硬脂酰氯改性對蓮原花青素低聚體在油脂體系中抗氧化性質的影響

張亞楠,謝筆鈞,孫智達

(華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

硬脂酰氯改性對蓮原花青素低聚體在油脂體系中抗氧化性質的影響

張亞楠,謝筆鈞,孫智達*

(華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

蓮原花青素低聚體具有良好的抗氧化活性,因其富含酚羥基親水性較高而限制了在油脂體系中的添加應用。為提高蓮原花青素低聚體的抗油脂氧化性能,本研究利用硬脂酰氯對其改性,重點研究了反應物配比、催化劑用量和反應溫度對反應的影響以及工藝條件的優化,同時探討了其抗油脂氧化特性并對其分子結構初步表征。結果表明,改性最佳工藝條件為蓮原花青素低聚體、硬脂酰氯、催化劑質量比為1∶2∶1.5(w∶w∶w),反應溫度40 ℃,添加改性物的菜籽油經100 ℃高溫氧化24 h后的POV為6.04 meq/kg,比添加未改性蓮原花青素低聚體的對照組降低了31.6%。改性物紅外圖譜顯示有亞甲基、脂肪長鏈和酯基基團特征吸收峰,可以說明蓮原花青素低聚體與硬脂酰氯發生酯化交聯,脂溶性得到改善從而使其在油脂中的抗氧化性能得到提高。

蓮原花青素低聚體,硬脂酰氯,改性,脂溶性,抗氧化性

油脂是食品中重要成分之一,油脂氧化不僅嚴重影響食品品質,氧化過程中還會產生過氧化物、自由基、醛、酮等危害身體健康的物質[1]。在油脂中添加抗氧化劑是延緩油脂氧化的一種最為有效的方法,近年來應用廣泛的合成抗氧化劑因其毒性與致癌危險在一些國家和地區使用受到限制,因此天然抗氧化劑以其無毒高效的優勢日益獲得人們的青睞。

表1 蓮原花青素低聚體改性物制備的單因素實驗

2014年6月,國家衛計委發布了增補茶多酚棕櫚酸酯等兩種食品添加劑的公告,現已被收錄進GB 2760-2014,目前最常用的化學修飾法合成茶多酚脂肪酸酯或兒茶素衍生物等的研究相對成熟。本實驗從茶多酚類物質的化學改性提高脂溶性的相關研究中得到啟發試圖通過對蓮原花青素低聚體引入長碳鏈來修飾其分子結構以改變其親水特性,實驗利用硬脂酰氯對LSOPC進行酯化改性合成脂溶性改性物,通過單因素實驗及正交實驗優化反應條件,研究改性LSOPC在油脂體系的抗氧化性能和脂溶性,為原花青素在油脂領域的拓展應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮原花青素粗提取物、菜籽油(未加添加劑) 中國農業科學院油料作物研究所提供;硬脂酰氯 上海艾科達化學試劑有限公司;碳酸氫鈉、乙酸乙酯、無水乙醇、冰醋酸、氯仿等 均為分析純。

RE-3000旋蒸儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-2100紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 武漢科爾儀器設備有限公司;SHZ-82A恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;SB-5200DT型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WH-1微型旋渦混合儀 海滬西分析儀器廠有限公司;Avanti J-E超速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蓮原花青素低聚體制備 取適量蓮原花青素粗提取物,用蒸餾水溶解,質量比1∶30(樣品∶水)。并用超聲波清洗儀以功率250 W,40 kHz處理20 min使之溶解完全,10000 r/min條件下離心15 min,取紅棕色上清液,抽濾,使得抽濾后的液體中的固體盡量除去。抽濾得到的液體再用乙酸乙酯萃取,其體積比為1∶3(液體∶乙酸乙酯),充分搖勻,靜置等至完全分層后,收集上層液,回收下層液,重復萃取。將取得的上層液置于旋轉蒸餾瓶中,在40 ℃下旋干,加少量蒸餾水復溶,溶解的紅棕色液體用塑料杯裝適量,冷凍干燥得到的淺紅棕色粉末即為原花青素低聚體[5]。

1.2.2 蓮原花青素低聚體改性工藝流程 參照Ying Zhong合成EGCG酯[6]、邵衛梁等人對茶多酚棕櫚酸酯的研究[7],確定LSOPC改性的工藝流程為:稱取0.5 g蓮原花青素低聚體,量取40.0 mL乙酸乙酯加入250 mL錐形瓶,加入目標量的堿性催化劑碳酸氫鈉、硬脂酰氯(逐滴振蕩加入),充氮氣保護,在30～70 ℃溫度范圍的水浴中振蕩反應7 h,反應后過濾得到乙酸乙酯深紅棕色液體。用三倍體積的蒸餾水洗滌至溶液呈中性,再于40 ℃下真空旋蒸出乙酸乙酯,最后將得到的改性物干燥,研磨成粉末,置于自封袋中低溫避光保存備用[8]。

1.2.3 蓮原花青素低聚體改性單因素實驗 按照表1進行蓮原花青素低聚體改性單因素實驗。固定催化劑用量0.5 g/0.5 g LSOPC、反應溫度40 ℃,因實際參與反應為LSOPC中有效酚羥基,需考慮LSOPC過量情況且硬脂酰氯過多最終反應液呈粘稠態無法干制,故設置反應物配比為2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4(即蓮原花青素低聚體與硬脂酰氯質量比,將LSOPC用量固定為0.5 g);催化劑用量作單因素的實驗條件為反應物配比1∶2、反應溫度40 ℃;反應溫度作單因素的實驗條件為催化劑用量0.5 g/0.5 g LSOPC、反應物配比1∶2。

1.2.4 蓮原花青素低聚體改性正交實驗 為優化改性工藝,以反應物配比、催化劑用量、溫度為變量進行3因素3水平的L9(33)正交實驗,各自變量水平的選取根據單因素實驗結果進行確定,具體見表2,其中固定蓮原花青素低聚體用量為0.5 g。

表2 蓮原花青素低聚體改性物制備的正交實驗因素水平設計

1.2.5 油脂的抗氧化實驗 為提高工作效率,進行如下油脂高溫破壞實驗:取等量菜籽油5 g于小燒杯中,加入質量分數為0.4%的改性蓮原花青素低聚體樣品,超聲均勻,同時設置對照組。將上述油樣置于100 ℃烘箱內24 h(脂肪酸在高溫下極易氧化分解),24 h后立即測定指標[8]。

1.2.6 POV測定 按GB/T 5538-2005《動植物油脂過氧化值測定》中的方法[9]。

1.2.7 蓮原花青素低聚體分子官能團的光譜測定 紅外光譜:使用紅外光譜儀,在400～4000 cm-1范圍,取1～2 mg樣品粉末,與KBr混合均勻并壓片,掃描后得到特征譜帶。

1.2.8 LSOPC改性物脂溶性總酚含量測定 鄰酚羥基在三乙醇胺水溶液中與亞鐵離子生成紫藍色絡合物,該紫藍色絡合物在540 nm處有最大吸收峰,UV測定吸收值,并與標準品沒食子酸乙酯比較,得到脂溶性總酚含量[10]。

1.2.9 油水分配系數(LogP)的測定 準確量取50 mL正辛醇與150 mL超純水于具塞錐形瓶中,搖床振蕩24 h,使二者相互飽和,靜止分層后于分液漏斗分離,保存備用,上層為水飽和的正辛醇,下層為正辛醇飽和的水。分別稱取LSOPC、LSOPC改性物各5 mg,用水飽和的正辛醇溶解并定容至10 mL,配制成0.5 mg/mL的水飽和的正辛醇溶液,在280 nm下測其吸光值Ax。分別量取含LSOPC、LSOPC改性物0.5 mg/mL的水飽和的正辛醇溶液與正辛醇飽和水各5.0 mL,恒溫振蕩24 h后5000 r/min離心20 min,分離出油相,在280 nm下測其吸光值A0。通過公式Log P=LogAx/(A0-Ax)計算油水分配系數[9]。

1.2.10 LSOPC改性物清除DPPH自由基實驗 將最優組改性物配制得到適宜濃度的樣品乙醇溶液,并稀釋得到不同濃度梯度的樣品溶液分別取2 mL加入，再向各管中注入2 mL DPPH·溶液,混合均勻后黑暗中靜置30 min,用1 mL比色皿測溶液在517 nm處的吸光度值,記作A1;以不加樣品時的吸光度值為對照,記作A2;待測樣品和DPPH·溶液溶劑(乙醇)的混合物的吸光度值為空白,記作A0平行操作三次,取平均值,公式為

計算樣品對DPPH自由基的清除率,并繪制DPPH自由基清除率對樣品添加濃度的曲線。根據曲線,計算得DPPH自由基原始質量濃度減少至50%時的脂溶性蓮原花青素低聚體的添加量,用IC50表示,IC50值越小,清除自由基的能力越強[11]。

1.2.11 油脂長期抗氧化實驗 將分別加入質量分數為0.02%的LSOPC改性物、LSOPC、茶多酚棕櫚酸酯、VC、VE、BHT、TBHQ的菜籽油及空白油樣置于60 ℃烘箱內,每4 d測定一次POV值[12]。

1.3 統計分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析,數據均以平均數±標準差(x±s)表示,用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 蓮原花青素低聚體改性單因素實驗結果

2.1.1 反應物配比對蓮原花青素抗氧化性的影響 如圖1所示,隨著反應物配比的增加,添加蓮原花青素低聚體改性物的菜籽油POV呈現先降低后升高的趨勢,反應物配比為1∶1時POV最低為(6.45±0.103) meq/kg,隨著反應物配比增大,改性物抗油脂氧化能力降低可能是因為硬脂酰氯過量導致改性產物不純。申雷等認為,硬脂酰氯改性茶多酚過程中,茶多酚分子中只有活性較強位點的酚羥基才能參與酯化反應[5],所以推測本實驗反應過程中已結合的硬脂酸長碳鏈會限制LSOPC與更多的硬脂酰氯反應。因此選擇反應物配比為2∶1、1∶1、1∶2作為正交實驗的因素水平。

圖1 反應物配比對LSOPC抗氧化性的影響Fig.1 Effect of reactant proportion on antioxidation activity of LSOPC

2.1.2 催化劑用量對蓮原花青素抗氧化性的影響 如圖2所示,隨著催化劑用量的增加,添加蓮原花青素低聚體改性物的菜籽油POV呈現先降低后升高的趨勢,催化劑用量為0.5 g/0.5 g LSOPC時POV最低為(6.53±0.112) meq/kg,因此選擇反應物配比為0.25、0.5、0.75 g/0.5 g LSOPC作為正交實驗的因素水平。

圖2 催化劑用量對LSOPC抗氧化性的影響Fig.2 Effect of catalyst use level on antioxidation activity of LSOPC

2.1.3 反應溫度對蓮原花青素抗氧化性的影響 如圖3所示,隨著溫度的升高,添加蓮原花青素低聚體改性物的菜籽油POV呈現先降低后升高的趨勢,反應溫度為40 ℃時POV最低為(6.53±0.112) meq/kg。推測當溫度較低時,反應速度慢,蓮原花青素低聚體的改性不充分;隨著溫度升高,酯鍵更容易形成;但溫度過高乙酸乙酯揮發加快,且蓮原花青素低聚體氧化速度加快,產物抗氧化活性降低。因此選擇反應物配比為30、40、50 ℃作為正交實驗的因素。

圖3 反應溫度對LSOPC抗氧化性的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on antioxidation activity of LSOPC

表3 蓮原花青素低聚體改性優化實驗結果

2.2 蓮原花青素低聚體改性正交實驗結果

改性正交實驗結果見表3,0.5 g LSOPC其反應物配比、催化劑用量和反應溫度分別為1∶2、0.75 g/0.5 g LSOPC和40 ℃(極差分析和表中最優均為A3B3C2)時,添加蓮原花青素低聚體改性物的菜籽油POV取得最小值為(6.04±0.043) meq/kg。由表4可知,催化劑用量對蓮原花青素低聚體改性物添加到菜籽油中的POV有顯著性影響(p≤0.05);因LSOPC為低聚體的混合物,其空間位阻一定程度限制了酯化反應的進行,因此即使反應物配比不同實際參與的酚羥基數量有限,反應物配比對LSOPC改性物抗氧化效果沒有顯著影響。確定蓮原花青素低聚體改性最優工藝條件為A3B3C2,按此條件進行驗證,制備所得LSOPC改性物以0.4%的比例添加到菜籽油中經100 ℃高溫處理24 h實際測得POV為6.11 meq/kg,具有較好的抗油脂氧化能力。

表4 蓮原花青素低聚體改性優化實驗結果的方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00。

2.3 改性蓮原花青素低聚體的紅外光譜分析

圖4、圖5分別為LSOPC和LSOPC改性物的紅外光譜圖,對比發現二者均有酚羥基(3100～3500 cm-1)和苯環(1430～1620 cm-1)吸收峰存在,表明改性過程只是對LSOPC分子結構進行了部分修飾,并沒有完全改變其結構;改性后的LSOPC有明顯的甲基和亞甲基(2910～2960、2830～2870 cm-1)吸收峰以及羰基(1650～1740 cm-1)、碳原子數大于4的直鏈脂肪基團(720 cm-1)特征吸收峰,所以可以初步定性分析LSOPC與硬脂酰氯發生酯化交聯,其分子結構引入了硬脂酸長碳鏈,但改性物的酯化位點并不確定,需對LSOPC改性物分離純化并進行進一步結構鑒定[13]。

圖4 LSOPC紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of LSOPC

圖5 LSOPC改性物紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of modified LSOPC

2.4 LSOPC改性物脂溶性總酚含量測定結果

紫外測定的并非脂溶性總酚含量,而是未被酯化的酚羥基含量,由此可間接反映LSOPC的酯化程度,即酯化程度越高,總酚含量相應降低。標準品沒食子酸乙酯標準曲線:Y=0.5497X-0.0273,R2=0.9994。

式中:E-樣品相當標準含量,mg/100mL;m-樣品質量,mg;G-樣品水分質量,%。測定結果如表5所示,LSOPC改性前后總酚含量分別為73.56%、55.07%,可知改性后LSOPC總酚含量較改性前降低了25.14%。因為紫外測定的并非脂溶性總酚含量，而是未被酯化的酚羥基含量，由此可間接反映LSOPC的酯化程度，即酯化程度越高，總酚含量相應降低，所以LSOPC改性物與茶多酚棕櫚酸酯相比，其酯化程度較低，猜測可能是因為茶多酚中兒茶素類單體含量較高,而本實驗原材料蓮原花青素低聚體平均聚合度為3.2[14],含有大量二聚體、三聚體,其構型一定程度阻礙了酚羥基與硬脂酰氯發生完全酯化交聯,導致改性物酯化程度不高,仍有較多未酯化的酚羥基存在。

表7 不同貯藏時間下各抗氧化劑對菜籽油過氧化值的影響(meq/kg)

注：同列不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)。

表5 不同抗氧化劑的總酚含量

2.5 LSOPC改性前后油水分配系數比較

LSOPC改性前后LogP分別為0.35、0.53,可知改性后其油水分配系數增加,即LSOPC極性降低,脂溶性增強,達到預期目的。但是,改性后的LSOPC與市售添加劑茶多酚棕櫚酸酯相比,其脂溶性較低。

表6 不同抗氧化劑的油水分配系數

2.6 LSOPC改性后對DPPH自由基清除率的影響

測定結果如圖6所示,LSOPC改性前后IC50分別為8.0、17.5 μg/mL,改性后LSOPC對DPPH自由基的清除能力大大降低。因抗氧化劑清除DPPH自由基能力與酚羥基含量密切相關,而硬脂酰氯對LSOPC改性的酯化反應發生在酚羥基上從而使酚羥基數量減少。但是LSOPC改性依舊保留了其較強的清除DPPH自由基能力,再次表明改性過程只對LSOPC進行了部分修飾,并沒有大幅度改變蓮原花青素低聚體整體結構。

圖6 LSOPC改性前后對DPPH自由基的清除率Fig.6 Inhibition efficiency of LSOPC and modified LSOPC to DPPH·

2.7 不同抗氧化劑對菜籽油長期抗氧化效果比較

如表7所示,所有添加抗氧化劑的油樣與空白油樣相比,各處理組均有較強的抗油脂氧化能力,且各處理組油樣POV隨著貯藏時間延長呈上升趨勢。其中在貯藏8 d時,改性LSOPC的油脂POV比普通LSOPC降低42.1%,且差異顯著(p≤0.05),說明改性后的LSOPC抗氧化性能提高,減少不飽和脂肪酸脂質過氧化[15],有效延長油脂氧化誘導期[16],可能是因為酯化反應引入的硬脂酸長碳鏈使得LSOPC分子更容易分散在油脂體系中。貯藏后期,改性LSOPC的抗油脂氧化活性要大大優于BHT、VC、VE,但與新型抗氧化劑茶多酚棕櫚酸酯、TBHQ相比,改性LSOPC對油脂長期抗氧化效果要略差一些。

3 結論

利用硬脂酰氯對蓮原花青素低聚體進行分子修飾,通過單因素及正交實驗得到蓮原花青素低聚體改性的最佳條件為蓮原花青素低聚體、硬脂酰氯、催化劑質量比為1∶2∶1.5,反應溫度40 ℃,得到的改性物能有效降低油脂POV,具有良好的抗油脂氧化能力。改性物波譜分析表明蓮原花青素低聚體僅部分與硬脂酰氯發生酯化交聯,改性物中仍含有酚羥基,因此改性蓮原花青素低聚體的分子結構及作用機理還需進一步研究。

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Influence of stearoyl chloride modification on antioxidation of lotus oligomeric proanthocyanidins in oils

ZHANG Ya-nan,XIE Bi-jun,SUN Zhi-da*

(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Lotus oligomeric proanthocyanidins(LSOPC)has good antioxidant activity,but its hydrophilicity based on numerous phenolic hydroxyls limits its application in oil system. In order to increase antioxidation of LSOPC in oils,LSOPC was modified by stearoyl chloride. The effects of reactants ratio,catalyst use level and reaction temperature on the reaction as well as optimization of reaction conditions were mainly studied,antioxidant activity in oils and preliminary molecular characterize of modified LSOPC were also investigated. The results showed that the optimal reaction conditions were 1∶2∶1.5 of the mass ratio of LSOPC,stearoyl chloride and catalyst,reacting at 40 ℃. Under optimal conditions the POV of overheated rapeseed oil was 6.04 meq/kg,which was 31.6% lower than that of control group(added with LSOPC). IR spectrum analysis of modified LSOPC showed that cross-linking and esterification was formed between LSOPC and stearoyl chloride from characteristic absorption peaks of methylene,long fat chain and ester groups. So the antioxidation of LSOPC in oils was increased significantly because of its improved lipid solubility.

lotus oligomeric proanthocyanidins;stearoyl chloride;modification;lipid solubility;antioxidant activities

2016-11-14

張亞楠(1992-)，女，碩士，研究方向：天然產物化學，E-mail：yanangreat@163.com。

*通訊作者:孫智達(1963-)，男，博士，教授，研究方向：天然產物化學，食品安全，E-mail：sunzhida@mail.hzau.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)09-0097-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.010