泛素特異性蛋白酶4對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響*

陳 燕，章 杰

(1.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院皮膚外科，杭州 310020；2.南昌大學第一附屬醫院口腔頜面整形外科，南昌 330006)

泛素特異性蛋白酶4對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響*

陳 燕1，章 杰2△

(1.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院皮膚外科，杭州 310020；2.南昌大學第一附屬醫院口腔頜面整形外科，南昌 330006)

目的 探討泛素特異性蛋白酶4(USP4)對增生性瘢痕(HS)成纖維細胞增殖的影響。方法 體外培養人HS成纖維細胞(HSFB)，并取第4代細胞用于試驗。利用Vialinin A(USP4抑制劑)干預HS成纖維細胞，Western blot檢測干預細胞中不同時間段(0、12、24、48 h)USP4、TβRI及Smad7蛋白的表達，四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測Vialinin A對HS成纖維細胞增殖的影響，分為試驗組和對照組(不作干預)。結果 Vialinin A作用后，隨著時間推移，HSFB中的USP4蛋白表達逐漸減低，TβRI的蛋白也逐漸減低，在作用12 h后明顯降低(P<0.05)；Smad7的蛋白表達則逐漸升高(P<0.05)。Vialinin A同一濃度作用后，隨著時間推移，HSFB增殖活性逐漸受到抑制，試驗組與對照組同一時間段比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 USP4可能通過調控TGF-β/Smad信號通路影響瘢痕細胞增殖，抑制其表達可使HS成纖維細胞增殖減慢。

泛素化；瘢痕，肥大性；成纖維細胞；泛素特異性蛋白酶4；增生性瘢痕；Vialinin A；增殖

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是人體對創傷過度愈合反應的結果，在臨床上非常多見，常表現為瘢痕形狀不規則、質地堅硬，嚴重影響外觀，有時伴有功能障礙，部分患者還會有疼痛和瘙癢感，甚至產生瘢痕潰爛、癌變可能[1-2]。雖然增生瘢痕的危害很大，但其病因和發病機制目前仍未完全清楚。轉化生長因子β(TGF-β)的重要生物學功能正逐漸引起人們的重視。創面愈合過程中，TGF-β/Smad信號通路的持續激活，會導致HS的形成[3]。近年來研究發現，泛素特異性蛋白酶(USP)4可增強TGF-β信號通路的水平，并與TβRI結合，抑制其泛素化降解，進而提高胞膜上TβRI的表面分布水平[4]。但其在HS成纖維細胞中的影響少見報道。而Vialinin A是一種半選擇性的泛素特異性蛋白酶抑制劑，可較強地抑制USP4及USP5[5-6]，最初是從中國云南省發現的一種可食用的蘑菇蓮座革菌分離出來的小分子化合物，是一種三聯苯衍生物[6]。本試驗從HS患者中切取HS組織，體外培養HS成纖維細胞，加入泛素特異性蛋白酶抑制劑Vialinin A抑制USP4表達，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病理組織 取自2014年4至7月于本科行HS整形手術患者，男10例，女5例，年齡6～16歲。均體質健康，近期未使用任何瘢痕藥物治療；瘢痕組織處于穩定期(形成時間6～16個月)；以四肢、頸部為主，高于周圍正常皮膚，質地硬，局部無感染及潰瘍，經臨床和病理證實為HS組織并無惡變。本試驗均征得患者同意并已簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，Vialinin A(美國Cayman公司)，胰蛋白酶-含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA,美國Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京Solarbio公司)，二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(北京Solarbio公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Gibco公司)，兔抗人USP4多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗人TβRI多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗人Smad7多克隆抗體(武漢Boster公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體(武漢Boster公司)，山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-辣根過氧化物酶(HRP，北京Solarbio公司)，增強型ECL化學發光液(北京Solarbio公司)；CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(美國Fisher公司)，倒置顯微鏡及照相系統(日本Olympus公司)，TS-10高速離心機(湖南湘儀公司)，酶聯免疫檢測儀(芬蘭MμLtiskan Ascent公司)。

1.2 方法

1.2.1 人HSFB體外培養 采用林尊文等[7]的改良組織塊貼壁結合胰蛋白酶消化法體外培養成纖維細胞：從整形手術中切取HS在無菌操作條件下，迅速帶至實驗室超凈臺中(超凈臺預先紫外燈照射約1 h)放置在無菌培養皿中，徹底去除表皮和脂肪組織，殘留白色質硬的瘢痕組織PBS漂洗3次；用眼科剪將組織塊剪成0.5～1.0 mm3大小的微粒 ，加入0.25%的胰蛋白酶約1 mL浸沒組織塊，置于4 ℃冰箱中冷消化過夜；第2天PBS漂洗3次后(以去除殘留胰酶)，用1 mL注射器將組織塊接種至培養瓶中，組織塊間隙在0.3～0.5 cm，將已經接種好的培養瓶豎立置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養箱中干燥約1 h；緩慢取出培養瓶，分別加入約3 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液于各培養瓶中，使組織塊沒入培養液中，平放置于恒溫箱中繼續培養。每隔3～5 d換液1次。顯微鏡下觀察，適時去除漂浮及無細胞生長組織塊，待組織塊周圍爬出的細胞基本融合成片，密度達80%以上時，將瓶底細胞按1∶2傳代培養。取第4代細胞用于試驗研究。

1.2.2 VialininA 干預HSFB

1.2.2.1 Western blot檢測細胞內USP4、TβRI及Smad7蛋白表達 取生長狀態良好的HS成纖維細胞消化、離心及棄去上清液，加入2 mL含10%胎牛血清的培養液混勻制成細胞懸液，取10 μL計數，確定細胞濃度，以每孔2×105密度將細胞接種到6孔板，繼續培養24 h后，加入適量含5 μmol/L Vialinin A的培養液，分別在0、12、24、48 h后收集細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒結合酶標儀檢測對上述細胞蛋白濃度進行測定，將上述已定量的蛋白樣本加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白充分變性，取總蛋白20 μg上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)電泳后濕法轉膜，隨后用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜約2 h；將封閉好硝酸纖維素膜放入適當稀釋度的兔抗人一抗溶液中4 ℃過夜，USP4、TβRI、Smad7及內參β-actin分開孵育；應用TBST洗膜后，將硝酸纖維素膜放入適當稀釋度的山羊抗兔IgG二抗中室溫下孵育1 h。應用增強型化學發光試劑盒進行發光，采用凝膠成像系統進行圖像采集和灰度分析，結果以目的蛋白灰度值與β肌動蛋白灰度值之比表示。

1.2.2.2 MTT檢測細胞增殖 取生長良好的已被干預的HS成纖維細胞與未被干預的細胞分別常規消化、離心及吸棄上清液，收集細胞及重懸細胞，以每孔1×104/mL密度將已被Vialinin A干預的增生瘢痕成纖維細胞(試驗組)與未干預的細胞(對照組)接種于96孔板，每孔為200 μL，即2 000 /孔，兩組細胞均設5個復孔，并各設置1個調零孔(即只加20 μL DMEM完全培養基)，以此方式再接種2塊96孔板；然后置于恒溫箱中培養，24 h后從培養箱中取出1塊板，在避光下向每孔加入20 μL MTT工作溶液，避光置于恒溫箱中繼續培養4 h后終止培養；加入150 μL DMSO于每個細胞孔中，避光置于搖床低速振蕩10 min，充分溶解結晶物；用酶聯免疫檢測儀測量各孔吸光度值(A值)，波長為490 nm，記錄并分析結果。48、72 h后分別取出1塊96孔板，按以上步驟測量各孔A值并記錄。以上試驗重復3次。

2 結 果

2.1 細胞生長觀察 HS培養的原代瘢痕成纖維細胞在光鏡下自第5天時可見單個呈梭形狀細胞從組織塊周圍爬出，第7天時可見較多細胞爬出，放射狀排列于組織塊周圍，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞呈長梭形，核圓，核仁清晰，細胞質均勻，胞體豐滿。傳代后大部分細胞生長良好，性狀穩定。近3周時，細胞生長基本融合，可消化傳代。

2.2 Vialinin A對細胞內USP4、TβRI及Smad7蛋白表達的影響 Vialinin A作用后，隨著時間推移，HSFB中的USP4蛋白表達逐漸減低；TβRI的蛋白也逐漸減低，在作用12 h后明顯降低，與0時比較差異有統計學意義(P<0.05)；Smad7的蛋白表達則逐漸升高，與0時比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A:Western blot蛋白條帶；B：不同時間段的HSFB中TβRI不同時間段的蛋白表達；C:不同時間段的Smad7與β-actin灰度值比較。

圖1 干預USP4后HSFB中TβRI與Smad7不同時間段的表達

2.3 Vialinin A對HS成纖維細胞增殖的影響 Vialinin A作用后，試驗組中HSFB增殖活性明顯受到抑制，試驗組與對照組組同一時間段A值比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組Vialinin A對HSFB的A值比較值)

3 討 論

HS是成纖維細胞異常增殖，分泌大量膠原、基質，引起膠原等基質代謝合成與降解失衡，導致過多細胞外基質分泌和沉積的一種纖維化疾病。至今，學術界對其發病機制的研究尚未有明確的定論，臨床上也尚無有效的治療方法?，F已證實多種細胞因子、信號轉導通路、細胞外基質參與瘢痕形成，而TGF-β/Smad信號通路是已被證明與瘢痕形成密切相關的機制[8-9]。其中，Smads根據不同分型，對成纖維細胞膠原代謝具有雙向調控作用。Smad7主要負調控TGF-β/Smad信號通路，TGF-β刺激后，Smad7移至胞質中，與Smad3競爭TβRI，進而阻止Smad3活化，抑制TGF-β信號通路轉導，調控正、負性Smads蛋白之間的平衡[10-11]。Smad7 還可通過E3泛素連接酶-Smurf (Smurf1和Smurf2)誘導Smad2與TβRI的泛素化降解，下調TβRI在胞膜上的分布水平，進而負反饋作用于TGF-β/Smad信號通路[12]。

而泛素-蛋白酶體途徑是真核細胞內一個重要的蛋白質降解調節系統，是進化過程中高度保守的級聯反應，緊密地調節TGF-β家族信號[13]。它可通過對底物蛋白的泛素化進行蛋白酶體降解,可影響多種細胞活動，如細胞受體功能、細胞周期調節、DNA損傷修復及腫瘤生長等[14]。該途徑也通過去泛素化酶(DUBs)逆轉泛素化過程。USP4是第1個在哺乳動物中被確定的去泛素化酶，由原癌基因USP4編碼，作為DUBs中重要一員，USP4最初被報道可以與腫瘤抑制因子pRb和相關袋狀蛋白 p107、p130相互作用[15]。它主要通過與特異性靶蛋白結合使之去泛素化阻止其降解或改變性狀，在多種信號通路中發揮重要調節作用，比如Wnt/β-catenin 信號通路、固有免疫應答通路及p53 信號通路，尤其在TGF-β/Smad信號通路[16]。其在TGF-β/Smad信號通路的潛在機制是TβRI通過Smad7/Smurf2復合體進行泛素化降解，而USP4可與TβRI直接結合，使之去泛素化，介導泛素化與去泛素化平衡，維持TβRI在質膜上的水平，調控TGF-β/Smad信號通路的水平。一系列體內外試驗也表明在哺乳動物細胞和斑馬魚胚胎中，USP4在調節TGF-β/Smad信號通路方面發揮關鍵作用。在對惡性乳腺癌細胞分析顯示，體外試驗表明USP4可調節TGF-β誘導的上皮間質轉化、遷移，體內試驗表明USP4可激活TGF-β/Smad信號通路，促進癌細胞侵襲、轉移[17]。這項研究還表明USP4可被蛋白激酶B(AKT)磷酸化，磷酸化后使細胞核中的USP4重新定位于胞質和胞膜，與TβRI結合，進而去泛素化，增強TGF-β誘導的致瘤反應。如果USP4缺失，則由AKT誘導的癌細胞遷移也會受到抑制。由此可見，USP4通過選擇性介導TGF-β/Smad信號通路中關鍵組件的去泛素化，參與調控了TGF-β/Smad信號通路的水平。一旦其功能紊亂，就會使TGF-β/Smad信號通路轉導異常，進而引起一系列病生改變，導致多種疾病的發生與發展。

最新研究表明，USP4可去泛素化促進Th17細胞功能并且可提高風濕性心臟病患者的CD4+T細胞水平，進一步利用Vialinin A抑制USP4活性，將可抑制Th17細胞分化，這意味著USP4有望成為Th17介導的自身免疫疾病的治療靶點[18]。Wang等[19]研究發現USP4可通過去泛素化正向調節維甲酸誘導基因I(RIG-I)介導的抗病毒效應，穩定RIG-I的表達水平。Hou等[20]發現在頭頸部鱗狀細胞癌中USP4蛋白表達水平增加，并直接與受體相互作用蛋白1(RIP1)相互作用，使之去泛素化，負調控RIP1介導的NF-κB活性，促進TNF-α誘導的凋亡。因此這相關研究發現USP4是屬于抑癌蛋白。然而Zhang等[21]的研究發現USP4可直接與TβRI結合，使之去泛素化，最終促進TGF-β誘導的乳腺癌的發展。由此可見，抑制USP4可負調控TGF-β信號通路，抑制腫瘤的生長，屬于癌蛋白。從以上研究不難看出關于USP4在哺乳動物細胞中功能尚無確切定論。

本試驗以HS成纖維細胞為載體，利用Vialinin A(USP4抑制劑)干預HS成纖維細胞，分別在不同時間段收集細胞總蛋白行Western blot檢測及MTT檢測細胞增殖情況。 Western blot檢測結果顯示：USP4在Vialinin A作用12 h后，表達逐漸減低，說明Vialinin A抑制USP4有效；TβRI的蛋白表達也在作用12 h后明顯降低，而Smad7蛋白表達則逐漸升高。并且本課題組前期發現USP4與TβRI蛋白在HS成纖維細胞中高表達，而Smad7蛋白在HS成纖維細胞中低表達。綜合表明USP4可能通過調控TGF-β/Smad信號通路影響瘢痕細胞增殖。其次，MTT結果顯示：加入泛素特異性蛋白酶抑制劑Vialinin A后，HSFB的增殖活性逐漸減低，尤其在72 h明顯。以上結果可能暗示著USP4與TβRI相互作用，通過抑制Smad7介導的信號通路阻止TβRI的泛素化降解，從而維持TβRI的高水平和Smad7的低水平，抑制USP4表達，導致TβRI的低表達及Smad7的高表達，從而負調控TGF-β介導的信號通路，抑制HS成纖維增殖，但其具體的分子機制還需深入研究。

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The effect of USP4 on the proliferation of human hypertrophic scar fibroblasts*

ChenYan1,ZhangJie2△

(1.DepartmentofSkinSurgery,SirRunRunShawHospitalSchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou,Zhejiang310020,China;2.OralandMaxillofacialPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To investigate the effects of USP4 on the proliferation of human hypertrophic scar fibroblasts(HSFB).Methods HSFB were cultured in vitro.The fourth generation of HSFB in logarithmic growth phase was selected in the experiment.HSFB were intervened by Vialinin A which was the inhibitor of USP4 for 0,12,24,48 h,then collected cells and the their expression of USP4 and TβRI and Smad7 protein was detected by Western blot.MTT assay was used to detect the effect of Vialinin A on the proliferation of HS fibroblasts and the cells were divided into experimental group and control group (without intervention).Results After treatment with Vialinin A in HSFB,the expression of USP4 and TβRI protein in HSFB decreased gradually,especially in 12 h(P<0.05),and Smad7 protein expression was increased gradually(P<0.05).The proliferative activity of intervened HSFB reduced gradually,the difference between experimental group and control group was statistically significant(P<0.05).Conclusion USP4 might inhibit the proliferation of scar cells and down-regulation of USP4 expression in hyperplastic scar fibroblasts,which can slow proliferative activity of intervened HSFB by regulating TGF-β/Smad signaling pathway.

ubiquitination；cicatrix,hypertrophic；fibroblast；USP4；hypertrophic scar；Vialinin A；proliferation

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.002

國家自然科學基金資助項目(81460295)；江西省衛生計生委科技計劃資助項目(20155201)。 作者簡介：陳燕(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事瘢痕修復及皮膚美容方面研究?！?/p>

，E-mail:zhjprs@163.com。

R619.6

A

1671-8348(2017)15-2021-03

2016-11-22

2017-02-10)