甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析

李 冰趙玉龍朱強龍張志鵬樊 超欒非時*高 鵬*

（1農業部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農業大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱 150030；3黑龍江省農業科學院海南基地，海南三亞 572000）

甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析

李 冰1，2趙玉龍1，2朱強龍1，2張志鵬1，2樊 超2，3欒非時1，2*高 鵬1，2*

（1農業部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農業大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱 150030；3黑龍江省農業科學院海南基地，海南三亞 572000）

以甜瓜高抗白粉病自交系MR-1為母本，易感白粉病自交系Top Mark為父本，構建BC1P2和F2群體，經13個國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主鑒定，2015年東北農業大學設施園藝工程中心的白粉病發病病菌為P. xanthii生理小種1，甜瓜MR-1對P. xanthii生理小種1的抗性由單顯性基因控制。通過對266個F2分離群體的抗病性鑒定和CAPS標記分析，采用復合區間作圖法對甜瓜抗白粉病性狀進行QTL分析，最終構建了1張包含203個CAPS標記的甜瓜遺傳連鎖圖譜，并將抗病基因PXR定位在第12號染色體上M12-GH和M12-TE 2個標記之間，該基因與兩側翼標記間的距離分別為0.63 cM和0.42 cM，兩側翼標記間在甜瓜參考基因組上對應的物理距離為303 kb，該區域內含有60個預測基因，其中10個基因含有非同義單堿基突變。10個基因熒光定量分析結果顯示，在抗病與感病甜瓜表達量存在較大差異的4個基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457為甜瓜白粉病抗病候選基因。

甜瓜；白粉??；CAPS；抗病基因

甜瓜（Cucumis meloL.）起源于非洲和亞洲熱帶地區，廣泛栽培于世界范圍內溫帶至熱帶地區（林紅梅 等，2013），據FAOSTAT和中國農業統計資料最新數據顯示，2014年全球甜瓜總產量達到0.296億t，我國2015年的甜瓜總產量約為0.153億t。白粉病作為甜瓜、黃瓜、南瓜等葫蘆科作物上廣泛發生的一種世界性真菌病害，在露地和保護地栽培中均有發生，發病時葉片表面形成不規則大片病斑，嚴重時全葉或莖蔓上遍布白粉，葉片脆硬干枯甚至喪失光合能力，造成植株早衰（谷醫林，2013），從而嚴重影響葫蘆科作物的品質和產量，是危害甜瓜生產的主要病害之一。目前，已報道的最常見的引起白粉病的病原菌是單囊殼屬的單囊殼菌Podosphaera xanthii（原名為Sphaerotheca fuliginea）和白粉菌屬的二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum（原名為Erysiphe cichoracearum）（Kí? stko vá et al.，2009）。同二孢白粉菌相比，單囊殼菌主要發生在全球范圍內的高溫高濕度地區，具有生理小種多、發病范圍廣的特點（Mccreight，2003）。根據對不同鑒別寄主侵染的反應，P. xanthii被分為很多生理小種，包括小種0、1、2 US、2 France（2F）、3、4、5、N1（race 6）、N2（race 7）、N3和N4（Hosoya et al.，1999，2000）。隨著鑒別寄主數量的增加和研究的不斷深入，陸續有新的生理小種被發現（Mccreight，2006；Hoytaek et al.，2016）。美國發病較多的為P. xanthii生理小種1、2和3（Mccreight，2003），法國則是P. xanthii生理小種0、4和5（Bardin et al.，1999）。 在我國最普遍發生的是P. xanthii小種1和2F（盧浩 等，2015），這兩種生理小種在黑龍江省均有報道（馬鴻艷 等，2011）。

白粉病病原菌增殖快，傳播迅速，致死率高，防治困難?？拐婢幬锏氖┯秒m然有一定的作用，但是并不能完全抑制白粉病的發生，而且過多的施用會引起白粉病生理小種的耐藥性甚至突變，也會對環境造成危害（Hollomon et al.，2002）。植物抗病育種是控制病害發生和減少藥劑使用量的有效途徑，深入了解甜瓜白粉病抗病遺傳機制是甜瓜白粉病抗性育種工作的基礎和首要任務，也是分子標記等生物技術輔助育種的基礎。針對P. xanthii小種1和小種2F的抗病基因研究已有多篇報道。甜瓜品種PI 414723中的抗病基因Pm-7對P. xanthii生理小種 1具有抗性（Pitrat，2006）；甜瓜品種WMR 29中的抗病基因Pm-w對P. xanthii生理小種1和2具有抗性；抗病基因Pm-1抗P. Xanthii生理小種1，被定位在 LGⅨ上（Teixeira et al.，2008）；甜瓜品種PI 414723中的抗病基因Pm-x對P. Xanthii生理小種2F具有抗性（Pitrat，1990）；甜瓜品種K7-1中的抗病基因Pm-2F被定位在LG Ⅱ上（Zhang et al.，2012）。MR-1是白粉病鑒別寄主之一，對多種白粉病生理小種均表達出抗性，但是其中的抗病基因還未被準確定位。

本試驗以國際甜瓜白粉病生理小種通用鑒別寄主中高抗品種MR-1為母本，以高感白粉病品種Top Mark為父本，配制BC1P2和F2群體，開發CAPS分子標記，構建甜瓜分子遺傳圖譜，并對甜瓜白粉病抗病基因進行QTL分析。獲得2個與白粉病抗病基因相連鎖的CAPS標記。運用熒光定量PCR方法對預測候選基因在親本中的表達量進行差異性分析，從而對甜瓜白粉病抗病基因進行預測，為甜瓜白粉病抗病基因的克隆與轉基因研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

選用國際甜瓜白粉病生理小種通用鑒別寄主中高抗品種MR-1為母本，以高感白粉病品種Top Mark為父本，雜交獲得到F1，將F1嚴格自交授粉獲得F2種子，F1與Top Mark回交獲得BC1P2。本試驗用于白粉病生理小種鑒定的13種國際鑒別寄主分別為：Iran H、Top Mark、V é drantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6和Nantais Oblong。供試種子均由東北農業大學園藝園林學院西甜瓜分子遺傳育種研究室提供。

2015年5月，將MR-1、Top Mark、F1、BC1P2、F2群體和13個鑒別寄主分別定植于東北農業大學設施園藝工程中心（44°04′N，125°42′E），親本與F1采用隨機區組方式各定植15株，BC1P2種植45株，13個鑒別寄主各種植5株，采用完全隨機方式定植266株F2群體。株距50 cm，行距80 cm，均采用常規栽培管理方式和水肥供給。

1.2白粉病菌接種和抗性調查

在盛花期采集同年同地區嚴重侵染甜瓜植株的白粉病菌，配制濃度為106個·mL-1的孢子懸浮液，均勻噴灑在植株葉片上（Zhang et al.，2011）。接種10 d后對親本、F1、BC1P2、F2和13個鑒別寄主的白粉病侵染情況進行調查，取每株植株從下至上10片真葉分別進行觀察記錄與拍照留存。根據病斑分布情況將每片葉片的發病情況分為6級：0級，無病斑；1級，沒有明顯的病斑；2級，低級程度侵染；3級，中等程度侵染；4級，嚴重侵染；5級，病斑分布整片葉子（圖1），并計算每株單株的發病指數（PDI）。PDI＜40的植株為高抗，PDI＞60的植株為感病，40≤PDI≤60的植株為中抗，其中高抗植株與中抗植株均記為抗病。

圖1葉片病斑分級標準

調查統計13份鑒別寄主的發病情況，并參考魏尊苗等（2011）鑒定葫蘆科白粉病生理小種的標準對本試驗中的甜瓜白粉病生理小種進行鑒別。

1.3 DNA的提取

分別采集P1、P2、F1、F2群體單株的幼嫩葉片保存于-80 ℃冰箱中，采用改良CTAB法（Allen et al.，2006）提取葉片的基因組DNA。DNA的質量和濃度通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計進行檢測（SMA 3000，Plextech，中國深圳）。

1.4 CAPS分子標記的開發與篩選

將MR-1與Top Mark的基因組重測序數據與甜瓜DHL92參考基因組數據進行比對（Li et al.，2009），利用東北農業大學西甜瓜分子遺傳育種研究室自編Perl語言腳本提取位于SNP位點兩端約500 bp的片段序列作為候選SNP位點序列。通過SNP2CAPS軟件結合7種不同的限制性內切酶（EcoR I、Hind Ⅲ、PstI、BamH I、XbaI、XhoI和Hinf I）對候選SNP序列進行CAPS酶切位點信息的分析，在酶切位點上、下游100～500 bp設計引物，盡可能讓引物均勻地分布在12條染色體上，引物設計使用Primer premier 6.0軟件并送至上海生工生物工程有限公司進行合成。

將MR-1、Top Mark與F1利用引物進行降落PCR（Touchdown PCR）擴增，PCR反應體系（10 μL）為：60 ng基因組DNA，上下游引物各1 pmol，1.5 mmol·L-1dNTPs，10×Taq緩沖液和1 U的Taq酶；PCR擴增程序為：94 ℃預熱7 min，共30個循環，每個循環包括94 ℃變性1 min，60 ℃至45 ℃每個循環減少0.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃最終延伸10 min。

選擇相應的限制性內切酶在37 ℃酶切PCR產物3～4 h，酶切反應體系包含：5 μL PCR產物，3 U限制性內切酶，1 μL緩沖液和9 μL ddH2O。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物多態性。

1.5 QTL分析

將篩選出的具有多態性的203對CAPS標記用于F2群體的基因型分析，經過降落PCR、酶切，以及1%瓊脂糖凝膠電泳，將母本帶型記為2，父本帶型記為0，雜合帶型記為1，缺失帶型記為-1。利用QTL ICImapping v4.0軟件構建甜瓜遺傳連鎖圖譜（LOD=3.0），并進行QTL分析（LOD=4.0）。

1.6 RNA的提取與cDNA的合成

利用Trizol（Invitrogen USA）法提取MR-1與Top Mark葉片RNA。RNA的質量和濃度同樣通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計進行檢測，檢測合格的RNA利用東洋紡反轉錄試劑盒（First Strand cDNA Synthesis Kit，TOYOBO，JAPAN）進行第1條鏈cDNA的合成，并于-80 ℃條件進行保存。

1.7熒光定量分析

根據CAPS分子標記所設計的引物在甜瓜參考基因組中的位置和最新版本的基因組注釋信息，截取該區域內的所有推測基因，并分析這些基因在兩親本間的單核苷酸多態性。篩選其中具有非同義單核苷酸多態性（nsSNP）的基因進行實時熒光定量分析（qRT-PCR）?；蚓幋a全長序列來源于甜瓜基因組數據庫（https：//melonomics.net），再根據所用的熒光定量試劑盒說明書要求，使用Primer premier 6.0軟件設計引物（表1）并送至上海生工生物工程有限公司合成。利用熒光定量試劑盒（RealMaster Mix SYBR Green，TIANGEN）進行所有樣品的qRT-PCR反應，所有樣本均進行3次生物學重復和3次技術重復，配制與加樣過程均在冰上進行。qRT-PCR反應體系為：1 μL稀釋的cDNA樣品，上、下游引物各1 μL，9 μL 2.5× RealMaster Mix反應液，加8 μL RNase-free ddH2O至20 μL。qRT-PCR擴增程序為：95 ℃預變性60 s；40個循環，每個循環包括95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。擴增反應后通過溶解曲線分析擴增產物的特異性。采用2-ΔΔCT法（Livak & Schmittgen，2001）計算相對表達量。

表1熒光定量分析引物

2 結果與分析

2.1甜瓜白粉病發病生理小種鑒定

根據13個甜瓜白粉病鑒別寄主的抗感鑒定結果與文獻中白粉病生理小種鑒定標準，2015年東北農業大學設施園藝工程中心的白粉病發病特征符合P. xanthii生理小種1的發病特征，即認為本試驗中所有抗感分級及分離群體抗感鑒定均針對P. xanthii生理小種1。

2.2分離群體抗感反應鑒定

在抗感反應鑒定中（表2），母本MR-1與F1中未發現或發現少量白粉病斑，表現出較強的抗病性；而父本Top Mark被白粉病嚴重侵染，表現出較強的感病性；BC1P2中抗病單株21株，感病單株24株；F2群體中抗病單株為201株，感病單株為65株，經χ2檢驗符合3∶1的分離比例（P＞0.05）。由此可知，MR-1中抗白粉病P. xanthii生理小種1的基因為顯性單基因。

表2各世代群體對白粉病的抗感反應

2.3甜瓜遺傳連鎖圖譜的構建及QTL分析

利用203對CAPS引物對266個F2單株進行基因型分析，構建了一張包含12條連鎖群的遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組長度1 865.32 cM，標記圖上位置與物理圖譜位置一一對應，標記間平均距離為9.19 cM。其中第9號染色體圖距最長，為186.22 cM，包含19個CAPS標記；第1號染色體圖距最短，為69.28 cM，包含18個CAPS標記（表3、圖2）。

表3甜瓜遺傳連鎖圖譜上的分子標記分布

2.4白粉病抗病基因的染色體定位

基于本試驗獲得的甜瓜遺傳連鎖圖譜和白粉病抗病表型鑒定結果，運用QTL ICIMapping v4.0 軟件對白粉病抗病基因進行QTL分析，共檢測到1個與甜瓜白粉病抗病相關的QTL，命名為PXR（圖2），PXR位于第12號染色體M12-GH與M12-TE標記之間，與兩側翼標記間的距離分別為0.63 cM和0.42 cM。LOD值為32.5，可解釋78.26%的表型變異率，加性效應為0.399 9，顯性效應為0.518 0。由于遺傳距離較小和貢獻率較高，說明PXR與兩側翼的標記連鎖緊密且可以作為主效基因進行下一步基因挖掘。

2.5候選基因確定及熒光定量分析

標記M12-GH和M12-TE在染色體上的位置相距較近，分別位于第12號染色體22 623 096 bp和22 926 554 bp處，因此初步將PXR定位在12號染色體上物理距離303 kb的范圍內，根據該區段內的參考基因組的注釋信息及兩親本間序列的單核苷酸多態性信息，發現該區域內已注釋的甜瓜相關基因有60個，其中10個基因（MELO3C002434、MELO3C002437、M E L O 3 C 0 0 2 4 3 9、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 0、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 1、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 3、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 5、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 7、MELO3C002457、MELO3C002465）上包含了32個nsSNPs，并推測這10個基因為候選基因（表4）。經過基因功能注釋，這些基因為錨蛋白重復家族蛋白、熱休克蛋白、抗壞血酸氧化酶等。

圖2甜瓜F2群體構建的遺傳連鎖圖譜

在親本中對10個基因進行熒光定量分析和表達量差異分析。結果表明（圖3），4個基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457在抗白粉病甜瓜MR-1中的表達量均大于同期感白粉病甜瓜Top Mark，并存在較大差異，但其他基因的表達量無明顯差別。由此推測：MELO3C002434、M E L O 3 C 0 0 2 4 3 7、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 1、MELO3C002457更有可能是白粉病抗病基因。

表4基因功能注釋結果

圖3 10個基因在親本中表達量差異分析

3 結論與討論

甜瓜的高產量與高質量是育種的主要目標，白粉病的發生對甜瓜的產量與品質產生了很大的危害，培育抗白粉病的甜瓜品種是控制甜瓜白粉病發生的有效途徑，為了從抗病材料中進行抗病基因的挖掘，首先要對該抗病材料的抗病基因的遺傳特性進行研究。甜瓜不同抗病材料中抗病基因的抗病機制與遺傳位置不同，遺傳模式也有所差別（寧雪飛 等，2013）。通常有單顯性基因（Liu et al.，2010）、不完全顯性基因（王建設 等，2005）、主效基因和微效基因（Barnes & Epps，1956）、多基因（Epinat et al.，1993）等。近年的研究結果大都符合單顯性基因控制白粉病抗性這一理論，部分研究出現不符合單基因孟德爾遺傳的抗病分離群體可能是由于存在偏分離現象或受到環境等因素的影響（Wang et al.，2011）。本試驗結果也支持甜瓜白粉病抗性是由單顯性基因控制的理論。但是即使同一種甜瓜材料，隨著生理小種的不同，抗病基因與遺傳模式也不盡相同。

2016年于東北農業大學向陽農場定植相同群體，但13個鑒別寄主的鑒定結果表明，當年當地發病白粉病病菌為P. xanthii生理小種2F，同本試驗2015年該地區發病生理小種不同，相同親本MR-1與Top Mark雜交得到的F1表現出明顯的感病狀態，并且F2群體感病植株與抗病植株分離比例約為2∶1，不符合單基因模型，表明P. xanthii生理小種2F的抗病基因為隱性遺傳，但基因遺傳模型比較復雜或還受到白粉病其他生理小種的干擾。由此推斷，本試驗抗病親本MR-1中同時存在P. xanthii生理小種1和2F的抗病基因，且基因數量、位置和遺傳模型不同。

由于常規的PCR和Northern blot難以對基因的表達差異進行準確和快速的分析，人們通常選用qRT-PCR進行候選基因的確定。Xu等（2015）采用qRT-PCR對20個黃瓜果肉厚度的候選基因進行差異性表達量分析，發現Csa2M058670.1基因在父母本之間表達量差異很大，從而確定其為黃瓜果肉厚度候選基因。Nie等（2015）在對pm5.1基因在親本間進行熒光定量分析時發現，這個基因與植物細胞壁厚度有關，因此在接種白粉病菌后表達量的改變說明pm5.1通過調控細胞壁厚度從而阻礙白粉病菌的入侵。本試驗對10個基因進行qRT-PCR分析，比較它們在抗感甜瓜品種中的表達量差異，得到了4個差異性表達的基因作為甜瓜白粉病抗病的候選基因（MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457）。

在4個候選基因中，MELO3C002434與MELO3C002441為含錨蛋白重復序列的相關基因。前人在錨蛋白重復序列基因與植物抗病與抗逆的關系中有一些相關研究，水稻XB3是一個泛素連接酶E3，其中含有RING指結構域和錨蛋白重復序列，它與水稻中響應生物脅迫信號的類受體激酶XA21相結合，調節水稻對白葉枯病的抗性。擬南芥中含有的XBAT35基因中含有錨蛋白重復序列，通過參與乙烯信號的負調過程，從而對脅迫產生免疫機制（劉士揚，2014）。MELO3C002457為類似過氧化物酶基因，在低溫脅迫過程中，起著清除自由基的作用，避免自由基大量積累損害膜系統（沈麗雯，2015）。侯建設等（2009）通過熱激處理青椒，來提高過氧化物酶等的活性，從而顯著降低低溫冷藏過程中的冷害。而在基因功能注釋的結果中，MELO3C002437并未顯示出具有已報道的基因功能，所以對候選基因的確認還需要進一步的研究。

本試驗對白粉病抗病基因定位的研究表明，2015年東北農業大學設施園藝工程中心的白粉病優勢生理小種為P. xanthii生理小種1，甜瓜高抗白粉病品種MR-1對P. xanthii生理小種1的抗性由單顯性基因控制。經過QTL和qRT-PCR分析，得到了1個303 kb的基因組區域，并初步確認該區域內的4個基因為甜瓜白粉病抗病候選基因，為下一步的基因克隆以及基因功能驗證提供了理論依據。

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Melon Powdery Mildew Resistance Gene Location and Candidate Gene Analysis

LI Bing1，2，ZHAO Yu-long1，2，ZHU Qiang-long1，2，ZHANG Zhi-peng1，2，FAN Chao2，3，LUAN Fei-shi1，2*，GAO Peng1，2*

〔1KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops（NortheastRegion），Ministryof Agriculture，Harbin150030，Heilongjiang，China；2HorticultureandLandscapeArchitectureCollegeofNortheast AgriculturalUniversity，Harbin150030，Heilongjiang，China；3HainanBaseofHeilongjiangAcademyofAgricultural Sciences，Sanya572000，Hainan，China〕

BC1P2and F2generations were constructed by crossing a melon inbred line ‘MR-1’ highlyresistant to powdery mildew（Podosphaera xanthii）as female parent，and a melon inbred line ‘Top Mark’highly susceptible to powdery mildew as male parent. The race ofP. xanthiiwas identified as race 1 according to the infecting action of 13 international differential hosts for melon powdery mildew，and the resistance to powdery mildew was controlled by a single dominant gene based on the population genetic analysis of BC1P2and F2. Through evaluating the resistance in 266 individuals of F2，the genotype analysis using cleaved amplified polymorphic sequences（CAPS），and quantitative trait loci（QTL）analysis using composite interval mapping method（CIM）for locating the locus resistant to powdery mildew，a genetic linkage map of melon contained 203 CAPS was constructed. One QTL namedPXRwas detected on chromosome 12 between the 2 CAPS markers，M12-GH and M12-TE，which were tightly linked to the gene resistant to powdery mildew with the genetic distances of 0.63 cM and 0.42 cM，respectively. Sixty putative genes were located in the region with the length of 303 kb between the 2 flanking markers. Ten of them with non-synonymous single nucleotide polymorphism（nsSNP）were further identified as candidate genes resistant to powdery mildew in melon. The results suggested that 4 genes（MELO3C002434，MELO3C002437，MELO3C002441，andMELO3C002457）showed bigger differences in expression of disease resistance and susceptible might be the candidate genes resistant to powdery mildew in melon.

Melon；Powdery mildew；CAPS；Disease resistance gene

李冰，女，碩士研究生，專業方向：甜瓜分子遺傳育種，E-mail：1332142074@qq.com

*通訊作者（Corresponding authors）：欒非時，女，教授，博士生導師，專業方向：西甜瓜分子遺傳育種，E-mail：luanfeishi@neau.edu.cn；高鵬，男，副研究員，碩士生導師，專業方向：西甜瓜分子遺傳育種，E-mail：gaopeng_neau@163.com

2016-12-22；接受日期：2017-03-13

國家自然科學基金項目（31301791，31672177），東北農業大學“學術骨干”計劃項目（16XG06），東北農業大學“青年才俊”計劃項目（14QC09），國家西甜瓜產業技術體系-分子育種崗位項目（CARS-26-02）