典型櫻亞屬植物基因組DNA改良提取方法研究

吳 帆，柳新紅，蔣冬月，李因剛，楊少宗，劉華紅，倪 穗

(1.寧波大學，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；3.杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

典型櫻亞屬植物基因組DNA改良提取方法研究

吳 帆1，2，柳新紅2，蔣冬月2，李因剛2，楊少宗2，劉華紅3，倪 穗1*

(1.寧波大學，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；3.杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

本實驗在傳統的CTAB法及試劑盒法的基礎上，利用DNA提取緩沖液作為樣品預處理液，配合其他操作步驟的優化，設計出針對櫻亞屬植物基因組DNA的新型提取方法，并對提取的DNA進行ISSR-PCR分子標記實驗以檢驗其質量。實驗結果表明，改進后的CTAB法及試劑盒法均能有效地去除樣品中含有的多糖、色素、黃酮等雜質，而試劑盒法提取的DNA純度和質量總體而言高于CTAB法。ISSR-PCR結果顯示，兩條引物對樣品DNA均能進行有效擴增，并且擴增條帶清晰，無明顯降解。改良后的兩種方法能高效高質量地提取櫻亞屬植物DNA，并且具有較高的通用性，可以運用于其他物種DNA的提取工作中。

典型櫻亞屬;DNA提取;CTAB;試劑盒

典型櫻亞屬(Subg.Cerasus)隸屬于薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)，為多年生落葉喬木或灌木。該亞屬植物在北半球溫和地帶，包括亞洲、歐洲、北美洲等均有分布記錄。亞屬中主要原生種分布于亞洲，集中在日本、朝鮮及我國西部和西南部地區，包括福建、浙江、云南、四川等省份[1-2]。我國產48種，包括迎春櫻(Cerasusdiscoidea)、山櫻花(Cerasusserrulata)、尾葉櫻(Cerasusdielsiana)、華中櫻(Cerasusconradinae)等常見種及天山櫻(Cerasustianshanica)、鶴峰櫻(Cerasushefenensis)等地區特有種[3-4]。該亞屬的植物多生長于向陽山坡、山頂或林緣地帶的陽面，種類分布受海拔及坡向影響較大。

前人研究發現，櫻亞屬植物葉片中含有大量次生代謝產物，如多糖[5]、黃酮[6]、單寧和色素[7]等。分子生物學家將諸如櫻亞屬類具有大量次生代謝產物的植物稱為頑拗植物(recalcitrant plant)[8]，若對這些植物采用傳統的DNA提取手段，會導致雜質的大量殘留，不僅影響DNA的提取質量，還會影響后續基于DNA片段的相關研究，這會給櫻亞屬植物分子生物學研究帶來障礙，限制其進一步的開發利用。目前，針對櫻亞屬植物基因組DNA提取的報道較少，且提取的DNA質量較低，不能滿足后續分子實驗的需求。本研究在傳統的CTAB法及試劑盒法的基礎上進行改良優化，以改良后的方法提取典型櫻亞屬植物基因組DNA，并對其進行產量、純度測定、ISSR-PCR分子標記分析，驗證提取方法的質量。旨在為提取高質量的櫻亞屬植物DNA提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料均來自于浙江省內14個縣(市、區)(表1)，現場采集新鮮完整的葉片放入變色硅膠中干燥保存，后存放于-20 ℃冰柜中備用。

表1 供試材料及采集地

1.2 DNA提取方法

1.2.1 提取緩沖液制備

為有效地去除樣品葉片中的次生代謝產物，結合DNA結構特點，設計提取緩沖液對樣品葉片進行預處理，去除大量雜質后再進行后續提取實驗會極大地提高提取效率。緩沖液(100 mL)具體配方如下：在50 mL蒸餾水中加入1.461 g NaCl，另取15mL蒸餾水加入2.4 g Tris堿，完全溶解后利用HCl調節pH至8.0，后轉移到50 mL水中；另取15 mL蒸餾水，先加入少許NaOH使溶液呈堿性，后加入1.8 g EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，再利用NaOH調節pH至8.0，后轉入上述混合液中。取2 g PVP(Polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)加入混合液中，待完全溶解后加入1 ml β-巰基乙醇，蒸餾水定容至100 ml，混勻后冰箱4℃保存，備用。

1.2.2 改良CTAB法提取DNA

取干燥后的樣品葉片于預冷的研缽中，加入少量PVP粉末，液氮迅速研磨至樣品徹底成為粉末，后迅速轉移至2 mL預冷離心管中。加入1.5 mL預冷的緩沖液，混合均勻后冰浴器上靜置20 min。4 ℃下3 000 r/min離心5 min，棄上清液和膠狀粘稠物質及壁上殘留。若上清液顏色較深則重復抽提1次。在沉淀中加入700 μL 65℃預熱的CTAB緩沖液、14 μL β-巰基乙醇，65 ℃水浴40 min。期間輕搖離心管數次，后4 ℃10 000 r/min離心10 min。將上清液轉移至新的2 mL預冷滅菌離心管內，加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕上下顛倒2 min，靜置5 min后4 ℃10 000 r/min離心10 min。后重復此步驟1次。取上清液于新的2 mL預冷滅菌離心管內，加入2.5倍體積的-20℃預冷的無水乙醇。上下輕輕顛倒至完全混合均勻后-20 ℃冷凍過夜。后4 ℃10 000 r/min離心10 min，1 mL-20℃預冷的無水乙醇洗滌沉淀1次，再4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。加入60 μL EB緩沖液將固體溶解，后加入4 μL 碧云天生物公司生產的RNA酶，金屬浴加熱器中37 ℃存放1.5 h，取出后-40 ℃冷凍備用。

1.2.3 改良試劑盒法提取DNA

稱取約30 mg干燥葉片樣品于2 mL離心管內，加入2粒球形鋼珠，放于液氮中使其與液氮充分接觸，約5 min后取出放于水平震蕩儀上，30 Hz震蕩90 s，間隔2 min后相同頻率再震蕩90 s，使樣品被充分粉碎。加入750 μL預冷的核分離液，后續預處理過程同CTAB法。后參照北京BioTeKe生物公司生產的DNA提取試劑盒說明書提取樣品中的DNA。

1.3 ISSR-PCR反應

為驗證改良DNA提取方法的效果，選擇兩條由美國哥倫比亞大學研制開發的ISSR-PCR引物，分別為UBC813(CTCTCTCTCTCTCTCTT)和UBC836(AGAGAGAGAGAGAGAGA)，對提取的樣品基因組DNA進行擴增。

PCR反應體系經過預實驗優化，確立為20 μL。其中2×TSINGKE PCR Master(blue)預混體系10 μL，ISSR引物0.6 μL，DNA模板1μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；然后94℃ 30s，適當退火溫度(UBC813為49.8 ℃；UBC836為50.3 ℃)30 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 7 min，16 ℃保存。將擴增后的產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，150 V電泳30 min檢驗結果。

2 結果與分析

2.1 電泳檢測結果

利用改良后的CTAB法及試劑盒法對不同種典型櫻亞屬植物基因組DNA進行提取(圖1)。

A.改良試劑盒提??；B.改良CTAB法提取

結果表明，部分樣品如B-7，由于DNA含量過高，產生帶出現象；部分樣品如A-6、B-5，DNA存在降解彌散現象；少部分樣品如B-2、B-4，條帶亮度不高，對應含量偏低?？傮w而言改良后的兩種方法對DNA的提取效率明顯提高，幾乎沒有雜質影響。此外，從圖1中可以看出，A-8與B-8號樣品的得率均不高，可見DNA的提取效率也受到樣品種類影響。

2.2 紫外檢測結果

從表2中可以看出，兩種方法提取DNA的OD260與OD280比值在1.6～1.9之間，總體來說提取純度較高，蛋白質、RNA等雜質污染較少；兩種方法中，改良的試劑盒法提取的DNA的OD260/OD280相對更穩定，總體來說DNA濃度高于傳統的CTAB法。DNA濃度最高的是改良的CTAB法提取的毛葉山櫻花樣本(B-7)，最低為改良的CTAB法提取的浙閩櫻樣本(B-4)，由此可見DNA提取效率受到樣品本身影響較大，不同種櫻亞屬植物提取濃度存在明顯差異。

表2 不同方法提取樣品DNA吸光度及濃度

注：A為改良的試劑盒提??；B為改良的CATB法提取。

A.引物UBC813;B.引物UBC836

2.3 ISSR分子標記結果

實驗結果表明，兩條ISSR引物對所有DNA樣本擴增的條帶大小約在250bp～2000bp左右，不同DNA樣本之間多態性差異較大，不同ISSR引物之間擴增的多態性也存在較大差異。圖中所有條帶均沒有出現明顯的拖尾或降解現象，且條帶較亮，說明模板DNA鏈本身具有較高的完整度。

3 討 論

3.1 緩沖液對DNA提取效率分析

實驗結果證明，在正式開始提取實驗之前加入緩沖液進行預處理，可以極大程度地提高提取效率。緩沖液的成分，包括Tris堿、EDTA、 PVP、β-巰基乙醇等，均為后續提取實驗中會用到的試劑。所以不必考慮緩沖液會對后續實驗造成試劑污染。緩沖液中的各種成分的配比有利于多糖、色素、單寧、黃酮等雜質的溶解，離心后便可去除；若雜質過多，會使緩沖液極度粘稠，此時可以適當增加緩沖液洗滌次數，以確保雜質的去除效率。此外，由于緩沖液中的鹽濃度不高，故緩沖液本身不會大量溶解DNA，即不會降低DNA的含量。

值得注意的是緩沖液中含有β-巰基乙醇，此藥物是在緩沖液處理樣品時的抗氧化劑[9]，在高溫下會揮發和分解[10]，故在配置過程中最好在最后一步再加入；配置好的緩沖液應當放置于4℃冰箱中保存，且整個處理過程最好在低溫環境下進行。此外，緩沖液中的PVP可以增加溶液中其他藥品的親水性，使其余藥品能更好地溶解[11]。但實驗過程中發現，其本身與水結合后會形成膠體狀物質，故可以利用加熱型磁力攪拌器加速PVP本身的溶解。

在實驗過程中發現在去除緩沖液的時候離心轉速和旋轉時間也是一個非常重要的參數。若轉速和時間過高雖然可以有效地分離緩沖液和固體樣品，但是會導致樣品擠壓過實，從而影響后續提取試劑對樣品的處理；若轉速和時間過低又無法將固液完全分離。馬輝[12]等在對白術DNA提取過程中，將此步驟的轉速設定在4 000 r/min，時間為5 min；而筆者在實驗過程中發現，以3 000 r/min的轉速離心5 min，也可以達到和上述條件一樣的效果。為節省時間提高工作效率，故將實驗條件定為3 000 r/min離心5 min。

3.2 改良后兩種提取法的比較分析

由上述圖表可以看出，改良后的兩種提取方法對DNA均有較高的提取效率。相比較而言，在DNA提取的質量方面，兩種方法相差不大；在濃度方面，利用試劑盒法提取得到的DNA濃度總體而言高于CTAB法。這有可能是因為使用的CTAB緩沖液中含有β-巰基乙醇，而操作步驟中對的加熱過程導致β-巰基乙醇的揮發或者降解，從而導致DNA在提取時的抗氧化劑失效，從一定程度上降低了DNA的提取效率。在實驗操作時間方面，試劑盒法明顯優于傳統的CTAB法。利用試劑盒提取DNA，從緩沖液預處理算起，一般耗時1.5 h；而CTAB法需要超過6 h。從實驗要求的操作熟練程度而言，CTAB法步驟更為繁復，在細節方面要求更多，故對實驗員的熟練程度要求更高；而試劑盒由于已經是規范化生產，配合離心柱，按照說明書要求一步步操作即可，故對實驗員的技術要求沒有CTAB高。且CTAB法在操作過程中需要運用到氯仿異戊醇等有毒試劑，雖然其成本比試劑盒要低一些，但總體而言還是試劑盒法更為高效和安全。

3.3 其他操作步驟改進

在CTAB法提取實驗步驟中與試劑盒法不同，由于樣品研磨是在空氣中直接進行，為防止在研磨過程中空氣對DNA的氧化，故在研缽中提前放入少量PVP粉末，以確保此步驟不會造成DNA被氧化。此外，由于不同物種葉片硬度不一樣，有些樣品在研磨時需要加入少量石英砂以確保能充分被研磨[13-14]，但由于櫻亞屬植物葉片多為紙質，利用硅膠干燥后已經可以直接進行研磨，故在此實驗中未添加石英砂。在DNA析釋過程中，前人有使用異丙醇作為DNA的析釋劑[15]。雖然異丙醇可以將DNA從溶液中析釋出來，但是同時也會將殘留的蛋白質等雜質同時析出，造成二次污染；且異丙醇本身具有一定毒性，會對身體產生危害。故本實驗利用事先冷凍的冰乙醇代替異丙醇，大大降低了毒性同時不會影響DNA的析釋效率。在最后DNA溶解劑的選擇方面，前人使用TE緩沖液[16]或純凈水[17]對DNA進行溶解。在本實驗中，針對兩種提取方法得到的DNA，筆者均使用試劑盒中原裝的EB緩沖液進行溶解。原本三種試劑對DNA的溶解力相差不大，為方便實驗步驟，故直接選用EB緩沖液。此外，盡管在實驗步驟上進行諸多改進，但實驗樣品本身的新鮮程度也是影響實驗結果的重要因素。一般來說，在采樣時盡量選擇無破損、蟲蛀、枯萎發黃的新鮮葉片或嫩芽[18]，會對DNA的提取效率有顯著提高。

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Study on A New Extraction Method of Genomic DNA from Subg.Cerasus

Wu Fan1，2，Liu Xinhong2，Jiang Dongyue2，Li Yingang2，Yang Shaozong2，Liu Huahong3，Ni Sui1*

(1.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhejiang Forestry Academy，Hangzhou 310023，China；3.Hangzhou Landscaping Co.，Ltd.，Hangzhou 310020，China)

In the present study，a new method used to extract the genomic DNA of Subg.Cerasuswas developed based on the traditional methods of CTAB and kits.In the new method，the DNA extraction buffer was used as the pre-treatment buffer，and other procedures were also optimized.The new method was assayed through ISSR-PCR using the DNA extracted by the new method.The results showed that several impurities including polysaccharide，pigment，and flavone could be eliminated effectively by the new method，while the purity and quality of DNA extracted through the method of kit were better.The results of ISSR-PCR showed that the two pairs of primers could be used for amplification in the sample DNA，while the amplified bands were clear and there is no obvious degradation.In conclusion，the two new methods could be used to the extraction of genomic DNA of Subg.Cerasus.The new methods could be applied to the work of other species because of their high generalization.

Subg.Cerasus；DNA extraction；CTAB；kit

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.007

2016-08-18

浙江省科技廳院所專項—國產櫻花新品系無性快繁技術體系研發(2016F50024)；浙江省林科院院企合作項目—櫻花種質資源庫建設及新品種選育。

吳帆，男，碩士研究生，主要研究方向為植物分子生物學。E-mail：eiknarf@126.com

*通訊作者： 倪穗，教授，主要從事植物生物技術研究。E-mail：nisui@nbu.edu.cn

Q943

A

1006-9690(2017)02-0024-04