藏藥臭蒿及其近緣種藥材的ITS2 DNA條形碼鑒別

任瑤瑤　江南屏　劉睿穎　宋良科　譚?！☆櫧?/p>

[摘要] 臭蒿Artemisia hedinii有清熱涼血，退黃，消炎的功能，在藏藥中占有重要地位。蒿屬植物種類繁多，在青藏高原分布廣泛，且其外形較為相似，傳統鑒定方法難以準確快速鑒定。文章以ITS2序列為DNA條形碼，建立了一種快速準確鑒定臭蒿及其易混蒿屬藏藥植物的方法。從青藏高原采集蒿屬藏藥21個樣品，分別提取樣品DNA，對ITS2目標序列進行PCR擴增、測序，獲得其ITS2序列信息；并從GenBank上下載同屬序列11條；運用MEGA 6.0對所有32條ITS2序列進行對比，計算種間種內遺傳距離，構建Neighbor Joining（NJ）系統進化樹，并比較樣本ITS2序列間的二級結構差異。結果顯示：臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿的遺傳距離較近，但四者種間最小距離均遠大于種內最大距離，NJ樹顯示4種蒿屬植物種內之間各單獨形成一個分支，ITS2序列二級結構也顯示出差異。以ITS2序列作為DNA條形碼，可達到對臭蒿及其近緣蒿屬藏藥植物進行準確、快速的識別和鑒定的目的，準確地弄清物種之間的系統進化關系的目的，為該屬藥用植物的質量控制、安全用藥及合理開發利用提供理論依據。

[關鍵詞] 臭蒿； 藏藥； DNA條形碼； ITS2； 二級結構； 鑒定； 資源利用

ITS2 sequence analysis and identification of medicinal Artemisia plants

REN Yaoyao1， JIANG Nanping1， LIU Ruiying1， SONG Liangke1， TAN Rui1*， GU Jian2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China；

2. School of Pharmacy， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Artemisia hedinii occupies an important position in the Tibetan medicine. Plants in Artemisia vary a lot and are widely distributed in the QinghaiTibet Plateau， many plants in Artemisia look similar， making traditional identification methods laborious. In this article， ITS2 sequences were used as DNA barcoding to identify four kinds of confusable Tibetan medicine plants in Artemisia， aiming to establish a rapid and accurate identification methods. Twentyone samples in Artemisia were collected from the QinghaiTibet Plateau， ITS2 sequence PCR amplification and sequencing were conducted after the extraction of DNA. Another 11 sequence downloaded from Genbank were added to the analysis. Genetic distance calculation and analysis， building Neighbor Joining （NJ） phylogenetic tree were conducted by MEGA 6.0， also comparison of secondary structures of ITS2 sequences among samples. A. hedinii， A. annua， A. dubia and A. argyi shared close genetic distance， but the maximum distance between the four species was much greater than the minimum distance within each species， NJ tree showed that the four species went to four separate branches， differences among secondary structures of ITS2 sequences also made it clear to identify these medical plants. It could be an accurate and rapid method for identification and recognition， as well as the evolutionary relationships between the species by using ITS2 sequence as DNA barcode for plants of Tibetan Artemisia. The study provides theoretical basis for quality control， medication safety and rational exploitation.

[Key words] Artemisia hedinii； Tibetan medicine； DNA barcode； ITS2； secondary structure； identification； resource utilization

藏藥是中華民族醫藥的一塊瑰寶，主要分布在青藏高原，藏藥植物資源種類繁多，其使用歷史悠久、療效確切、文化底蘊深厚，引起了廣泛關注。我國蒿屬植物種類繁多，據《中國植物志》載：蒿屬植物全球約300 余種，我國有186 種，44 變種，遍布全國[1]。多種蒿屬植物具有重要的經濟價值，可供食用、藥用、防風固沙等用途，且多為著名的藏藥，其根或全草入藥[23]。蒿屬藏藥植物的主要化學成分是揮發油、萜類、黃酮類、香豆素類、色原酮類等?，F代藥理學研究表明，蒿屬藏藥植物多具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風除濕、通經活絡、活血、止血等功效 [48]。蒿屬藏藥在青藏高原分布廣泛，青藏高原東緣藏藥植物長期生存于高海拔、強輻射、大溫差、高寒缺氧、無染污的高原地理環境中，所含藥物的活性成分較高[9]，具有較高的藥用價值。

臭蒿Artemisia hedinii首見于《中國民族藥志》，藏藥名桑子那布，有清熱涼血，退黃，消炎的功能，主治“赤巴”病，急性黃疸性肝炎，膽囊炎等[10]，藏醫謂之上品，在藏藥中占有重要地位，在青海多作為牛尾蒿習用。牛尾蒿A. dubia Wall.為藏醫常用的藥材，藏藥名普爾芒那保，是菊科植物牛尾蒿和無毛牛尾蒿的干燥地上部分，主要分布于內蒙古、四川、甘肅、云南和西藏等地。具有清熱解毒，殺蟲利濕的功效，用于蟲病，疫疽，皮膚病和咽喉疾病等的治療[1112]。黃花蒿A. annua，藏藥名克朗，全草味苦，具清熱解毒，涼血消腫，退虛熱，解暑，止血，治結核病潮熱、瘧疾、傷暑低熱無汗、浮腫，各種出血等[13]。

因形態上的相似，蒿屬藏藥材易被混淆，而臭蒿、牛尾蒿等蒿屬藥材在藏藥中占有較重要地位，因此對其進行準確鑒定很有必要。DNA條形碼技術是通過測定植物DNA序列進行比較來反映其遺傳差異，以進行物種分類和鑒定[14]。ITS2 序列是位于nrITS 序列上5.8～26S核糖體DNA 的轉錄間隔區，包含5.8S 和26S 兩端的保守區，該序列最早被應用于系統發育和物種的分類研究中[1517]，ITS2序列包含豐富的變異位點和信息位點，可以用于物種鑒定，對植物有較高的鑒別能力[1820]。采集青藏高原的蒿屬藏藥臭蒿、黃花蒿、艾蒿、牛尾蒿為樣本，以ITS2序列作為DNA條形碼，對其進行鑒定以弄清幾種蒿屬植物之間的系統進化關系，以期建立一種快速準確鑒定蒿屬藏藥的方法，這將對蒿屬藏藥的深入研究、資源保護和安全利用具有重要的理論和實踐價值。

1 材料

從四川?。ò?、甘孜州）、青海、甘肅、西藏等地收集蒿屬藏藥植物或藥材樣品21份，其中臭蒿A. hedinii樣品13份，牛尾蒿A. dubia樣品3份，艾蒿A. argyi樣品3份，黃花蒿A. annua樣品2份，經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定，保存于西南交通大學標本室，樣本來源及其ITS2序列信息見表1。同時在GenBank數據庫中下載蒿屬植物ITS2序列11條（臭蒿樣品1條，牛尾蒿1條，艾蒿樣品3條，黃花蒿6條），ITS2序列信息見表2。

2 方法

2.1 樣品 DNA提取、PCR擴增及測序 取藥材干重組織約30 mg，加入液氮充分碾磨，使用植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。以樣品DNA作為模板，對ITS2進行PCR擴增，正向引物ITS2F，5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′；反向引物ITS3R，5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT 3′。PCR反應體系參照PCR反應試劑盒（TaKaRa 寶生物工程大連有限公司）的說明。PCR反應條件：①94 ℃變性5 min；②94 ℃變性30 s；③56 ℃退火30 s；④72 ℃延伸7 min；⑤重復上述步驟40次；⑥72 ℃延伸10 min。將PCR產物送至北京梓熙生物科技有限公司進行測序。

2.2 數據處理 采用 CodonCode Aligner 對所得序列峰圖進行校對拼接，去除引物區和低質量的序列，由基于隱馬爾可夫模型（HMMer）的注釋方法切除ITS2兩端的5.8S和28S區域，獲得標準的ITS2間隔區序列[21]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比對[22]，分析種內、種間的遺傳變異[23]、利用Wilcoxon雙樣本進行統計檢驗，采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距離法（nearest distance）考察ITS2序列的鑒定成功率，計算K2P（Kimura 2parameter）遺傳距離、構建Neighbor Joining（NJ）系統進化樹[24] ，根據Koetschan等[25]建立的ITS2數據庫網站預測ITS2序列的二級結構。

3 結果

3.1 種內種間的變異分析 臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黃花蒿ITS2序列長度均為225 bp、GC量54.2%～56.9%，平均GC量為55.3%，見表1。應用MEGA 6.0軟件對樣品進行多序列比對，比對后的序列長度為225 bp。MEGA 6.0分析顯示，13個不同來源的臭蒿樣品可分為4個序列類型，其中5個樣品為A1型，與KU366642相同，1個A2型，3個A3型，4個A4型；艾蒿、牛尾蒿、黃花蒿樣品分別僅有1個系列類型，種間最多23個變異位點，見圖1。

3.2 K2P遺傳距離分析 研究發現物種間種內距離越小、種間距離越大越適合條形碼鑒定[16]。利用MEGA 6.0軟件計算臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿種內和種間遺傳距離，見表3。結果可以看出，臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿種內種最大遺傳距離為0～0.004，種間最小遺傳距離為0.023～0.062，種間最小距離均遠大于種內最大距離，利用ITS2序列作為條形碼可將四者區分開。

3.3 NJ樹分析 根據ITS2序列對所有樣本構建NJ系統聚類樹，見圖2，利用bootstrap 1 000次檢驗各分支的置信度。從NJ進化樹圖可以看出，臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿各樣本種內之間各單獨形成一個分支。牛尾蒿與艾蒿與臭蒿親緣關系較遠，臭蒿和黃花蒿的親緣關系較近，在NJ樹上聚為一大支，但分支之間bootstrap置信度在70%以上，物種之間可明顯區分開。3.4 ITS2二級結構的分析 根據Koetschan等建立的ITS2數據庫及其網站預測的臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黃花蒿ITS2二級結構見圖3，從樣本的二級結構中可以看出臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黃花蒿的ITS2序列二級結構較為相似，均為一個中心環（主環）及4個螺旋區（helix）組成，每個螺旋上又有大小不同數目各異的莖環（loop）結構。艾蒿在螺旋Ⅲ區上莖環（loop）數量不同，在中部位置多出1個莖環，Ⅰ區頸環結構也有不同。牛尾蒿ITS2序列二級結構在Ⅲ區的莖環結構較其他三者明顯不同。臭蒿與黃花蒿ITS2序列二級結構極為相似，從結構上無法將臭蒿與黃花蒿區分開，但結合K2P遺傳距離和NJ樹可將二者區分。

4 結論

蒿屬植物在青藏高原分布相對豐富，其藥用價值也較高，是我國藏藥植物的主要類群。近年來隨著以不可持續的方式進行的亂采濫挖，許多有較高藥用價值的蒿屬藏藥植物的種群數量急劇減少[2627]。對實驗材料進行鑒定可以有效保證研究的科學性，使分離出新化合物或發現具有獨特藥理活性的成分或毒性成分等結果更加可靠，避免因物種問題造成結論錯誤或無法重復等現象發生[28]。因此蒿屬藏藥資源的快速準確地識別和鑒定，無疑對蒿屬藥材的安全使用使用和蒿屬藏藥資源的合理開發及保護都十分必要。

ITS2 序列對植物具有良好的擴增成功率和物種水平的鑒定成功率[30]，以ITS2 序列作為DNA條形碼對蒿屬植物的鑒定進行研究可以達到即快速又準確。結果顯示ITS2 序列對蒿屬植物臭蒿、牛尾蒿、黃花蒿、艾蒿具有較好的鑒定效果。無論從臭蒿及其近緣蒿屬藥材種內、種間遺傳距離，還是基于ITS2條形碼序列構建的NJ樹，均證實ITS2條形碼序列能夠準確鑒別臭蒿及其蒿屬近緣種藥材。四者ITS2序列二級結構差異較小，特別是臭蒿和黃花蒿極為相似，但結合遺傳距離和NJ樹仍可將二者區分開。分析不同地域的臭蒿樣品ITS2序列發現，臭蒿樣品的ITS2序列信息變化與其產地的不同并無關聯。因樣品采集數量有限，不能發現臭蒿樣品的ITS2序列信息與產地和海拔之間的關系，或是不同產地和不同海拔臭蒿之間的進化關系。今后的研究中將著重研究資源的種型分布與地域、海拔以及相關環境之間的關系以及不同地域之間的植物資源進化關系，為藥物資源的開發和保護提出新的思路和方法。

臭蒿作為具有清熱涼血、退黃、消炎作用的藏藥在青藏高原地區經常與同為藏藥的蒿屬藥材牛尾蒿混用，但牛尾蒿主要用于清熱解毒、殺蟲利濕、蟲病、疫疽以及皮膚病和咽喉疾病，二者藥效和功能都相差較遠，且研究表明二者化學成分也有較大差異[30]，因此為臭蒿和牛尾蒿在藏藥使用中應準確區分，建立快速識別和鑒定臭蒿藥材及其他因與其外形相似的蒿屬藏藥材對藏藥的正確、安全使用具有極大意義。辛天怡等[31]將二維DNA條形碼應用于中藥材鑒定，對中藥材流通的數字化監管的思路可借鑒到對藏藥資源的監管中，特別是對某些易混藏藥材以及民間錯誤使用的藏藥材進行引導規范，對藏藥材的質量監督和安全使用具有積極意義。同時建立藏藥材和傳統中藥材的二維DNA條形碼，可進一步研究藏藥材和傳統中藥材的區別與聯系，對比藏醫和傳統中醫的用藥習慣，深化藏醫和傳統中醫的交融。

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[責任編輯 呂冬梅]