超濾親和結合液相色譜—質譜聯用和分子對接技術篩選毛菊苣種子中高親和性α—葡萄糖苷酶抑制劑

陳海君+秦惠玉+龍飛+于瑋+王穎慧+陳露君+李全凱+陳文+秦冬梅+韓博

摘 要 采用超濾親和結合液相色譜質譜聯用（UFLCMS） 和分子對接技術篩選毛菊苣種子中高親和α葡萄糖苷酶抑制劑。以4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物，阿卡波糖為陽性對照，評價毛菊苣種子提取物對α葡萄糖苷酶的抑制活性，其中阿卡波糖IC50為0.003 mg/mL，毛菊苣種子IC50為0.447 mg/mL。利用UFLCMS技術對毛菊苣種子提取物進行篩選鑒定，獲得4種化合物； 通過Autodock軟件篩選出2種與α葡萄糖苷酶有較高親和力的化合物，分別是綠原酸和異綠原酸A。結合體外酶活實驗，驗證了綠原酸、異綠原酸A對α葡萄糖苷酶的抑制活性。結果表明，各化合物對α葡萄糖苷酶的抑制活性由大到小依次是：阿卡波糖>異綠原酸A>綠原酸，其中異綠原酸A與阿卡波糖抑制率相近。

關鍵詞 超濾親和； 液相色譜質譜聯用； 分子對接； 毛菊苣種子； α葡萄糖苷酶抑制劑

1 引 言

目前，從天然產物中發現2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM） [1，2]治療藥物是治療糖尿病的研究熱點之一。α葡萄糖苷酶抑制劑已被廣泛用于治療T2DM，拜唐蘋作為α葡萄糖苷酶抑制劑的代表藥物，主要成分為阿卡波糖，其療效已被臨床研究和應用所證實。

毛菊苣（Cichorium glandulosum Boiss. et Hout） 為菊科菊苣屬植物[3，4]，是維吾爾族醫生習用藥材，常以地上部分入藥，具清肝利膽、健胃消食、利尿消腫之功效[5，6]，被中華人民共和國衛生計生委藥食同源藥材目錄（2015版） 列為“藥食同源類”藥材。研究發現，毛菊苣具有良好的降糖活性[7]，但目前研究主要集中于地上部分，其種子部位降糖物質基礎尚不明確。探索毛菊苣種子（Cichorium glandulosum Boiss. et Hout seed， CGS） 的作用機制，尋找其降糖的物質基礎是深入開發毛菊苣種子的關鍵。

傳統中藥分離方法主要為柱層析、兩相溶劑萃取法、系統溶劑分離法等[8，9]。但天然產物組成復雜，分離純化耗時長，操作復雜[10]。近年來建立的超濾親和液相色譜質譜聯用（Ultra filtration affinityliquid chromatographymass spectrometry，UFLCMS） 技術可在很大程度上克服傳統方法的缺點，在藥物篩選中顯示了良好的實用性和高效性[11]，但采用該技術時仍存在假陽性結果。研究者開發了多種方法減少假陽性結果， 如明膠沉淀法結合在線篩選法[12，13]、多組實驗對照法[14， 15]、鍵和磁珠篩選法[16～18]。

為提高篩選質量，本研究對UFLCMS篩選技術進行改進和優化，結合分子對接技術（Molecular docking） 篩選毛菊苣種子中高親和性的α葡萄糖苷酶抑制劑，為毛菊苣種子的降糖活性物質基礎研究提供了參考。本研究的工作流程圖如圖1所示。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Waters2545型高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器） 、Xevo TQD質譜聯用儀（美國Waters公司） ； 3001型多功能酶標儀（美國熱電公司） ； Microcon超濾離心管（YM10，MWCO 10 KDa， 美國Millipore公司） ； Centrifuge5424R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司） ； QL861渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司） ； MiliQ Advantage A10超純水系統（美國Millipore公司） 。

α葡萄糖苷酶（50～120KD） 、4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷（PNPG） 、阿卡波糖（SigmaAldrich公司） ； 綠原酸、異綠原酸A對照品（上海源葉生物科技有限公司） ； 甲醇和乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司） ； 其余試劑為分析純，實驗用水為MilliQ超純水。

毛菊苣種子購于新疆維吾爾自治區和田縣，經石河子大學藥學院韓博副教授鑒定系毛菊苣種子，存放于新疆特種植物藥重點實驗室藥劑學研究室。

2.2 毛菊苣種子樣品處理

稱取毛菊苣種子約30 g， 用95%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，合并提取液，稀釋至4 mg/mL。將α葡萄糖苷酶凍用10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.86）配制成2 U/mL的溶液，用于酶活性分析。

2.3 毛菊苣種子提取物的α葡萄糖苷酶活性抑制實驗

參照文獻[19，20]方法，以PNPG為底物，阿卡波糖為陽性對照，測定毛菊苣種子提取物的酶抑制活性。實驗分為空白組、陽性對照組、樣品組和背景組（n=3） 。依次加入PBS緩沖液、樣品和α葡萄糖苷酶液，于37℃反應15 min，加入PNPG底物溶液，孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應，立即測定405 nm處吸光度值。

2.5 HPLCMS/MS分析條件

HPLC條件：Symmetry C18分析柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm） ； 柱溫25℃； 梯度洗脫：流動相A為0.2%甲酸溶液，B為乙腈； 梯度洗脫：0～5 min，12% B； 5～20 min，12%～25% B； 20～45 min，25%～40%B； 45～60 min，40%～50% B； 流速1.0 mL/min； 檢測波長254 nm； 進樣量20 μL。

電噴霧質譜（ESIMS） 條件：正、負離子電離模式，掃描范圍m/z 100～2000 Da，實驗前質量數均經過校正，毛細管電壓2 kV。ESI電噴霧離子源溫度200℃，錐孔氣為氮氣，碰撞氣為氦氣，錐孔電壓30～60 kV，碰撞電壓15～30 V。

2.6 分子對接

利用Autodock vina軟件（Scripps研究所的Olson實驗室） 進行分子對接，在NCBI蛋白質數據庫中用PSIBLAST在Protein Data Bank數據庫進行序列相似性搜索。使用PYMOL 1.2（DeLanoScientific LLC公司） 軟件作圖。

選取α葡萄糖苷酶晶體（PDB ID： 2QMJ） ，在上述構建好的α葡萄糖苷酶的三維結構基礎上，利用Autodock tools（Scripps研究所的Olson實驗室） 剝離蛋白質三維結構中的溶劑水分子和調節原子，根據配體結構特性找到結合部位，將存儲文件中的化合物與蛋白質分子進行柔性對接，在每一個對接后，移動小分子的位置，使之最匹配。排除結合程度較低、位置不佳的化合物，記錄配體與受體對接位置及計算評分。以上所用參數除特別指明外，均為默認參數。

2.7 篩選得到的化合物的抑制活性驗證

參照2.4節方法，對毛菊苣種子中經UFLCMS和分子對接篩選出的化合物進行體外酶活性抑制實驗的驗證。

3 結果與討論

3.1 毛菊苣種子提取物對α葡萄糖苷酶的抑制活性

如表1所示， 2.0 mg/mL阿卡波糖對α葡萄糖苷酶的抑制率為93.2%，IC50為0.003 mg/mL。相同濃度的毛菊苣種子提取物對α葡萄糖苷酶的抑制率為73.0%，IC50為0.447 mg/mL，表明毛菊苣種子具有良好的α葡萄糖苷酶抑制活性，可作為進一步復篩的對象。

3.2 毛菊苣種子提取物的超濾親和液相色譜質譜聯用分析

按照2.4節的方法，篩選毛菊苣種子提取物中與α葡萄糖苷酶特異性結合的小分子。與毛菊苣種子提取物的色譜圖（圖2A） 相比發現，在超濾篩選實驗條件下，毛菊苣種子提取物中只有部分化合物能夠與α葡萄糖苷酶結合（圖2C） ； 與空白對照的色譜圖（圖2B）相比發現，本方法可有效避免小分子化合物吸附到超濾膜而造成的假陽性結果。

天然酶捕獲的配體所對應的峰面積大于其滅活酶對照的峰面積。因此峰面積的變化情況可反映化合物與α葡萄糖苷酶的結合率，圖2C中未標注序號的峰的峰高和峰面積無顯著性差異，這可能由于濃度較大的化合物占據α葡萄糖苷酶活性位點的概率比濃度小的化合物大所致。通過對比結合率，篩選出4個峰（圖2C） ，各峰與α葡萄糖苷酶的結合率均大于19.0%，表明毛菊苣種子提取物中的活性成分能夠與α葡萄糖苷酶特異性結合。以陽性對照阿卡波糖進行超濾實驗（圖2D），表明本方法準確性較好。

3.3 液相色譜質譜聯用分析和結構鑒定

根據超濾親和篩選出的4種化合物的保留時間、準分子離子峰和二級質譜碎片信息（表2） ，結合參考文獻進行解析，結果見圖3和圖4。紫外光譜分析結果（圖3A、3B； 圖4A、4B） 表明，化合物2，3和4具有相似的紫外吸收行為，最大吸收峰在325 nm附近； 而化合物1的最大吸收峰在330 nm處?；衔?準分子離子峰為m/z 177，在二級質譜分析中丟失兩分子CO，產生碎片離子為m/z 151、123和105，具有較高的相對豐度，結合保留時間和文獻[5]，鑒定化合物1為秦皮乙素?；衔?在負離子模式下的一級質譜圖和二級質譜圖如圖3C和圖3E所示。

化合物2準分子離子峰為m/z 353，在二級質譜分析中丟失一分子C6H10O6，產生碎片離子m/z 183，繼而丟失一分子H2O，產生碎片離子m/z 165，結合保留時間和文獻[24，25]，鑒定化合物2為綠原酸?；衔?在負離子模式下的一級質譜圖和二級質譜圖如圖3D和圖3F所示。

化合物3準分子離子峰為m/z 515，在二級質譜分析產生碎片離子m/z 353、179和135，具有較高的相對豐度。結合異綠原酸B保留時間和文獻[26]，鑒定化合物3為異綠原酸B?；衔?在負離子模式下的一級質譜圖和二級質譜圖如圖4C和圖4E所示。

化合物4準分子離子峰為m/z 515，在二級質譜分析產生碎片離子m/z 353和191，具有較高的相對豐度。結合異綠原酸A保留時間和文獻[26]，鑒定化合物4為異綠原酸A?；衔?在負離子模式下的一級質譜圖和二級質譜圖如圖4D和圖4F所示。

3.4 分子對接結果

以阿卡波糖為陽性對照，采用分子對接方法，評價對接評分和空間結合模式，結果見圖5。對接評分次序為：異綠原酸A>綠原酸>異綠原酸B>秦皮乙素。從空腔位置分析，毛菊苣種子化合物中秦皮乙素、異綠原酸B可與α葡萄糖苷酶結合，但空腔位置占據較小，缺乏氫鍵支持。綠原酸和異綠原酸A空腔占據位置較大，氫鍵數多，推測綠原酸和異綠原酸A可作為高親和力的α葡萄糖抑制劑。

3.5 活性實驗驗證結果

根據UFLCMS和分子對接篩選結果，對毛菊苣種子中篩選出潛在的α葡萄糖苷酶抑制劑綠原酸和異綠原酸A進行了體外酶活性抑制實驗，結果見表3。體外酶活性抑制實驗結果表明，綠原酸和異綠原酸A對α葡萄糖苷酶的抑制活性較強，與分子對接篩選結果吻合。抑制率順序為阿卡波糖>異綠原酸A>綠原酸，且各化合物都呈現明顯的濃度依賴性。

4 結 論

通過建立酶抑制劑模型，發現毛菊苣種子提取物具有良好的α葡萄糖苷酶抑制活性。利用UFLCMS技術從毛菊苣種子提取物中篩選并鑒定出4種潛在的α葡萄糖苷酶抑制劑，初步鑒定為為秦皮乙素、綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸B。通過分子對接技術，在常規的對接得分評價匹配性的基礎上，分析4種化合物與α葡萄糖苷酶結合程度和對接評分，得到異綠原酸A和綠原酸兩種高親和力的酶抑制劑，并進行酶活性驗證。結果表明，隨著作用濃度提高，其抑制率逐漸提高，并呈現出一定的濃度依賴性，異綠原酸A的酶活性抑制率大于綠原酸。文獻[27～31]表明，這兩種化合物具降糖功效，與本研究結果吻合。本研究結果為開發基于毛菊苣的降血糖產品提供了依據，也為在天然產物中發現高親和力的酶抑制劑提供了方法。

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Abstract Highaffinity αglucosidase inhibitors were screened from Cichorium glundulosum Boiss.et Hout seed （CGS） extract by ultrafiltration affinityliquid chromatographymass spectrometry （UFLCMS） and molecular docking. By taking 4nitrobenzeneαDglucopyranoside （PNPG） as substrate and acarbose as positive control to evaluate the inhibitory activity of CGS extract， IC50 of acarbose and CGS extract were 0.003 mg/mL and 0.447 mg/mL， respectively. Meanwhile， 4 compounds from CGS extract by UFLCMS were screened and identified. Then by using autodock software， the compounds that combined with αglucosidase were well screened out， including chlorogenic acid and isochlorogenic acid A. The inhibitory activity of chlorogenic acid and chlorogenic acid A against αglucosidase was verified in vitro. The results showed that the inhibitory activity of the compounds toward αglucosidase presented the sequence of acarbose>isochlorogenic acid A>chlorogenic acid. The inhibition rate of isochlorogenic acid A was close to acarbose. The experimental results illustrated that UFLCMS and molecular docking could be used to screen high affinity enzyme inhibitors from CGS.

Keywords Ultrafiltration affinity； Liquid chromatographymass spectrometry； Molecular docking； Cichorium glundulosum Boiss.et Hout seed； αGlucosidase inhibitors