電針對5月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬組織及組織間液可溶性 Ab1-42水平的影響

步青云,薛衛國

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電針對5月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬組織及組織間液可溶性 Ab1-42水平的影響

步青云,薛衛國

(北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京 100029)

目的 觀察電針干預對早期阿爾茨海默病(AD)小鼠腦組織間液(interstitial fluid,ISF)及海馬組織中可溶性Ab1-42水平的影響。方法 將雄性5月齡APP/PS1轉基因陽性小鼠16只隨機分為模型組和針刺組,將8只同窩、同性別轉基因陰性小鼠設為正常對照組,采用電針百會、涌泉或同等條件束縛作為干預手段,以腦微透析技術獲取小鼠海馬組織間液,以Elisa檢測3組小鼠海馬組織以及海馬ISFb淀粉樣蛋白1-42水平分別在干預后的第6、7、8、9個小時變化情況。結果 與正常對照組相比,模型組海馬組織以及ISF中可溶性Ab1-42明顯升高(＜0.01);與模型組相比,針刺組小鼠ISF可溶性Ab1-42降低(＜0.05),海馬組織Ab1-42對比無統計學差異(＞0.05)。針刺組在電針治療后的第6～9個小時之間的樣品檢測結果沒有隨時間變化的趨勢(＞0.05)。結論 電針可降低AD模型小鼠海馬ISF可溶性Ab1-42水平。

阿爾茨海默病;電針;早期干預;腦組織間液;微透析;小鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種中樞神經系統退行性疾病,臨床表現主要為患者認知功能及記憶力的減退、智力衰退和生活自理能力的下降等,嚴重危害老年人的健康和生活質量。其主要病理改變是細胞間因淀粉樣蛋白沉積而形成的老年斑(senile plaque,SP)、神經細胞內存在的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)及神經元丟失(neurons loss)等。AD發病機制有多種假說,包括氧化應激學說、Tau蛋白學說、神經血管學說、膽堿能學說等,目前占據主導地位、認可度最高的是b淀粉樣蛋白(Beta-Amyloid Protein,Ab)級聯學說[1-2]。

Ab級聯學說進一步的研究顯示,疾病早期Ab代謝紊亂可能是AD發病的初始事件。Ab在腦內的代謝異?？梢苑譃樯稍龆嗪颓宄郎p少。研究表明,占AD發病群體95%以上的晚發性AD缺少基因突變促使Ab過度生成的證據[3],而Ab的清除障礙成為了晚發性AD最具可能性的病因。正常情況下,Ab從神經元產生后,可通過酶降解、細胞吞噬隔離和向外周血液轉運等途徑進行清除,組織間液(interstitial fluid,ISF)是其進入不同代謝途徑的中間場所。Ab清除過程不易觀察,選擇其清除通路的中間環節——ISF檢測可溶性Ab水平,是對電針能否切實改變Ab清除水平從而改善AD癥狀的較優選擇。

本次實驗設計采用電針療法干預發病早期(5月齡)的APP/PS1小鼠,穴位組方選用涌泉、百會,上下交通,安神清氣,益氣通絡。試圖探討電針干預對AD小鼠海馬組織及海馬ISF中可溶性Ab1-42水平的影響,為說明電針干預AD的療效及機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

實驗采用清潔級雄性APP/PS1轉基因陽性與同窩轉基因陰性小鼠(南京大學模式動物研究所)作為實驗對象。轉基因陽性小鼠16只隨機分為模型組(M)、針刺組(A),每組8只,轉基因陰性小鼠(野生型)8只為正常對照組(C)。購入時為16周齡,體重(28±5)g。小鼠置于中國中醫科學院醫學實驗中心動物房Individual ventilated caging system(IVC系統)飼養3星期以適應環境,室溫20～25℃,相對濕度50%～65%,自由進食及飲水。本實驗嚴格遵守中華人民共和國國家科學技術委員會制定的《實驗動物管理條例》,并經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準實施。

1.2 穴位選擇和針刺方法

針刺組:將小鼠以自制鼠袋固定于操作臺上,按照大鼠針灸穴位圖譜及比較解剖學方法,在頂骨正中取百會,在兩足底前、中1/3交界處取涌泉。選用華佗牌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司),規格0.25 mm×13 mm,穴位與針具常規消毒,刺入2～3 mm,百會用手針,雙涌泉行小幅度捻轉后接HANs電針儀,采用疏密波,頻率為1/50 Hz,強度0.5 mA,以針柄震顫、動物保持安靜不掙扎嘶叫為度。每次針刺持續15 min,每日1次,連續3 d。

模型組、正常對照組:以相同方法用鼠袋束縛15 min,每日1次,連續3 d。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 藥品與試劑

5%水合氯醛(批號為20130201,國藥集團化學試劑有限公司),醫用生理鹽水(氯化鈉注射液,批號為B14041607,山東康寧藥業有限公司);人工腦脊液Ⅰ(批號為2014080301,湖州英創生物科技有限公司);超敏試劑盒同批次Ab1-42標準品,濃度稀釋至100 pg/mL,用于體外回收率測定。

人Ab42 Elisa試劑盒(美國,invitrogen, KHB3441);人Ab42超敏Elisa試劑盒(96T,美國,life technologies,KHB3544);Trizol(美國,Invitrogen, 15596026)。以上藥品及試劑均在4℃冰箱保存,備用。

1.3.2 儀器與材料

68002雙臂腦立體定位儀,68030小鼠及幼大鼠適配器(深圳市瑞沃德生命科技有限公司); STRONG90＋102顱骨鉆(SAESHIN PRECISION IND.CO.,韓國);玻璃子體水門汀(批號為201312,上海醫療器械股份有限公司齒科材料廠);微透析系統包括CMA130體外固定支架,CMA402雙通道微量注射泵,CMA470低溫微量收集器,CMA120清醒活動裝置,1.0 mL玻璃微量注射器(瑞典CMA/Microdialysis公司);五通轉環清醒活動裝置(Instech Laboratories,Inc,美國);MAB13.8.1微透析探針(有效透析膜長為1 mm,分子截留量為100 kD)及MAB10.8.IC探針導管(Microbiotech/se AB公司,瑞典);YP2001N電子天平(上海精密科學儀器有限公司);韓氏穴位神經刺激儀(北京華衛產業開發公司,HANs LH202H型);一次性使用無菌針灸針(0.25 mm

×13 mm,北京中研太和醫藥有限公司)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 微透析采樣

第3天干預后開始計時,將小鼠稱重,腹腔注射5%水合氯醛麻醉(450 mg/kg),小鼠頭部剃毛,固定于腦立體定位儀,使顱骨處于水平位(門齒位置低于兩耳桿水平度約1 mm)。頭部皮膚碘酒消毒,75%乙醇脫碘,然后切開長約1 cm小口,撐開,暴露顱骨表面。參考Paxinos G和Franklin KBJ[4]編寫的小鼠立體定位圖譜,以前囟(Bregma)為坐標原點,左側海馬的定位坐標為前囟后0.28 cm,中縫線左0.30 cm,垂直深度為 0.20 cm(微透析探針深度為0.21 cm)。在定位坐標處,打孔,插入探針導管至設定深度。在對側位置打孔,擰上固定用螺絲,玻璃子體水門汀固定整個導管。待小鼠逐漸清醒后,備用。手術將微透析探針埋入小鼠左側海馬C3區內下方。于干預結束后第5個小時將其送入CMA/120清醒動物活動裝置。將探針與CMA微量取樣系統相連接,進行內外壓平衡1 h。于干預結束后第6個小時開始正式的微透析采樣工作。

以0.5mL/min的灌流速度進行微透析,灌流液選擇人工腦脊液,一次取樣透析時間為1 h,每小時采樣結束即將樣品放入﹣80℃凍存等待檢測。每只小鼠取4次透析液樣品,即干預治療或束縛后第6、7、8、9個小時的樣品,用于分析研究。

1.4.2 腦組織取材及樣品制備

微透析采樣結束后,將每組8只小鼠,予0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,開顱取微透析操作的對側海馬,及時做Elisa樣品制備,完成后迅速置于﹣80℃冰箱保存。

Elisa樣品的制備。每組8只小鼠采用微透析操作的方法操作對側海馬,稱取海馬的濕重,以8倍體積的5 mol鹽酸胍、50 mmol Tris鹽酸(pH8.0)、1 mmol PMSF混合液在冰上勻漿。4℃下16000 r/min,離心20 min,離心結束后立即取上清液。模型組按1:100的體積比加入標準稀釋液(Invitrogen,KHB3441),電針組按1:20的體積比加入標準稀釋液,正常對照組樣品不稀釋上清液,待測。

1.4.3 小鼠海馬組織以及ISF Ab1-42的測定

采用Elisa雙抗體夾心法,用人Ab1-42Elisa超敏試劑盒檢測ISF中的含量,每孔按照1:1體積比各加入標準品或待測樣品與樣品稀釋液,室溫靜置30 min。充分洗板,每孔加入檢測抗體50mL(空白對照組除外),4℃過夜。次日上午充分洗板,每孔加二抗100mL,室溫靜置30 min。充分洗板,加入穩定色原,每孔100mL,放入暗箱避光,室溫靜置30 min。每孔加入100mL終止液。15 min內用酶標儀在450 nm處測吸光度值。以Excel繪制標準蛋白線,按樣品OD值換算樣品Ab1-42濃度,并根據樣品讀數及稀釋濃度計算出海馬區腦細胞間液可溶性Ab1-42濃度。

使用人Ab42Elisa試劑盒對海馬組織樣品Ab1-42含量進行檢測。每孔各加入標準品或待測樣品50mL。依照試劑盒說明常規操作檢測。以Excel繪制標準蛋白線,按樣品讀數換算樣品Ab1-42濃度,并根據樣品稀釋濃度計算出小鼠海馬組織Ab1-42濃度。

1.4.4 待測樣品Ab水平計算方法

依據小鼠在體實驗Elisa檢測結果,酶標儀讀出樣品OD值、標準品OD值,結合標準品對應的密度值用Excel做標準曲線2=0.9992＞0.95,繪制曲線接近于直線。Ab1-42標準曲線公式為:蛋白濃度=37.042×OD值－6.2194。利用標準曲線公式計算每孔濃度(pg/mL),根據樣品稀釋比例,計算待測樣品蛋白含量(pg/mL)。

由于3組小鼠樣品均按照1:1稀釋,故3組組織勻漿待測樣品濃度的計算公式均為:Ab1-42含量=(37.042×OD值－6.2194)×2×8/1000。而每只小鼠腦內ISF所含Ab1-42水平為Ab1-42水平=(37.042×OD值－6.2194)×2/P。P為每只小鼠所用探針對應的回收率(見表1)。

1.5 統計學方法

應用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理。計量數據以均數±標準差表示。重復測量數據與時間相關性檢測選用球形檢驗,組間比較如方差齊則采用單因素方差分析(-),兩兩比較用-檢驗,非正態分布的采用多樣本的非參數檢驗。以＜0.05為有統計學差異,＜0.01為具有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 探針體外回收率檢測

在正式實驗之前,首先對所用探針進行體外回收率檢測,共4個探針,每個探針每小時凍存一次樣品,共3 h。流速0.5mL/min,透析原液為濃度100 pg/mL的Ab42標準品。Elisa得到標準曲線為=41.726－5.5367(2=0.9988),透析樣品OD值套入標準曲線得到回收率結果如表1。

表1 探針體外回收率檢測結果 (±s)

表1 探針體外回收率檢測結果 (±s)

項目2號探針4號探針6號探針7號探針 探針OD值0.78±0.010.77±0.020.78±0.020.78±0.01 P(透析液)/(pg·mL﹣1)16.54±0.1616.43±0.4416.76±0.3916.62±0.22 h(探針回收率)/%16.54±0.1616.43±0.4416.76±0.3916.62±0.22

2.2 電針干預對5月齡APP/PS1小鼠海馬組織及ISF可溶性Ab1-42水平的短時影響

以進行單因素方差分析,Elisa結果見表2、圖1。檢驗進行各組間兩兩比較,海馬組織檢測結果,模型組Ab1-42表達水平高于正常對照組(＜0.01);針刺組Ab1-42表達水平與模型組比較差異無統計學意義(＞0.05)。ISF檢測結果,模型組可溶性Ab1-42表達水平高于正常對照組(＜0.01);針刺組可溶性Ab1-42表達水平低于模型組(＜0.05)。

表2 電針對5月齡APP/PS1鼠海馬組織及ISF Ab1-42表達水平的短時影響 [±s,r/(pg·mL﹣1)]

表2 電針對5月齡APP/PS1鼠海馬組織及ISF Ab1-42表達水平的短時影響 [±s,r/(pg·mL﹣1)]

組別n海馬組織Ab1-42海馬ISF Ab1-42 正常對照組(C)815.21±1.774.38±1.57 模型組(M)8287.06±72.431)354.97±75.091) 針刺組(A)8249.76±70.29220.92±25.962)

注:與正常對照組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05

2.3 小鼠經不同干預后腦組織間液(ISF)Ab1-42隨時間變化

2.3.1 各組數據比較分析

重復測量數據分析3組ISF樣品檢測結果, Mauchly球形檢驗計量=0.900,=0.838,不拒絕球形假設,不用矯正。分組與時間的交互作用無統計學意義,時間因素的作用不隨著分組的不同而不同。而組間效應方差分析結果,=93.427,=3.52E-11＜0.01,表示針刺組、模型組與正常對照組的結果間存在顯著差異。各組小鼠ISF中Ab1-42水平隨時間變化結果用單因素分析如表3,與正常對照組相比,模型組海馬ISF可溶性Ab1-42明顯升高(＜0.01);與模型組相比,針刺組小鼠ISF可溶性Ab1-42降低(＜0.05,＜0.01)。

2.3.2 針刺后短期內小鼠ISF的Ab1-42水平隨時間變化結果

如前所述,Hour采用球形度結果,=0.788,=0.505＞0.05,不同時間的檢驗結果差異沒有統計學意義。故而采用單因素方差分析,Elisa結果OD值以及計算濃度見圖2、表4。

圖2 小鼠腦組織間液可溶性Ab1-42均值對比[±s, r/(pg·mL﹣1)]

小鼠電針后第6、7、8、9小時樣品ISF中Ab1-42含量相比較,＞0.05,無統計學差異。模型組水平也較為恒定,表明針刺組在連續3 d治療后,其可溶性Ab1-42水平降低效果,在最后一次針刺干預后6～9小時相對穩定。這有可能表示針刺干預后6～9小時處于一種恒定的低水平,也可能是連續3 d治療的累積效應。

表3 小鼠腦組織間液可溶性Ab1-42水平 [±s,r/(pg·mL﹣1)]

表3 小鼠腦組織間液可溶性Ab1-42水平 [±s,r/(pg·mL﹣1)]

組別第6小時第7小時第8小時第9小時 模型組(M)342.55±127.121)357.90±138.881)336.61±94.991)382.80±129.761) 針刺組(A)184.46±34.243)221.89±70.673)238.60±78.872)238.72±66.783) 正常對照組(C)4.05±2.905.98±2.672.63±2.544.85±3.19

注:與正常對照組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

表4 針刺組小鼠海馬ISF中Ab1-42表達水平隨時間變化的結果 [±s,r/(pg·mL﹣1)]

表4 針刺組小鼠海馬ISF中Ab1-42表達水平隨時間變化的結果 [±s,r/(pg·mL﹣1)]

組別nAb1-42 針刺后第6小時8184.46±34.24 針刺后第7小時8221.89±70.67 針刺后第8小時8238.60±78.87 針刺后第9小時8238.72±66.77

3 討論

在人類的成年期,幾乎沒有新的神經元形成,任何大腦細胞因外傷和/或疾病而失去功能,都是不能以生成取代其作用的新細胞來挽救的。因此神經元損失通常會導致大腦功能受損,在大多數情況下,這種損傷是永久性的。神經退行性疾病的神經元丟失是一個重要的特性,可呈隱匿性發展,隨后出現的臨床癥狀則取決于大腦受影響的區域和神經退行性變化的程度與速度。阿爾茨海默病的臨床表現就是這一病理過程的典型體現,疾病早期的病理因素診查顯得尤為重要。

早期的Ab級聯學說發現,腦內以Ab為主要成分的老年斑作為AD三大病理特征之一,同時也是疾病癥狀產生的主要病理因素。近期的Ab級聯學說傾向于認為AD患者早期出現的記憶缺失是由于神經元突觸功能障礙而非神經元死亡,造成這種障礙很有可能是單體或寡聚體而非老年斑。這解釋了模型小鼠學習記憶行為學改變早于老年斑形成的現象,印證了AD發病隱匿、病程緩慢的特點。通過近些年的研究,人們也越來越加深了對這種假設的認可?？扇苄訟b從“疾病病理指標”逐漸走向了“AD重要的早期診斷指標”這一角色[5]。

Ab在腦內存在形式多樣,可溶性Ab包括單體、可溶性寡聚體、及Ab原纖維等,不可溶性Ab主要是變性的纖維化Ab(Fibrils)。其中可溶性Ab1-42單體及其寡聚體在納摩爾水平即可產生較為明顯的神經毒性[6]。

Ab總體水平的升高可歸因于產生增多或是清除減少,對于遺傳家族性AD而言前者為病因[7-8],而占據AD發病多數的散發性AD則缺乏Ab過度產生的證據,因此有理由認為其清除障礙是淀粉樣病變發生的主要原因。

Ab的代謝途徑主要有腦內降解酶降解和外周的肝腎降解酶降解,腦內的神經元、膠質細胞和血管內皮細胞都可以表達產生這類降解酶[9]。生理狀態下,腦內Ab的產生和清除處于一個動態平衡。但是Ab主要的降解場所究竟是在腦內還是外周仍是研究焦點之一。

Banks WA和Kastin AJ[10]在1989年使用過碘標記法觀察Ab后,研究者們開始采用各種辦法觀察腦內Ab的外流和滯留情況[11]。實驗結果表明,通過血-腦屏障(blood- brain barrier,BBB)將Ab轉運至對其有強大清除能力的外周血液,是腦內Ab的主要清除路徑[12]。

既有研究顯示,血腦屏障的損壞是中樞神經系統疾病的一大關鍵因素[13],在神經退行性疾病方面尤其明顯。血腦屏障是由內皮細胞與細胞粘附分子形成的存在于大腦血液與組織間液ISF之間的滲透屏障。除主要結構是內皮細胞形成的緊密連接之外,血腦屏障的組成還包括周細胞、星形膠質細胞終足和基底膜,這些結構形成一個集合,或稱為神經-血管單元。形成血腦屏障的血管內皮細胞含有選擇性運輸作用的轉運蛋白和有分解代謝作用的酶,用于實現血腦屏障的關鍵功能。要穿過BBB的分子必須具備適當的物理化學屬性,能夠在腦ISF中達到足夠的時量曲線(time-concentration)。也因為如此,血腦屏障的這種隔離功能不只使得研發能夠在不破壞中樞神經系統功能的前提下進入腦組織發揮作用的中樞神經系統藥物變得困難重重,同時也給對腦微環境的觀察及動態研究設置了障礙。

組織微量透析法是測量腦ISF中的神經活化復合物最直接的方法[14],雖然腦室的室管膜內襯允許CSF和ISF中溶質的擴散和對流交換[15],但由于其他代謝途徑的參與[16],溶質在CSF的濃度與在ISF中并不完全一樣[17]。有研究將實驗動物腦組織ISF與側腦室和小腦延髓池的CSF平行取樣,選擇乙酰氨基酚濃度的檢 測結果作為大腦BBB被動轉運研究并建立多時間點濃度觀測的參照指標,同時也對其血液樣本中同一目標溶質濃度進行了觀測。平均而言,大腦ISF的目標溶質濃度約為CSF中目標溶質濃度的4倍。并且大腦ISF、側腦室CSF和小腦延髓池CSF中目標溶質濃度與平均腦-血漿曲線下面積(area under the curve,AUC)比率分別為121%、28%、35%[18]。因此可以說,對腦內代謝環境進行觀察時ISF是優于CSF的選擇。

電針可能通過改善大腦Ab清除效率,降低腦內Ab水平,減少其產生的神經毒性作用,延緩AD病程發展,緩解臨床癥狀。在課題組前期的實驗工作中,我們觀察到電針百會、涌泉可降低4月齡、7月齡、10月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬Ab總量,并對血腦屏障Ab轉運相關的低密度脂蛋白相關受體蛋白-1表達水平有一定影響[19-20]。

低密度脂蛋白相關受體蛋白-1(low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP1)是Ab在腦間質液-血腦屏障清除轉運途徑的最相關蛋白[21]。電針是否可能通過提高Ab血腦屏障清除相關受體LRP1表達從而降低腦間質液Ab1-42水平,還需要從腦微環境Ab水平與LRP1表達水平兩個方面進行驗證。但LRP1在機體內的表達豐富多樣,作用復雜[22-23],動物模型亦不成熟,故欲闡明電針降低腦內整體Ab水平機制是否是通過腦間質液-血腦屏障(interstitial fluid-blood brain barrier,ISF-BBB)清除通道發揮作用,首先應驗證電針能否降低腦組織間液Ab水平。

本實驗在前期實驗結果的基礎上,選擇從電針能否降低小鼠腦ISF Ab水平的實驗角度,完善對電針降低腦內整體Ab水平機制是否是通過ISF-BBB清除通道發揮作用的推測驗證。

小鼠腦ISF Ab水平與老年斑的形成與否相聯系,一般而言老年斑形成之后由于其不斷地“吸附”游離淀粉樣蛋白沉積在一起,細胞間液以及腦脊液中Ab水平可見明顯降低[24],故而對腦間質液可溶性Ab1-42水平的干預研究應該選用老年斑還未形成的早期模型小鼠。本研究選用5月齡APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠為研究對象,該鼠6～8月齡產生老年斑[25-26]。課題組對5月齡小鼠的實驗結果顯示,海馬Ab總體水平已有增高而還未產生老年斑,因而是理想的早期干預實驗對象。

本次實驗結果顯示,針刺可降低腦組織間液Ab1-42水平,提示存在電針通過影響腦ISF-BBB轉運途徑功能降低腦內整體Ab水平機制的可能性。實驗選取電針后第6、7、8、9小時4個時間點進行采樣,結果顯示沒有明顯的隨時間變化趨勢,提示電針后第6～9小時間,小鼠腦組織間液Ab1-42水平較為平穩,結合組間比較結果,表明小鼠ISF中Ab水平的變化在最后一次電針干預后6小時之前已經發生,這也可能是3 d電針干預積累的結果。

海馬組織Ab1-42總體水平檢測結果顯示模型小鼠淀粉樣蛋白代謝障礙已存在,然針刺干預對其總體水平調節作用不明顯(＞0.05),推測可能是由于Ab在腦內存在形式的多樣性,導致相較于可溶性Ab單體或寡聚體而言,Ab總體水平的變化不顯著。

本實驗下一步的研究應完善采樣時間的選擇,考慮如何更好地運用時間醫學分析方法。此外,由于探針膜截流分子量的選擇有限,為保證Ab分子順利地通過而選擇了10 kd的探針型號,導致采集的ISF樣品中可能包含Ab單體以及一部分寡聚體,為細化電針調節的病理因素對象,在之后的研究中,應該設計區分Ab單體及寡聚體的測量方法,完善理論的探究。以及需要相關指標檢測排除其他可能影響Ab水平的因素,比如產生通路等。期望以更完善的實驗設計闡明電針早期干預對AD治療的重要性及可行性。

[1] Gregory JL, Prada CM, Fine SJ,. Reducing available solubleb-amyloid prevents progression of cerebral amyloid angiopathy in transgenic mice[J]., 2012,71(11):1009-1017.

[2] Karran E, Mercken M, De Strooper B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer’s disease: an appraisal for the development of therapeutics[J]., 2011,10(9):698-712.

[3] Tanzi RE, Bertram L. Twenty years of the Alzheimer’s disease amyloid hypothesis: a genetic perspective[J]., 2005,120(4):545-555.

[4] Paxinos G, Franklin KBJ.[M]. 2nd Ed, London: Academic Press, 2011:6.

[5] Dubois B, Feldman HH, Jacova C,. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria[J]., 2014,13(6):614 -629.

[6] 劉郁東,梁直厚,孫圣剛,等.不同濃度b_淀粉樣蛋白寡聚體的毒性差異[J].卒中與神經疾病,2010,17(6): 323-329.

[7] Sambamurti K, Greig NH, Lahiri DK. Advances in the cellular and molecular biology of the beta- amyloid protein in Alzheimer’s disease[J]., 2002,1(1):1-31.

[8] Rosenberg RN. The molecular and genetic basis of AD: the end of the beginning: the 2000 Wartenberg lecture[J]., 2000,54(11):2045-2054.

[9] Turner AJ, Fisk L, Nalivaeva NN. Targeting amyloid- degrading enzymes as therapeutic strategies in neurodegeneration[J]., 2004,1035(1): 1-20.

[10] Banks WA, Kastin AJ. Quantifying carrier-mediated transport of peptides from the brain to the blood[J]., 1989,168:652-660.

[11] Mawuenyega KG, Sigurdson W, Ovod V,. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer’s disease[J]., 2010,330(6012):1774.

[12] Sutcliffe JG, Hedlund PB, Thomas EA,. Peripheral reduction ofb-amyloid is sufficient to reduce brainb-amyloid: implications for Alzheimer’s disease[J]., 2011,89(6):808-814.

[13] Carvey PM, Hendey B, Monahan AJ. The blood-brain barrier in neurodegenerative disease: arhetorical perspec- tive[J]., 2009,111(2):291-314.

[14] Darvesh AS, Carroll RT, Geldenhuys WJ,. In vivo brain microdialysis: advances in neuropsychopharma- cology and drug discovery[J]., 2011,6(2):109-127.

[15] Liu X, Smith BJ, Chen C,. Evaluation of cerebrospinal fluid concentration and plasma free concentration as a surrogate measurement for brain free concentration[J]., 2006,34(9): 1443-1447.

[16] Abbott NJ. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology[J]., 2004,45(4):545-552.

[17] Shen DD, Artru AA, Adkison KK. Principles and applicability of CSF sampling for the assessment of CNS drug delivery and pharmacodynamics[J]., 2004,56(12):1825-1857.

[18] Westerhout J, Ploeger B, Smeets J,. Physiologically based pharmacokinetic modeling to investigate regional brain distribution kinetics in rats[J]., 2012,14 (3):543-553.

[19] 王鑫,加吾拉·阿不力孜,李芙,等.電針對APP/PS1雙轉基因小鼠行為學及皮層Ab1-42、LRP1表達的影響[J].中華中醫藥雜志,2015,30(5):1513-1518.

[20] 李芙,李麗娜,王鑫,等.電針“百會”“涌泉”對APP/PS 1雙轉基因小鼠海馬b淀粉樣蛋白及低密度脂蛋白受體相關蛋白-1水平的影響[J].針刺研究,2015, 40(1):30-34.

[21] Zlokovic BV, Deane R, Sagare AP,. Low-density lipoprotein receptor-related protein-1: a serial clearance homeostatic mechanism controlling Alzheimer’s amyloidb-peptide elimination from the brain[J]., 2010,115(5):1077-1089.

[22] Sagare AP, Deane R, Zlokovic BV. Low-density lipoprotein receptor-related protein 1: a physiological Abhomeostatic mechanism with multiple therapeutic opportunities[J]., 2012,136(1):94- 105.

[23] 步青云,高堂珂,李芙,等.阿爾茨海默病腦內b_淀粉樣蛋白經血-腦屏障清除相關研究概況[J].中國腦血管病雜志,2014,11(12):663-668.

[24] Hong S, Quintero-Monzon O, Ostaszewski BL,. Dynamic analysis of amyloidb-protein in behaving mice reveals opposing changes in ISF versus parenchymal Abduring age-related plaque formation[J]., 2011,31(44):15861-15869.

[25] Kim JH, Choi KH, Jang YJ,. Electroacupuncture acutely improves cerebral blood flow and attenuates moderate ischemic injury via an endothelial mechanism in mice[J]., 2013,8(2): e56736.

[26] 唐銀杉,李志剛,陳萬順,等.音樂電針和脈沖電針對快速老齡化SAMP8小鼠行為學和血清Ab蛋白的影響[J].中醫藥學報,2014,42(1):87-90.

Effect of Electroacupuncture on Hippocampal Tissue and Interstitial Fluid Soluble Ab1-42 Levels in 5-month-old APP/PS1 Transgenic Mice

100029,

Objective To investigate the intervening effect of electroacupuncture on brain interstitial fluid (ISF) and hippocampal soluble Ab1-42levels in mice with early Alzheimer's disease. Method Sixteen 5-month-old male APP/PS1 positive transgenic mice were randomized to model and acupuncture groups, 8 mice each in one cage. Isosexual negative transgenic mice constituted a normal control group. Electroacupuncture at Baihui(GV20) and Yongquan(KI1) or binding under the same condition was used as an intervention measure. Mouse hippocampal interstitial fluid was obtained by brain microdialysis. Hippocampal tissue and ISFbamyloid protein 1-42 levels were measured by ELISA in the three groups of mice at 6, 7, 8 and 9 hrs after intervention to observe the changes. Result Hippocampal tissue and ISF soluble Ab1-42levels were significantly higher in the model group than in the normal group (＜0.01). ISF soluble Ab1-42levels were significantly lower in the acupuncture group of mice than in the model group (＜0.05) and there were no statistically significant differences in hippocampal Ab1-42levels between the two groups (＞0.05). The results of sample detection did not show a tendency to change over time (＞0.05). Conclusion Electroacupuncture can decrease hippocampal soluble Ab1-42levels in a mouse model of AD.

Alzheimer's disease; Electroacupuncture; Early intervention; Brain interstitial fluid; Microdialysis; Mice

1005-0957(2017)06-0744-07

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.06.0744

2016-12-20

國家自然科學基金項目(81273826);北京中醫藥大學自主選題項目(2015-JYB-XS120)

步青云(1990—),女,2016級碩士生,Email:BuQYun@163.com

薛衛國(1968—),男,副教授,博士,碩士生導師,研究方向為針刺治療阿爾茨海默病機理研究,Email:snowman xue@126.com