東亞鉗蝎氯毒素對膠質瘤U251細胞增殖的抑制作用及其機制

杜 軍,王瑞杰,蔡雨晴,張志云(山西大學生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006;通訊作者,E-mail:dujun@sxu.edu.cn)

東亞鉗蝎氯毒素對膠質瘤U251細胞增殖的抑制作用及其機制

杜 軍*,王瑞杰,蔡雨晴,張志云
(山西大學生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006;*通訊作者,E-mail:dujun@sxu.edu.cn)

目的 研究東亞鉗蝎氯離子通道毒素(BmK CT)對膠質瘤U251細胞增殖的抑制作用及其機制。 方法 制備融合蛋白GST-BmK CT,體外檢測GST-BmK CT對膠質瘤U251細胞增殖及細胞周期的影響。以GST-BmK CT處理組為實驗組,以GST處理組為陰性對照,PBS處理組為空白對照。MTT法分析各處理組U251細胞的增殖速度;流式細胞術分析U251細胞周期變化;蛋白免疫印跡法檢測MAPKAPK-2的蛋白的磷酸化及其上游蛋白p38的磷酸化。預先使用p38α特異性抑制劑SB203580處理細胞，檢測p38α活化對細胞周期阻滯的影響。 結果 MTT結果表明,融合蛋白GST-BmK CT體外處理U251細胞48 h和96 h,增殖抑制率分別為(25±1.9)%和(33±2.3)%,與GST處理組相比差異有統計學意義(P<0.001)。流式細胞檢測結果表明,處理U251細胞96 h,GST-BmK CT組比空白對照組S期和G2/M期比例增多,差異有統計學意義(P<0.005),GST陰性對照組相比空白組細胞周期各時相差異均無統計學意義(P>0.05)。蛋白免疫印跡結果顯示GST-BmK CT能激活p38α絲裂原活化蛋白激酶(p38αMAPK),而用p38α特異性抑制劑SB203580能反轉GST-BmK引起的細胞周期阻滯。結果進一步表明,BmK CT通過活化p38α激活下游絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶-2(MAPKAPK-2,MK2)從而引起細胞S期和G2/M期的阻滯。 結論 GST-BmK CT是通過p38αMAPK信號通路激活MK2來引起U251細胞周期在S期和G2/M期的阻滯,從而抑制細胞增殖。

蝎氯毒素； 神經膠質瘤； 細胞周期阻滯； p38αMAPK信號通路

神經膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤,約占所有腦部中樞神經系統腫瘤的30%和所有惡性腦腫瘤的80%[1,2]。神經膠質瘤的臨床治療主要以外科手術切除為主,同時輔助化學藥物療法和放射療法。盡管治療的水平不斷提高,然而神經膠質瘤在腦內呈浸潤性生長、其增殖復發能力較強等特點仍是臨床治療的難點,膠質瘤患者的中位總生存期在過去幾十年并沒有明顯的延長,仍然保持在1年左右[3，4]。因此,迫切需要改善膠質瘤治療的方法和手段。

蝎氯毒素全稱為蝎氯離子通道神經毒素,由36個氨基酸組成,最早從以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus)尾腺的毒液中提取純化得到。蝎氯毒素能特異地阻斷大鼠結腸上皮細胞的小電導氯離子通道而得名[5，6]。東亞鉗蝎氯毒素(BmK CT)是從廣泛分布于我國的東亞鉗蝎(Buthus martensii Karshch，BmK)中發現并分離的一種類氯毒素基因[7，8]編碼的多肽,與以色列蝎氯毒素有相似的功能[9，10]。蝎氯毒素可以特異地結合在膠質瘤細胞表面高表達的基質金屬蛋白酶2(MMP-2)并下調其活性從而抑制細胞的遷移能力[11]。我們前期研究證實BmK CT除了能抑制惡性神經膠質瘤細胞遷移,同時能抑制膠質瘤細胞的增殖[12，13]。也有相關研究報道證實東亞鉗蝎的氯毒素在大鼠膠質瘤模型中可以特異地結合腦神經膠質瘤細胞并且抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移[14]。目前已證實蝎氯毒素抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移主要是通過抑制MMP-2蛋白的活性,但BmK CT抑制細胞增殖的機制尚不明確。

本實驗對東亞鉗蝎氯毒素融合蛋白GST-BmK CT抗膠質瘤作用進行深入分析,探究BmK CT抑制膠質瘤U251細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 質粒、細胞株及主要試劑

質粒pGEX-6p-1-BmK CT的構建及融合蛋白GST-BmK CT的表達、純化由梁愛華課題組完成,同時表達、純化GST蛋白做對照。U251細胞株由山西省人民醫院胡濤博士饋贈;胎牛血清(德國PAN Biotech公司);細胞培養液DMEM(美國Gibco公司);TE(0.25% trypsin and 0.02% EDTA solution,美國Gibco公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國Thermo公司);三聯溶液(10% SDS,5% Isobutyl alcohol,0.01 mol/L HCl);propidium iodine(PI)和RNase A(美國Sigma公司);BCA蛋白定量試劑(美國Thermo公司);SB203580 和細胞裂解液(RIPA),購自碧云天生物技術公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)(北京康潤誠業有限公司);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(瑞士羅氏公司);GAPDH抗體(天津三箭生物公司);P-p38、p38、P-MAPKAPK-2抗體(美國cell signaling technology公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(美國Sigma公司)。

1.2 細胞培養及處理

人源的神經膠質瘤細胞系U251培養在含有10%胎牛血清的高糖培養基DMEM中,細胞培養維持在37 ℃、5% CO2的環境中。細胞消化使用含有0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶。

為了檢測GST-BmK CT對U251細胞增殖及細胞周期的影響,首先將U251細胞計數,按相同細胞數分為三組：一組以1.12 μmol/L GST-BmK CT處理為實驗組,一組以1.12 μmol/L GST處理為陰性對照組,一組以PBS處理組為空白對照。MTT分析各處理組細胞增殖速度,流式細胞儀檢測細胞周期變化。

為了檢測GST-BmK CT處理U251細胞后相關信號通路的變化,分別用1.12 μmol/L融合蛋白GST-BmK CT和1.12 μmol/L標簽蛋白GST處理U251細胞不同時間,蛋白免疫印跡檢測隨著處理時間的延長,信號通路蛋白表達及磷酸化情況。為了檢測p38α活化對細胞周期阻滯的影響，預先用p38α特異性抑制劑SB203580(終濃度為4 μg/ml)處理1 h，移除培養基，PBS漂洗一次，加入1.12 μmol/L GST-BmK CT。PBS處理和GST-BmK CT單獨處理為對照組，SB203580單獨處理和SB203580+GST-BmK聯合處理為實驗組。

1.3 細胞增殖分析

用MTT法做細胞的增殖分析。將U251細胞以1 000個/孔的密度接種96孔板,待細胞貼壁分別加GST-BmK CT(1.12 μmol/L)和GST(1.12 μmol/L)蛋白,設PBS為空白對照組,每組6個復孔,在刺激48 h、96 h每孔加5 mg/ml MTT 10 μl,培養箱繼續孵育4 h。隨后每孔加入100 μl的三聯溶液,繼續在培養箱中孵育溶解過夜,確保甲瓚完全溶解。在酶標儀上檢測570 nm處的吸光值。實驗重復3次。

1.4 細胞周期分析

U251細胞以5×104個/孔的密度接種于12孔板,過夜貼壁,分別加GST-BmK CT(1.12 μmol/L)和GST(1.12 μmol/L)蛋白,設PBS為空白對照組,每組3個復孔。刺激96 h用胰蛋白酶消化收集細胞。收集的細胞用PBS洗1次,用70%的乙醇固定1 h。細胞懸液加適量的PBS,4 000 r/min離心收集細胞,再用PBS漂洗1次,100 μl PBS重懸細胞,其中包含5 μg/ml PI和100 μg/ml RNase A,室溫避光染色30 min。收集細胞用Becton Dickinson FACScan(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)流式檢測DNA含量。通過PI熒光計算出DNA含量,并根據細胞周期各時相的DNA含量計算各細胞周期的百分率。

1.5 蛋白免疫印跡分析

U251細胞以適當密度接種于6孔板,待細胞生長至底面的70%-80%時,實驗組加入GST-BmK CT(1.12 μmol/L)或GST(1.12 μmol/L)蛋白,刺激的時間梯度為1，2，4，8，16 h;空白對照組培養基加等量PBS。收取不同刺激時相的U251細胞,用PBS漂洗1次,加適量細胞裂解液(含有PMSF和蛋白酶及磷酸酶抑制劑),冰上裂解細胞30 min,離心30 min(15 000 r/min、4 ℃),吸取上清,用BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE膠每孔上20 μg總蛋白樣做電泳,冰浴轉膜,含5%的牛血清白蛋白(BSA)的TBST封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,TBST漂洗3次、每次10 min,加入對應的二抗室溫孵育1 h,TBST漂洗3次、每次10 min,用ECL顯色液顯色,分子成像系統掃描儀記錄實驗結果。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 融合蛋白GST-BmK CT抑制U251細胞存活的能力

MTT結果顯示,GST-BmK CT處理U251細胞48 h、96 h,對細胞增殖有明顯的抑制效果(見圖1),以PBS處理組為參照分析,GST-BmK CT處理組的的抑制率在48 h為(25±1.9)%,在96 h為(33±2.3)%,與GST處理組相比較,差異有統計學意義(P<0.001)。

與GST組比較，*P<0.001圖1 MTT法分析GST-BmK CT和GST刺激U251細胞48 h,96 h細胞增殖Figure 1 Cell proliferation of U251 cells after treatment with GST-BmK CT and GST for 48 h and 96 h by MTT assay

2.2 融合蛋白GST-BmK CT誘導U251細胞周期發生S期和G2/M期的阻滯

GST-BmK CT作用U251細胞96 h,相比于PBS對照組和GST處理組,細胞周期中處于S期和G2/M期時相的比例明顯增加(見圖2),差異有統計學意義(P<0.005)。與PBS對照組比較,GST處理前后細胞周期各時相均沒有明顯的變化(P>0.05)。GST-BmK CT處理前后細胞周期各時相發生了明顯的變化,G0/G1期的比例為(42±1.5)%,相較于空白對照組的(77±0.6)%,有統計學差異(P<0.001);S期的比例為(45±1.9)%,相較于空白對照組的(18±1.2)%,差異有統計學意義(P<0.001);G2/M期的比例為(13±1.7)%,相較于空白對照組的(6±1.6)%明顯增加(P<0.05)。以上結果表明,GST-BmK CT具有誘導U251細胞S期和G2/M期阻滯的作用。

與空白對照比較，*P<0.005,**P<0.001圖2 GST-BmK CT、GST及PBS不同處理U251對周期阻滯的影響Figure 2 Effect of different treatment on cell cycle arrest of U251 cells

2.3 融合蛋白GST-BmK CT能特異性激活p38α信號通路

為了進一步尋找GST-BmK CT誘導U251細胞S期和G2/M期阻滯的分子機制,利用蛋白免疫印跡分析檢測了與細胞周期相關的應急激活蛋白的變化情況。GST-BmK CT能激活p38αMAPK信號途徑,隨著GST-BmK CT刺激時間的延長,p38α的磷酸化水平逐漸升高(見圖3A),而GST并不能激活p38αMAPK(見圖3B)。表明了BmK CT可以活化p38αMAPK蛋白。

2.4 SB203580能解除GST-BmK CT誘導的U251細胞周期在S期和G2/M期的阻滯

SB203580預處理前后細胞周期各時相的差異并沒有統計學意義(P>0.05,見圖 4),表明抑制劑本身不會影響細胞周期變化。圖4C結果顯示,GST-BmK CT單獨刺激U251細胞與SB203580預處理再做同樣的刺激相比,各細胞周期時相的差異均具有統計學意義(P<0.001)。以上結果表明，GST-BmK CT激活的p38α信號途徑和其誘導的U251細胞S期和G2/M期阻滯密切相關。

2.5 融合蛋白GST-BmK CT通過激活MK2誘導U251 S期和G2/M期的阻滯

GST-BmK CT能選擇性的激活p38α,同時 SB203580預處理并不影響p38α激活(見圖5A)。圖5B顯示,GST-BmK CT單獨刺激U251細胞,能選擇性的激活MAPKAPK-2;當用SB203580預處理U251細胞,GST-BmK CT激活MAPKAPK-2的能力明顯減弱。以上結果進一步證明了GST-BmK CT特異性激活p38αMAPK信號途徑,活化的 MAPKAPK-2是導致U251細胞S期和G2/M期阻滯的直接因素。

B.GST刺激U251細胞不同時間p38總蛋白及磷酸化水平的表達圖3 蛋白免疫印跡檢測p38總蛋白及磷酸化水平Figure 3 The total protein levels and phosphorylation status of p38 by Western blot after treated with GST or GST-BmK CT for different time

圖4 流式細胞術分析GST-BmK CT或SB203580單獨及聯合處理U251細胞后細胞周期變化(*P<0.005,**P<0.001)Figure 4 Cell cycle arrest of U251 cells after treatment with GST-BmK CT,SB203580,or their combination(*P<0.005,**P<0.001)

B.不同處理后MAPKAPK-2的磷酸化水平圖5 蛋白免疫印跡檢測p38蛋白磷酸化及其下游蛋白MAPKAPK-2的磷酸化Figure 5 The phophorylation level of p38 (A) and MAPKAPK-2 (B) after treated with GST-BmK CT,SB203580,or their combination by Western blot

3 討論

惡性膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤,具有極高的死亡率[15，16]。根據WHO統計,在世界的不同地區,源于神經系統的顱內腫瘤的發病率約為219/100 000人,這些患者中的50%是具有高死亡率的惡性神經膠質瘤。美國癌癥協會的統計顯示大約77%的膠質母細胞瘤患者在1年內死亡。

我們實驗室前期的數據表明BmK CT能抑制膠質瘤細胞的生長、侵襲和遷移[12，13]。本研究進一步發現BmK CT能引起膠質瘤細胞周期阻滯在S期和G2/M期從而抑制細胞增殖。因此，GST-BmK CT是通過何種信號途徑誘導U251細胞S期和G2/M期周期阻滯是我們希望闡明的重要之處。

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要的成員,響應于很多應激刺激[17，18],例如細胞因子、紫外線照射、熱休克等,并且參與細胞分化、凋亡和自噬。已經發現了4種亞型的p38MAPK,分別是p38α、β、γ以及δ。有研究報道p38α參與調節DNA損傷的細胞周期檢驗點,在DNA甲基化試劑誘導的DNA損傷模型中,p38α通過使細胞周期的調節蛋白Cdc25C失活來激活G2檢驗點,導致G2阻滯[19];在紫外輻射誘導的DNA損傷模型中,p38α參與S期的阻滯和G2/M期的轉變[20，21]。

已有證據表明,絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶-2(MAPKAPK-2)是一個重要的DNA損傷檢驗點激酶家族成員[20]。該激酶和Chk1、Chk2一樣,也是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員。這種激酶通過被p38 MAP激酶的直接磷酸化來調節,與p38 MAP激酶一起發揮作用[22,23]。MAPKAPK-2調節DNA損傷的主要分子機制是通過控制Cdc25家族的磷酸化依賴性失活,Cdc25家族是Cyclin/Cdk復合物的主要調節者。Cdc25家族主要包括3個異構體:Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C。MAPKAPK-2調控細胞周期檢驗點是通過磷酸化Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C,從而創造了一個和磷酸絲氨酸結合蛋白家族(14-3-3蛋白)的結合位點。14-3-3蛋白通過阻止Cdc25滯留在胞質,從而阻斷了與核內的CycB-cdk1的相互作用,導致細胞周期阻滯。在紫外線誘導DNA損傷模型中,其磷酸化Cdc25A能導致S期的阻滯,磷酸化Cdc25B/C能導致G2/M期的阻滯[20]。

本研究結果顯示,融合蛋白GST-BmK CT能特異地抑制U251細胞的增殖。GST-BmK CT刺激U251細胞96 h,細胞周期各時相發生了明顯的改變,U251細胞周期在S期和G2/M期發生阻滯。研究結果表明，GST-BmK CT能選擇性的激活p38α,當用p38MAPK信號途徑特異性的抑制劑SB205380預處理U251細胞再用GST-BmK CT做刺激發現,細胞周期各時相變化不明顯,與空白對照組相比,U251細胞周期在S期和G2/M期幾乎沒有阻滯,表明p38α在GST-BmK CT誘導的U251細胞周期阻滯中起重要作用。MAPKAPK-2是p38αMAPK下游的一個直接激活靶標,更是一個DNA損傷細胞周期檢驗點激酶。本研究首次觀察到GST-BmK CT刺激U251細胞,MAPKAPK-2被激活從而引起細胞周期阻滯;當用SB205380預處理U251細胞,GST-BmK CT引起的MAPKAPK-2的激活明顯減弱,更進一步證明了GST-BmK CT激活p38αMAPK信號途徑的選擇性。此研究揭示了GST-BmK CT引起U251細胞周期S期和G2/M期阻滯的分子機制,為進一步探討BmK CT作為治療神經膠質瘤的新途徑和方法提供實驗依據。

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Inhibitive effect ofBmK CT on proliferation of glioma U251 cells and its mechanism

DU Jun*,WANG Ruijie,CAI Yuqing,ZHANG Zhiyun
(KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineering,MinistryofEducation,InstituteofBiotechnology,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;*Correspondingauthor,E-mail:dujun@sxu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect ofBmK CT on proliferation of glioma U251 cells and its possible mechanism.MethodsU251 cells were treated with GST-BmK CTinvitroto evaluate the effects on proliferation and cell cycle.U251 cells were treated with GST-BmK CT(experiment group),GST(GST group) and PBS(PBS group),respectively.MTT was used to analyze the proliferation of U251 cells,and flow cytometry was used to analyze the cell cycle of U251 cells.Western blot was used to detect the expression of related proteins. Effect of pretreatment with SB203580 on cell cycle was determined.ResultsMTT results showed that the inhibition rates were (25±1.9)% and (33±2.3)% in U251 cells after treated with GST-BmK CTinvitrofor 48 h and 96 h,which were significantly different from those of GST group(P<0.001).Flow cytometry analysis found that the cells in S phase and G2/M phase were increased in GST-BmK CT group after treatment for 96 h compared with PBS group(P<0.005),but there was no significant difference between GST group and PBS group during the cell cycle phase(P>0.05).Western blot showed that GST-BmK CT activated p38α-mitogen-activated protein kinase(p38αMAPK),and p38α inhibitor SB203580 significantly reversed cell cycle arrest triggered by GST-BmK CT. MAPKAPK-2 was phosphorylated to induce S and G2/M phase arrest.ConclusionGST-BmK CT may cause U251 cell cycle arrest in the S phase and G2/M phase by activating MK2 through the p38αMAPK signal pathway to inhibit the proliferation of U251 cells.

Karsch Chlorotoxin； glioma； cell cycle arrest； p38αMAPK signal pathway

國家自然科學基金資助項目(31400765);山西省自然科學基金資助項目(201601D202064);高等學?？萍紕撔禄鹳Y助項目(2015117)

杜軍,男,1985-11生,博士,講師,E-mail:dujun@sxu.edu.cn

2017-02-17

R730.264

A

1007-6611(2017)05-0420-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.004