中藥血清藥物化學研究進展

馬飛祥　薛培鳳　王媛媛　王怡諾　薛淑媛??

[摘要] 中藥血清藥物化學是通過口服給藥后，對血中移行成分進行鑒定分析，從而快速篩選藥效物質基礎及揭示復方配伍規律的有效方法。在近20年的發展中，得到了眾多學者的認可及普遍應用。隨著血清藥物化學和血清藥理學、藥代動力學、代謝組學、網絡藥理學、系統生物學等學科的交叉融合，其在溝通藥物體內外變化、藥物之間的相互作用、藥物與機體之間的相互作用等方面體現出了較強的優越性，契合了中藥配伍使用、多成分、多靶點、多種作用機制的復雜性。該文通過查閱2013—2016年CNKI Scholar 和 Pubmed 2個數據庫中與中藥血清藥物化學相關的文獻，對有關的研究成果進行了統計分析，并對血清藥物化學研究中供試樣品制備、實驗動物選擇、給藥方案確定、取血方式和時間、血樣制備和處理、血中移行成分分析等關鍵技術難題及多種解決方法進行了經驗性歸納，同時，展望了中藥血清藥物化學的拓展及綜合應用，以期為該方法在中醫藥研究中更好的應用奠定基礎。

[關鍵詞] 血清藥物化學； 血中移行成分； 藥效物質基礎； 中藥復方

Research progress of serum pharmacochemistry of traditional Chinese medicine

MA Feixiang， XUE Peifeng*， WANG Yuanyuan， WANG Yinuo， XUE Shuyuan

（College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China）

[Abstract] Serum pharmacochemistry of traditional Chinese medicine（TCM） is an effective method to rapidly screen the effective substances and reveal the compatibility law of compound by identification and analysis of constituents migrating to blood after oral administration. In the last two decades， it has been universally accepted and widely applied in the field. With the crossfusion with other disciplines， such as serum pharmacology， pharmacokinetics， metabolomics， network pharmacology and systems biology， serum pharmacochemistry shows comprehensive superiority in explaining drug changes in vivo and in vitro， interactions between drugs， interactions between drug and body， which coincides with the complexity of TCM compatibility， multicomponents， multitargets and multimechanisms. Based on the references related with the serum pharmacochemistry from CNKI scholar and Pubmed in 2013—2016， the research results of serum pharmacochemistry were statistically analyzed， and the key technical problems during the study of serum pharmacochemistry， for example， preparation of test sample， selection of experimental animal， determination of drug delivery scheme， method and time of the adoption blood， preparation and pretreatment of blood sample， as well as analysis of constituents migrating to blood， and the solving ways were empirically introduced. In addition， the development and comprehensive application of serum pharmacochemistry in TCM were summarized in this paper， hoping to lay a foundation for the further application of this method in TCM research.

[Key words] serum pharmacochemistry； constituents migrating to blood； effective substances； Chinese medicine compound

中藥是在中醫理論指導下用于預防、治療疾病或調節人體機能的藥物。從古至今，中藥經過數千年的臨床實踐，療效確切，是維護我國人民健康的重要手段，也是中華民族傳統文化的瑰寶。但由于中藥化學成分和人體系統的復雜性，導致發現中藥有效成分及藥效物質基礎、探索中藥作用機制和復方配伍規律等問題很難闡明，大大阻礙了中藥的科學應用和國際推廣，使得中藥的發展面臨困境?；诖?，我國學者王喜軍教授經過大量實踐和總結，于1997年提出了“中藥血清藥物化學”，即中藥經口服給藥后，制得含藥血清，分析鑒定或表征血中移行成分，研究血中各個成分體內的變化過程，揭示藥效物質基礎，解析方劑配伍規律等問題的研究方法[1]。本文作者就中藥血清藥物化學在近年中的發展進行回顧，綜述2013—2016年相關的研究成果及技術操作經驗，展望中藥血清藥物化學與其他學科的交叉與應用。

1 研究成果及發展趨勢

分別在CNKI Scholar 和 Pubmed中檢索血清藥物化學相關的中英文文獻。所查范圍為2013年1月至2016年11月，在 CNKI Scholar 以“血清藥物化學”及“血中移行成分”搜索到相關中文文獻208篇，Pubmed以“Serum Pharmacochemistry”檢索到149篇文獻。下載后，以是否建立血清指紋圖譜，或是否對血中移行成分分析及鑒定為標準，使用Endnote 軟件對其篩選，得到有效期刊論文93篇，相關學位論文43篇，綜述21篇，見圖1。

其中，共發現了959個血中移行成分，藥物原型入血487個，鑒定239個；代謝新物質344個，鑒定49 個；還有128個未定性的入血成分，見圖2。

綜上，比較2003—2013年的論文數量、血中移行成分的分析及鑒別程度，都以成倍的速度發展，血清藥物化學相關研究在近年的研究趨勢可見一斑[2]。

2 血清藥物化學中的關鍵技術

2.1 供試樣品的制備

供試樣品的制備多分為2種：①按中藥原方配伍，以原劑型制備工藝制備，韓旭陽等[3]按原方湯劑比例將各藥材稱取后，其中4味藥以10倍量水回流提取2次，每次1 h，合并，濃縮；后將剩余2味藥以10倍量95%乙醇提取2次，每次1.5 h，合并，回收至無醇；將上述提取物合并，備用；②制備藥物有效部位，王永林等[4]將杜仲的水提物經正丁醇萃取，回收溶劑后水溶，過D101大孔吸附樹脂柱，收集40%乙醇洗脫部分，制得有效部位進行血中移行成分研究。

也有學者以含藥血清中峰數、峰面積以及主要入血成分含量為指標，對藥物的水提物、醇提物、傳統劑型提取物及現代劑型提取物進行了考察，最終選定較好的制備方法[5]。

2.2 實驗動物

通常依據藥物的性質和適應癥對實驗動物的種類、性別、生理狀況等進行篩選，一般以大鼠為實驗對象。其中實驗動物的生理狀況對研究結果的影響已引起部分學者的關注，Wang等[6]分別用正常大鼠和急性血瘀模型大鼠進行大黃和酒炙大黃的血清藥物化學研究。給予大黃后，發現蘆薈大黃素O二葡萄糖醛酸苷和大黃素O二葡萄糖醛酸苷僅存在于正常大鼠血清。給予酒炙大黃后得到相同結果，且在正常大鼠血清中還發現了大黃酸1O葡糖苷和決明酮8O葡萄糖醛酸苷2個新的代謝產物。姚紅銳等發現毛菊苣有效部位在正常大鼠中有6個入血成分，但在高脂模型大鼠中僅檢測到1個微量成分。有學者認為病理模型的含藥血清因更能反映藥物的體內變化而更具研究價值。但在近年文獻中，絕大多數學者選擇正常動物作為實驗對象，可能由于病理條件下機體免疫能力激活，對含藥血清較正常狀態下存在一定“消耗”，導致血中移行成分減少，不便于檢測分析[7]。

2.3 給藥方案

給藥劑量一般為臨床等效劑量或極限給藥劑量（最大耐受量或半數致死量），可通過預實驗研究確定。通常以水溶樣，灌胃給藥，一般大鼠的灌胃量為0.02～0.03 mL·g-1。由于藥物水溶性的問題，可能使給藥體積太大，導致大鼠出現嘔吐不適或檢測不到血中移行成分的現象。遇此情況，可將藥物通過凍干粉干燥及噴霧干燥技術進行提取物濃縮，其中前者較后者要求更好的水溶性，但其回收率較后者更高。李越峰等[8]將四逆散以芍藥苷等主要化合物含量為指標，制成凍干粉后給藥，通過10批樣品建立了血清指紋圖譜，具有良好的特征性和專屬性。此外，也可加入適當比例的助溶劑（CMCNa，1，2丙二醇等）制成灌胃液。劉佳麗等[9]對逍遙散乙醇提取物的石油醚萃取物進行血清藥物化學研究，用1，2丙二醇水制得灌胃液，得到了可喜的研究成果。

不同研究所采用的給藥次數不盡相同，通常有幾下幾種：①給藥前12 h禁食，自由飲水，早晚各給藥1次，連續給藥3 d，取血備用，李永軍等利用此法給藥，對不同的單藥[10]及復方[11]進行了血清藥物化學研究；②給藥前12 h禁食，自由飲水，一次性給藥適量，取血備用，李廣雷等[12]以此法給藥，對西洋參枸杞子膠囊進行了入血成分的分析；③以原藥治病原則為指導，以人服藥方式及療程為依據，對實驗動物等效實施，雷志丹等[13]以臨床為指導，每天1次，連續給藥12 d，研究建立了舒胸片的含藥血清指紋圖譜；④短時間內連續給藥，Wang等[14]以連續灌胃3次，每次間隔1 h的形式，對當歸芍藥散進行了血清藥物化學研究，向青等[15]也以此形式對栝樓桂枝湯的血中移行成分進行分析，鑒定了其中16個成分。

2.4 體內樣品的采集、制備、處理

2.4.1 血樣采集 通過以上文獻統計，總結近年血清藥物化學研究中血樣采集方式，見表1。

肝門靜脈取血 操作較簡捷，取血量較多，實驗動物不能存活，適合單次取血 包含最原始吸收入血成分，也包含體循環中血液含有的成分，便于血清藥物化學初探研究

腹主動脈取血 操作簡單，取血量更大，實驗動物不能存活，適合單次取血 血中移行成分多為代謝產物，為血清藥物化學研究后期主選，如血清藥理學研究、制備血中移行成分等

眼眶后靜脈叢取血 取血量較少，但可多次取血，操作要求較高，檢測器要求高，一般為LCMS等 可考察一段時間內，同一實驗動物的血中移行成分的變化

尾靜脈取血 與眼眶后靜脈叢取血特點相似，但操作容易，在多次取血方面更易達到要求

由于不同藥物在機體內的ADME截然不同，需根據研究目的及預實驗找到具體的采血時間。李強等[16]在三黃湯的血清藥物化學研究中，采用腹主動脈取血，于0.08～12 h的12個時間點進行采血，發現32個主要入血成分，鑒定和歸屬了其中29個成分。Zhang等[17]將刺五加灌胃給藥60 min后，肝門靜脈取血，發現了12個原型成分，9個代謝成分，較體外131個成分得到了快速的篩選。Fan等[18]將通脈養心丸的甲醇提取物灌胃給予大鼠，分別于給藥后1 h和2 h，眼眶后靜脈叢取血，通過UPLCQTOFMS檢測，發現40個血中移行成分，并對其中甘草素、異甘草素、甘草酸、甘草次酸的藥代動力學進行了深入研究，證明了方中桂枝對甘草中這4個成分的體內吸收起到促進作用，表明方中甘草桂枝配伍具有增效作用。盧芳等[19]采用尾靜脈取血的方法對黃連1，1.5，1.75，2，2.25，2.5，3，4 h入血成分進行研究，最終發現在2 h時血中移行成分的含量達到峰值。除上述4種常用取血方法外，向文英等[20]采用股動脈取血的方法，檢測到了頭花蓼含藥血清中的18個血中移行成分。

2.4.2 血樣制備 血樣通常分為血清及血漿。若需制得血漿，則需在取血管內加入適量抗凝劑（多為肝素），血清則無要求，見表2。實際研究中，為提高血中移行成分的檢測濃度，減弱個體差異性，增加研究的合理性和操作性，可將同組中不同實驗動物的血樣混合處理[2123]。

2.4.3 血樣處理 血樣中含有的多種內源性蛋白嚴重干擾血中移行成分的檢測分析，故應首先去除蛋白質。主要方法有溶劑法、酶解法、超濾法、加熱法等。處理后，有時因其他內源性物質的干擾或待測組分的含量較低等原因，導致檢測時干擾物質過多不便分析或未達到檢測限度的現象，可通過分離純化法進行選擇性提取及富集予以解決?？偨Y所查文獻，發現近年除蛋白質的方法以溶劑法為主，分離純化法以萃取法為主，見表3。

2.5 血中移行成分分析

血中移行成分的確認、鑒定及分析方法，多是建立在不同級別的LCUV及LCMS技術上，通過不同的分析方法得出結果。除直接將體外圖譜、體內空白圖譜、對照品與血樣的圖譜通過保留時間及一些特征性指標核對外，吳賢波等[32]采用HPLCQTOF Ⅱ技術對防風的血中移行成分采用有機溶劑沉淀 加入與水混溶的有機試劑，一般多為甲醇與乙腈，得到其上清液pH 8.5～9.5，較乙醇、丙酮等試劑影響pH小。血樣與有機試劑體積比一般為1∶（1～4）時，可將97%以上的蛋白除去。離心參數：1萬～14 000 r·min-1離心5～10 min[2425]

強酸溶液沉淀 加入強酸，例如不同百分比的三氯乙酸、高氯酸等，pH 0～4.0，遇酸分解的含藥血樣不易使用本方法。血樣與強酸溶劑體積比一般為1∶0.5左右時，可將90%以上的蛋白除去。離心參數：1萬 r·min-1離心1～5 min[2627]

液液萃?。↙LE） 通過待測組分與干擾物質的油水分配系數不同達到分離。常用溶劑：乙酸乙酯、正丁醇等。體積比多為1∶（1～2）；操作簡單，選擇性強。但易出現乳化現象，可加適量中性鹽減少此現象。多液液平衡后，離心制得。離心參數：1萬r·min-1左右離心5 min[2829]

固相萃?。⊿PE） 根據待測組分的性質，選擇不同分離原理的小柱填料，通過改變流動相，使藥物與內源性物質在小柱的保留時間不同，選擇性收集，達到分離。一般的操作流程：活化—加樣—沖洗—收集。因現使用的填料多為親脂性鍵合硅膠，則一般以甲醇潤洗后，應用水或適當緩沖液沖洗小柱，保證回收率。加樣體積大多為固定相質量的1%～3%，體積最多不可超過2 mL，流速1～2 mL·min-1，樣品溶劑不能過強，以防出現“穿漏現象”，降低回收率。沖洗及收集時的溶劑體積為每100 mg固定相0.5～0.8 mL，其特點是回收率、重現性較好；可避免乳化現象等，但也因價格昂貴，技術要求高，使得現使用學者較少[3031]

主成分分析法（PCA）進行比對鑒別，分別通過Plant Medica，Chem SPIDE，MASSUNION檢索出防風的原型化合物，建立其化學成分的鑒別數據庫，再與實驗獲得的數據全部通過Mzmine 2.9軟件進行標準化處理，后再以PCA分析得出5種原型成分，鑒別4種；代謝物22種，鑒定2種。董巍等[30]利用UHPLCQTOFMS對蜜炙對葉百部的血樣進行采集后，采用MassLynx V4.1工作站進行掃描，后采用Waters代謝物鑒定軟件MetaboLynx與建立好的數據庫進行核對，表征了40個血中移行成分。Wang等[33]建立了一種以UPLCESIQTOFMS數據收集，MassLynx軟件建立表征成分，后經PCA和正交偏最小二乘判別式法（OPLSDA）綜合分析的方法，快速篩選鑒別目標化合物。并成功的應用到了關黃柏的血清藥物化學研究中，從46個質譜峰中，快速準確的確定了其中12個原型入血成分，12個代謝成分。Yan等[34]綜合利用背景減法和多數據處理方法（BsMpa）快速的歸屬及鑒定了雙黃連方劑入血后的39個原型成分和29個代謝產物。

3 血清藥物化學的方法拓展

3.1 血清藥物化學血清藥理學方法

近年，血清藥物化學和血清藥理學方法在中藥的藥效物質基礎及作用機制研究中得到了廣泛的認可及應用，但二者聯用的報道甚少。唐峰等[35]利用上述結合方法探討了麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的物質基礎，首先制備15，30 min，1，2，4，6 h各時間點含藥血清，通過LCMS進行血中移行成分分析，與此同時利用ELISA法及MTT法檢測不同時間點含藥血清的相關藥理活性，最后利用逐步回歸法對各成分與藥理指標進行相關性分析，得出甲基偽麻黃堿、苯甲酰次烏頭原堿等7個原型成分及1個未知代謝成分與其抗炎和免疫抑制的藥理作用密切相關。劉菊燕等[36]也采用了類似方法，以茅蒼術提取物的含藥血清為實驗對象，推測11個入血成分均可能為該藥保護心肌細胞氧化損傷的物質基礎。此類方法的特點在于均以含藥血清為實驗對象，確定其藥效活性的同時初步判斷其有效成分，將體內、外實驗結合，操作過程中存在相互穿插，大大減少了實驗周期，是一種有效、快速、準確的藥效物質基礎尋找途徑。

3.2 血清藥物化學網絡藥理學

2007年，Andrew首次將網絡藥理學定義為一種基于系統生物學、多向藥理學及計算機輔助技術，將藥物作用網絡與機體生物網絡整合，分析藥物在網絡中與特定節點或模塊的相互作用關系，揭示藥物與機體之間相互作用的學科[37]。網絡藥理學的“整體探究、系統調節”與中藥“多成分、多靶點”的研究內容相呼應，在尋找中藥作用靶點及藥效物質基礎，闡述作用機制、配伍規律等方面體現出獨特的優勢。血清藥物化學在中藥中的應用主要集中在快速篩選藥效物質基礎上，但對探尋作用機制需另尋他法。唐峰等[38]將血清藥物化學血清藥理學與網絡藥理學進行結合，首先利用血清藥理學方法對含藥血清進行藥效學研究，同時對其血中移行成分進行鑒定分析，最后利用網絡藥理學預測靶點，初步揭示了細辛揮發油抗過敏性鼻炎的有效成分及其潛在靶點。周文斌等[39]通過血清藥物化學研究確定了土家藥天珠散的5個血中移行成分，并使用Discovery Studio3.5軟件進行反向找靶，獲得Fit value≥0.6的藥效團模型861個，后通過KEGG，BIOCARTA 2 個 pathway數據庫篩選到9個與血管性癡呆有關的信號通路。Zheng 等[40]將血清藥物化學與網絡藥理學等多學科相結合，建立有效組分（血中移行成分）靶蛋白網絡，經代謝組學篩選生物標志物，進行通路富集分析，最終建立“基因蛋白質代謝物”層次的分子網絡，通過組織病理、免疫組化技術相互驗證，揭示了蒽醌類化合物（大黃酸和大黃素）和黃烷醇類化合物（兒茶素和表兒茶素）是大黃抗腎間質纖維化的藥效物質基礎，其作用機制是通過調節細胞外基質的異常積累，控制炎癥因子的釋放，保持凝血和纖維蛋白溶解平衡的協同作用發揮療效。

3.3 中醫方證代謝組學

王喜軍教授繼1997年血清藥物化學概念提出后，根據近20年的研究實踐經驗，于2012年提出了中醫方證代謝組學，即利用多維聯用分析技術，以體液中小分子代謝物為取向探尋中醫證候實質，表征證候的代謝輪廓及生物標志物；以生物標志物橋接動物模型和證候，建立反映證候本質的動物模型；以方劑對證候/模型代謝輪廓及代謝標志物的影響評價方劑整體效應，同時采用一體化研究模式，在有效狀態下，分析口服方劑后體內直接作用物質及其與代謝標志物的關系，揭示方劑的藥效物質基礎，闡明方劑有效性及配伍規律[41]。其特點在于將血清藥物化學與代謝組學整合，實現系統生物學與中醫藥整體觀念相呼應，以“體內內源性物質藥物外源性物質體內代謝物質”為媒介，并通過PCMS分析方法，確定藥效物質基礎，得出物質之間的變化與關聯，即“中醫證候生物標志物方劑體內直接作用物質藥效生物標志物”，構建“中醫方劑證/病整體效應調控”網絡，對中醫藥中的“證侯和方劑”進行更深層次的闡明。王喜軍課題組運用中藥方證組學對茵陳蒿[42]、金匱腎氣丸[43]等多個不同的復方及對應的病證進行了相關研究，并在SCI源雜志發表論文80余篇，取得了可喜的成果[44]。

4 結語

中藥血清藥物化學結合多種系統生物學方法，可構建體內與體外、病證與療效的橋梁。通過HPLC圖譜表征中藥成分體內外動態變化，分析鑒定血中移行成分，并歸屬有效成分，不僅有利于中藥藥效物質基礎的快速篩選與復方配伍規律的探索，也可通過血中移行成分性質及含量的變化，為中藥的質量控制[4546]、品種鑒定[47]、炮制機制研究[6，30，48]等開辟出更廣闊的研究思路，從而豐富中醫藥標準化、現代化、國際化研究方法?？梢灶A見，隨著血清藥物化學和其他學科的融合，其在中藥研究中必將發揮越來越重要的作用。

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[責任編輯 曹陽陽]