急性單核細胞白血病患者分子遺傳學特征分析

劉潔+周民+晁紅穎+姜乃可+盧緒章

【摘要】 目的 綜合檢測急性單核細胞白血?。ˋML-M5）患者DNMT3A、FLT3-ITD、NPM1等基因突變發生情況， 初步探討AML-M5患者的分子遺傳學特征。方法 采用基因組DNA-聚合酶鏈反應（PCR）擴增產物直接測序法檢測NPM1基因12號外顯子、c-KIT基因8、17號外顯子、DNMT3A熱點突變、CEBPA全部編碼區及FLT3基因14、15號外顯子中ITD的突變發生情況；熒光原位雜交（FISH）檢測MLL重排發生情況；多重PCR檢測29種常見白血病融合基因發生情況。結果 ①82例患者異常核型檢出率為37.80%（31/82）， 其中涉及11q23者占48.39%（15/31）。15例11q23異?；颊呓汧ISH檢測均發現MLL重排陽性， 該組患者平均年齡47.1歲， 平均外周白細胞水平59.03×109/L， 經常規化療方案誘導后完全緩解（CR）率40.00%（6/15）。其他異常核型占51.61%（16/31）， 平均年齡32.3歲， 平均外周白細胞水平13.41×109/L， CR率為56.25%（9/16）。正常核型51例， 平均年齡43.3歲， 平均外周白細胞水平42.74×109/L， CR率為76.47%（39/51）。不管何種染色體核型異常CR率比較差異無統計學意義（P>0.05）， 正常核型患者CR率高于11q23異?；颊撸≒<0.05）。②70例進行基因突變檢測的AML-M5患者中， 48.57%的患者具有一種及以上基因突變， 依次為FLT3-ITD（30.00%）、DNMT3A（24.29%）、NPM1（17.14%）、CEBPA（8.57%）、c-KIT（1.43%）。③正常核型中基因突變比例明顯高于11q23重排患者， 差異具有統計學意義（P<0.05）， 不同基因突變發生年齡、性別及CR率有一定的差異。結論 11q23是AML-M5患者最為常見的染色體核型異常， 伴此種異常者預后不良?；蛲蛔兊目偘l生率48.75%， 以FLT3-ITD突變多見， 而CEBPA、c-KIT基因突變則是AML-M5中較少見的基因異常， 突變在正常核型患者中常見， 其與臨床特點及療效有一定的相關性。

【關鍵詞】 急性單核細胞白血??；突變基因；核型

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.36.002

【Abstract】 Objective To comprehensively detect gene mutation of DNMT3A， FLT3-ITD and NPM1 in acute monocytic leukemia （AML-M5） patients， for preliminary discussion molecular genetic characteristics in AML-M5 patients. Methods Occurrence of gene mutation in exon 12 of NPM1 gene， exon 8 and exon 17 of c-KIT gene， hot spot mutation of DNMT3A， all coding regions of CEBPA， exon 14 and exon 15 of FLT3 gene were detected by genomic DNA-polymerase chain reaction （PCR） amplification product direct sequencing method. Occurrence of MLL rearrangement was detected by fluorescence in situ hybridization （FISH）， and 29 kinds of common leukemia fusion gene were detected by multiple PCR detection. Results ①82 patients had abnormal karyotype detection rate as 37.80% （31/82）， including 48.39% （15/31） of 11q23 cases. 15 patients with abnormal 11q23 all had detected MLL rearrangement by FISH， with average age as 47.1 years old， mean peripheral white blood cell level as 59.03×109/L， adn complete remission （CR） rate after induction of conventional chemotherapy regimens as 40.00% （6/15）. The other abnormal karyotype accounted for 51.61% （16/31）， wih average age as 32.3 years old， mean peripheral white blood cell level as 13.41×109/L， and CR rate as 56.25% （9/16）. There were 51 normal karyotype cases， with average age as 43.3 years old， mean peripheral white blood cell level as 42.74×109/L， CR rate as 76.47% （39/51）. There was no statistically significant difference in CR rate of all types of abnormal chromosome karyotype （P>0.05）， and the normal karyotype patients had higher CR rate than abnormal 11q23 patients （P<0.05）. ②Among 70 AML-M5 patients received gene mutations detection， 48.57% of patients had one or more than one kind of gene mutations， with FLT3-ITD （30.00%）， DNMT3A （24.29%）， NPM1 （17.14%）， CEBPA （8.57%）， and c-KIT （1.43%） in order. ③Normal karyotype had higher Gene mutation ratio than 11q23 rearrangement patients， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Different mutations had certain differences in age， sex and CR rate. Conclusion 11q23 is most common abnormal chromosome in AML-M5 patients， and always complicated with bad prognosis. Total incidence of gene mutations is 48.75%， of which FLT3-ITD is common， while CEBPA and c-KIT gene mutations are rare genetic abnormality in AML-M5. Mutations are normal in patients with normal karyotype， and it has correlation to clinical features and curative effect.

【Key words】 Acute monocytic leukemia； Mutant gene； Karyotype

急性單核細胞白血?。╝cute monocytic leukemia， AML-M5）是一種特殊類型的急性髓系白血病， 表現為外周血及骨髓原始和幼稚單核細胞增多， 常伴有髓外浸潤及高白細胞， 復發率高， 病程兇險， 3年平均無病生存率低， 臨床預后極差[1]。既往研究表明， 11q23是AML-M5亞型中最常見的的染色體核型異常， 但此類患者的預后仍存在異質性。近年， 隨著高通量DNA測序技術的應用與推廣， 一些熱點基因突變逐漸被證實與患者臨床特點及預后有較大相關性。本研究回顧性研究了近年來收治的82例AML-M5患者的染色體核型、MLL重排及DNMT3A、CEBPA、FLT3-ITD、NPM1、c-KIT等多基因突變與部分臨床參數間的相關性， 初步探討AML-M5患者的分子遺傳學特征及預后價值， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 回顧性分析2006～2016年于常州市第二人民醫院住院的82例AML-M5患者的臨床資料。其中男41例， 女41例， 平均年齡42歲。診斷和療效標準參照《血液病診斷及療效標準》[2]。臨床治療采用常規化療方案。

1. 2 細胞遺傳學分析 染色體標本制備均采用常規方法， 部分采用直接法， 部分則同時采用直接法、24 h短期培養法。核型分析采用R顯帶技術， 平均每例分析中期分裂相20個。核型異常的描述按人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN（2009）[3]。

1. 3 MLL重排及融合基因檢測 參考文獻[4]， 采用FISH雙色探針進行MLL重排檢測；參考文獻[5]， 采用多重PCR檢測29種常見白血病融合基因。

1. 4 基因突變檢測 取患者初診時骨髓單個核細胞1.0×107個， 用DNA抽提試劑盒（美國Gentra公司產品）抽提基因組DNA， 根據吸光度（A）260確定DNA產物濃度， 用DNA稀釋液將基因組DNA樣品稀釋至50 ng/μl。參照文獻[6]， 采用基因組DNA-PCR及瓊脂糖電泳方法檢測所有患者FLT3基因外顯子14、15中ITD突變及20號外顯子TKD突變， 陽性標本進一步測序證實；參照文獻[7， 8]， 分別擴增NPM1基因第12號外顯子、DNMT3A熱點突變及c-KIT基因8號和17號外顯子， 擴增產物進行直接測序；參照文獻[9]， 采用PCR分段擴增CEBPA編碼區后進行直接測序。測序由南京GenScrip有限公司完成， 結果與正常序列比對， 檢出突變。

1. 5 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件處理數據。計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 染色體核型、MLL重排與部分臨床參數間的相關性分析 82例患者異常核型檢出率為37.80%（31/82）， 其中涉及11q23者占48.39%（15/31）。15例11q23異?；颊呓汧ISH檢測均發現MLL重排陽性， 該組患者平均年齡47.1歲， 平均外周白細胞水平59.03×109/L， 經常規化療方案誘導后完CR率40.00%（6/15）。見表1。其他異常核型占51.61%（16/31）， 平均年齡32.3歲， 平均外周白細胞水平13.41×109/L， CR率為56.25%（9/16）， 其中1例伴Ph+染色體， 初次誘導治療未達緩解， 最終死于重癥感染， 另見1例t（8；16）（p11；p13）患者， 該患者有乳腺癌病史， 曾反復化療， 考慮繼發性急性單核細胞白血病， 兩次誘導均未達緩解， 最終死于顱內出血， 總體生存時間僅2個月。正常核型51例， 平均年齡43.3歲， 平均外周白細胞水平42.74×109/L， CR率為76.47%（39/51）。不管何種染色體核型異常CR率比較差異無統計學意義（P>0.05）， 正常核型患者CR率高于11q23異?；颊撸≒<0.05）。

2. 2 多重PCR檢測及DNMT3A、CEBPA、FLT3-ITD、NPM1、c-KIT基因突變分析 82例患者中75例進行了多重PCR檢測， 異常檢出率為32.00%（24/75）， 伴MLL重排患者21例， 發生率28.00%（21/75）， 另有1例檢測到BCR/ABL融合基因。70例患者進行了基因突變檢測， 總的突變發生率為48.57%（34/70）。其中， 15例伴有11q23/MLL重排者， 突變檢出率為13.33%（2/15）；16例其他異常核型患者突變發生率為43.75%（7/16）；51例正常核型者突變檢出陽性病例25例（49.02%）。正常核型患者基因突變發生率明顯高于11q23重排患者（P<0.05）。突變發生率依次為FLT3-ITD（30.00%）、DNMT3A（24.29%）、NPM1（17.14%）、CEBPA（8.57%）、c-KIT（1.43%）。FLT3-ITD突變主要發生于正常核型組， 在首次化療后獲得完全緩解者10例。17例患者檢出DNMT3A突變， 其中3例同時合并FLT3突變， 4例與NPM1突變共存， 4例同時具有DNMT3A、FLT3、NPM1突變。DNMT3A突變陽性患者染色體核型以正常核型為主（94.12%）， 1例為單體核型， 所有11q23/MLL重排患者中均未檢測到DNMT3A突變。12例患者檢出NPM1突變陽性， 合并FLT3突變陽性者6例， 染色體核型均為正常核型， 其中9例患者早首次誘導化療后獲得完全緩解。6例患者具有CEBPA突變陽性， 正常核型伴CEBPA突變者4例， 1例為Ph+核型， 1例同時合并NPM1、DNMT3A突變陽性， 3例同時合并FLT3突變陽性。其中4例患者在首次誘導化療后獲得完全緩解。僅1例患者檢測到c-KIT突變。見表2。

3 討論

3. 1 細胞遺傳學 細胞遺傳學異常是決定AML患者臨床特點和預后的重要指標之一。國外報道M5患者染色體核型異常率為48.8%～71.2%， 本組結果顯示有染色體核型異常者占37.80%（31/82）， 與報道相近。11q23異常導致MLL基因發生重排， 在M5中的發生率較高， 有該核型異常的惡性血液病完全緩解率低， 生存期短[10]。本組所有發生核型異常的患者與11q23相關的為48.39%（15/31）， 國外文獻報道80% 11q23異常的病例為M5， 進一步證實了這一點。本組伴11q23異常的完全緩解率40.00%（6/15）， 低于所有患者的平均緩解率65.85%（54/82）。經統計學分析伴11q23缺失的患者CR率與核型正?；颊弑容^差異有統計學意義（P<0.05）， 進一步驗證了伴11q23異常的患者預后較差。伴t（8；16）（p11；p13）易位的AML是一種非常罕見的白血病亞型， 發生率<1%， 總結國外文獻發現[11， 12]， 此類患者主要表現為急性粒-單核細胞白血?。ˋML-M4）或M5， 女性多見， 平均年齡約60歲， 大部分患者繼發于單一實體腫瘤（57%）， 其中以乳腺癌最多見， 常規化療往往無效， 生存期短， 預后極差。與國外報道一致， 本組研究中發現1例該核型異常， 繼發于乳腺癌， 為61歲中老年女性， 兩次誘導均未達緩解， 最終死于顱內出血， 總體生存時間僅2個月。Ph染色體和BCR-ABL融合基因是CML患者的特征性異常， 既往文獻報道也出現在0.9%～3.0% AML患者中[13]， 本組研究中發現1例Ph+患者， 占1.22%， 與之前的報道相仿。Ph+AML緩解率低， 預后差， 生存期短， 治療上尚無統一的方案， 目前認為化療聯合TKI， 并在CR后盡早行allo-HSCT是改善患者生存的唯一有效途徑[14]。本組研究中該患者初次常規方案誘導未緩解， 最終死于重癥感染， 需要更多樣本、多中心的研究來進一步驗證。

3. 2 分子生物學 AML的起病、發展及預后除了與染色體核型異常有關外， 還與一些基因突變有關， 如FLT3、NPM1、CEBPA等， 近年來發現越來越多的基因與預后具有相關性， 并將其應用到白血病的發病機制中。

NPM1和FLT3-ITD突變是AML患者中最常見的基因異常， 國內外學者研究結果[15-17]發現FLT3-ITD和NPM1在AML的發生率分別為20%～35%和1/3， 以M5多見， 正常核型中表達較高， 其中NPM1在女性患者中多見， 且FLT3-ITD突變和AML患者的較差的預后相關而NPM1突變通常與更好的預后相關。本研究檢測到的FLT3和NPM1突變率為30.00%和17.14%， 核型均以正常核型多見， NMP1突變女性患者占66.67%（8/12）， 與國內外報道一致。FLT3突變和NPM1突變患者初始誘導治療后CR率比較差異無統計學意義（P>0.05）， 因未作總體生存率（OS）和無病生存率（DFS）統計， 提示預后依據不足。

關于c-KIT， 其在AML中則有較高的表達， 陽性率在23%～87%[18]， 本組研究僅檢測到1例c-KIT突變， 遠低于文獻報道的范圍， 但多數研究認為c-KIT表達以M5最低， 支持本次的結果。CEBPA突變則主要集中在正常核型的AML患者中， 多集中在M1、M2型， 本次檢測到CEBPA總突變率8.57%（6/70）， 在正常核型中的突變率為7.84%（4/51）， 低于國內相關的報道， 但與國外大宗研究報道相近[19-21]。值得注意的是， 國外的研究顯示CEBPA突變患者具有較高的OS和DFS， 作者同樣發現其具有較高的CR率（66.67%）， 但由于隨訪時間短以及部分失訪， 未作OS和DFS統計。

AML患者中DNMT3A突變頻率高于任何一種其他血液系統疾病， 而AML患者中又以M5頻率最高， 在本研究中， 共發現17例DNMT3A突變患者， 突變頻率24.29%， 與此前學者的研究結果相近。DNMT3A還與高齡、高白細胞、NPM1突變、FLT3突變及IHDI/2突變密切相關[22-25]。同時Ribeiro等[20]研究證實DNMT3A突變可作為提示AML患者預后不良的危險因素。但本次研究發現伴DNMT3A突變者初次誘導緩解后CR率達70.59%， 與未突變組相比CR率無明顯差異， 反而較FLT3突變組CR率高。

本研究回顧性分析了AML-M5患者細胞遺傳學及分子生物學特征， 其與臨床特點及療效有一定的相關性?；蛲蛔冊诎籽“ˋML-M5發生過程中起著重要作用， 需進一步研究和證實及尋找具有預后意義的基因， 從而制定更詳細的危險分層及治療方案， 進一步改善患者預后及生存。

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