用，生產量可以達到酶制劑總產量的40%，經濟價值顯著[1]。堿性蛋白酶仍然存在品種單一的問題，酶的活性不高，價格昂貴，優質產酶菌株的篩選和選育有著十分重要的應用價值。Kunamneni Adinarayana[2]等發現一種蛋白酶，將其在60 ℃下保溫350 min，研究發現該酶仍保持了100%酶活力。Tsuyoshi Nonaka[3]等研究具有抗氧化性能的蛋白酶生產菌，并將其應用于洗滌行業。Raja等[4]利用鹽析及層析方法得到的酶，分子量約為51 000 Da，酶活力提高124倍。如今，在極端環境中發現的堿性蛋白酶已經成為研究的熱點[5]。

堿性蛋白酶的高產菌株仍舊集中在枯草桿菌屬，來源較為單一，導致目前的蛋白酶結構也較為單一。目前海洋來源的蛋白酶逐漸成為研究熱點，由于菌株所處環境的原因，可能生產出具有獨特酶學性質與結構的蛋白酶。

本實驗室在研究微生物燃料電池過程中發現一株海洋產電菌Shewanella sp. M2[6]，初始輸出電壓為75 mV，該菌在脫脂奶平板上產生了非常明顯的透明圈，通過酶活檢測，初始酶活較高，具有很好的選育價值，而產電菌產蛋白酶的報道則很少見，菌株M2具有很好的潛在研究價值。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養基 脫脂奶培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂20.0 g，pH 值72～7.4，加熱溶解于1 000 mL海水中，于121 ℃高壓滅菌30 min，備用。脫脂牛奶10.0 g，溶于1 000 mL海水中，于115 ℃滅菌30 min。使用前按照1∶1混勻得到培養基。

發酵培養基[7-8]：①酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO4 2.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5；②可溶性淀粉40 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，NaCl 5 g，K2HPO4 3.5 g，NaH2PO4 0.3 g，Na2CO3 0.56 g，人工海水 1 000 mL，調pH 7.5；③蛋白胨5.0 g，酵母膏30 g，葡萄糖5.0 g，人工海水 1 000 mL，pH 75；④牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脫脂奶10.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5。

產電基礎培養基[9]：NaCl 20.0 g， KCl 0.745 g，NaH2PO4 0.35 g， Na2HPO4 0.44 g， MgSO4 0.188 g，Wolfe 微量元素溶液10 mL，陳海水1 L。

1.1.2 試劑 1 000 μg/mL的標準酪氨酸溶液：將酪氨酸放于100～105 ℃的干燥箱中烘干3 h，冷卻后，稱取0.1 g溶于10 mL 5 mol/L的鹽酸中，再用0.1 mol/L的鹽酸稀釋100 mL，放置于冰箱中保存。

1.1.3 菌種 菌株Shewanella sp. M2，本實驗室篩選鑒定后提供，GenBank登錄號為KU865683。

1.1.4 產電裝置 利用試劑瓶型的微生物燃料電池測試產電量。首先，將目標菌種在產電液體培養基中培養至對數期，冷凍離心，加入陽極室并加入一定量的產電培養基，陰極加入等量產電基礎培養基，測量電壓。

1.2 實驗方法

1.2.1 平板篩選 將純化后的菌株M2點種于脫脂奶平板上，25 ℃培養，3 d后取出并觀察透明圈的產生。

1.2.2 酶活測定 將斜面保種的菌株分別接種于4種發酵培養基，裝量為50 mL/250 mL，控制轉速80 r/min，2～3 d后測酶活。

1.2.2.1 標準曲線繪制

根據酪氨酸在紫外波長275 nm下具有特征光吸收的原理，利用紫外分光光度法測定酶促反應后在275 nm下的吸光值，得到反應生成的酪氨酸的量，從而計算酶活。按照表1繪制標準曲線。

1.2.2.2 酶活測定

酶活力定義：以酪蛋白為底物，每分鐘水解產生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

發酵液5 000 r/ min進行離心，取上清，進行適度稀釋后測酶活，實驗過程參照表2，試管號1為空白對照。

U=（A×K×4）/（10×N）

其中U表示酶活，A表示吸光值，K為標準曲線的系數，4表示反應總體積，10表示反應時間，N為稀釋倍數。

1.2.3 紫外誘變 挑取純化后的斜面培養物一環接種于發酵培養基中，25 ℃，80 r/min培養3 d，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，制成一定濃度的菌懸液（OD600=0.5±0.15）進行紫外誘變。

紫外燈開啟，照射30 min后，取一定量的菌懸液放入6 cm培養皿中，30 cm垂直照射，先蓋蓋子1 min，后開蓋子，同時進行攪拌（可以滅菌后的大頭針代替轉子），照射時間控制為30、60、90、120、150及180 s。取在各個時間處理的菌液0.1 mL，并用無菌水稀釋至10-3濃度，分別在脫脂奶培養基上進行涂布，每個時間點做3個重復，做空白對照，涂布后于暗處培養2～3 d后觀察，選取HC比值較大的測酶活。希望獲得酶活明顯增加的突變菌株。

1.2.4 傳代試驗及產電試驗 將誘變得到的高產菌株進行遺傳穩定試驗，轉接12代，分別測酶活及產電量。

2 結果與分析

2.1 平板試驗結果

菌株M2點種于脫脂奶培養基上，3 d后觀察結果如圖1所示，HC比值為4.3～4.7。

2.2 酶活的測定

2.2.1 標準曲線 用100 μg/mL的酪氨酸標準溶液配制標準系列溶液，以“0”號管為空白對照，不同含量的酪氨酸的吸光度值結果見表3。

吸光值A為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，繪制結果見圖2，得到的回歸曲線方程為y=0.009 2 x-0.009 1，R2=0.996 8，R2的值大于0.99，顯然該方程具有較好的線性相關性。

2.2.2 不同發酵液的酶活測定 繪制標準曲線后，在1-4號發酵培養基中測到的酶活如下表4所示，結果顯示可溶性淀粉培養基作為發酵培養基可以獲得較高的酶活，酶活達到110 U/mL。

2.3 紫外誘變結果

紫外線誘變結果顯示，在紫外照射時間為90～150 s時候具有較好的觀察結果，30 s照射時間導致菌落數太多無法很好觀察，照射時間達到180 s時則基本沒有菌落生長，最終在照射時間為120 s的平板上，測到HC值為5.8的菌落，進行酶活測定，最終酶活為175 U/mL，相比初始酶活，酶活提高了59.1%，提高顯著。對M2突變株進行產電試驗，獲得的輸出電壓為105 mV，比初始輸出電壓75 mV提高了40%。

2.4 遺傳穩定性試驗

將紫外誘變后的菌株進行遺傳穩定性試驗，結果如表4所示，在連續傳代10代，酶活為160 U/mL，酶活減少8.6%，遺傳性較為穩定，12代時酶活降低到130 U/mL，酶活降低25.7%，此時產酶穩定性顯著降低。輸出電壓也在12代時降低到70 mV，減少33.3%，輸出電壓的能力也明顯降低。

3 討論

在舟山潮間帶海域中篩選得到一株產電菌Shewanella sp. M2，脫脂奶平板試驗顯示其具有產蛋白酶能力，在可溶性淀粉發酵培養基得到最大產酶活性，酶活達到110 U/mL，利用紫外線對菌株進行誘變處理，得到誘變株的酶活為175 U/mL，酶活提高為59.1%，輸出電壓為105 mV，比初始輸出電壓提高了40%，遺傳穩定性試驗顯示，在傳代到10代以后酶活及輸出電壓才有降低，連續傳代10代的遺傳穩定性較高。

為了獲得更加穩定而高產的突變菌株，目前誘變育種已經與基因工程進行很好的結合。Wang 等[10]從海洋微生物菌株Pseudomonas sp.中發現OFR編碼一組無信號肽的氨基酸，在Escherichia coli 成功進行表達。 Jas min等[11]克隆到海洋來源的堿性蛋白酶基因，嘗試構建其三維結構。

產電菌多為厭氧菌和兼性厭氧菌，產電菌產蛋白酶的報道很少，這次研究發現對于深入研究產電菌具有很好的價值。

參考文獻：

[1]

Gupta R，Beg QK，Lorenz P.Bacterial alkaline proteases： molecular approaches and industrial applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59（1）：15-32

[2] Kunamneni Adinarayana，Poluri Elllaiah，Davuluri Siva Prasad et al.Purification and Partial Characterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a Newly Isolated Bacillus sublitis PE-11[J].AAPS PH armSciTech2003；4（4）： 65-72

[3] Tsuyoshi Nonaka， Masahiro Fujihashi， Akiko Kita， Katsuhisa et al. The crystal structure of an oxdatively- stable subtilisin alkaline serine protease， KP-43， with a C-terminal β- barrel domain [J] J. Biol. Chem.2004，45： 47344-47351

[4] Raja Noor Zaliha Raja Abd Rahman， Lee Poh Geok， Mahiran Basri， et al. An organic solvent- stable alkaline protease from Pseudomonas aeruginosa strain K： Enzyme purification and characterization [J]. Enzyme and Microbial Technology， 2006，7：1484-1491

[5] Mala B.Rao，Aparna M. Tanksale，Mohini S.Ghatge et al. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Protease[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，Sept.1998：597-635

[6] 李鵬，廖智，苗增良，等.1株海洋產電細菌的篩選鑒定及產電條件的優化[J].浙江農業科學，2016，57（9）：1536-1542

[7] [德]B·施特爾馬赫著，錢嘉淵譯.酶的測定方法[M].北京：中國輕工業出版社，1992：243

[8] 戴玄，唐兵，陳向東等.產高溫蛋白酶微生物菌種資源的研究[J].微生物學雜志，1997，17 （3）：25-28

[9] Bond DR，Lovley DR.Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（3）：1548-1555

[10] WANG Shuai， LIN Xuezheng， HUANG Xiaohang et al， 2012.Screening and characterization of the alkaline protease isolated from PLI-1， a strain of Brevibacillus sp. Collected from Indonesias hot springs[J]. Oceanic and Coastal SeaResearch， 11（2）： 213-218

[11] Jasmin C， Sreeja Chellappan， Rajeev K Sukumaran et al， 2010. Molecular cloning and homology modeling of asubtilisin-like serine protease from the marine fungus[J]，Engyodontium album BTMFS10. World J Microbiol Biotechnol， 26： 1269—1279

Production of Alkaline Protease by A Marine Electric Bacteria Strain

LI Peng，MIAO Zengliang，WANG Jianxin

（Marine Science & Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China）

Abstract：An electricity-producing strain was obtained from Zhoushan intertidal zone in Zhejiang.16 s rRNA molecule identification，physiological and biochemical experiments showed that the strain belongs to Shewanella and was named Shewanella sp. M2. Strain M2 can produce clear and large hydrolysis transparent circle on the skimmed milk tablet. Its initial protease enzyme activity was 110 U/mL determinated by Folin-phenol method. Ultimately the enzyme activity of mutant strains was 205 U/mL after ultraviolet mutation， Enzyme activity increased by 86.4%. Genetic testing showed that the strain has good genetic stability.

Key words：Alkaline Protease；Folin-phenol method；ultraviolet mutation

（收稿日期：2016-12-14）