福建古田紅曲生產用紅曲霉菌主要種類的鑒別

李志強，劉穎，林風，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福建 福州，350007)

福建古田紅曲生產用紅曲霉菌主要種類的鑒別

李志強，劉穎，林風*，吳麗云*

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福建 福州，350007)

以購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)的5株紅曲霉菌為對照，對福建省微生物研究所紅曲霉菌資源庫中收藏自福建省古田縣的60株紅曲霉菌(Monascussp.)進行分類鑒定研究。首先根據不同菌株在麥芽汁瓊脂(Wa)、察氏酵母提取物瓊脂(CYA)和甘油硝酸鹽瓊脂(G25N)培養基上的菌落形態特征進行初步分類，進而基于核糖體DNA內轉錄間隔區(rDNA internal transcribed spacer，rDNA ITS)、核糖體大亞基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene，LSU)和核糖體小亞基(18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene, SSU)的基因片段的測序結果，在GenBank中通過BLAST進行分子生物學方面的鑒定研究，并用ITS序列構建系統發育樹。通過形態特征及3個基因序列的比對，認為所選取的60株古田紅曲霉菌分別歸屬紅色紅曲霉菌(M.ruber)、叢毛紅曲霉菌(M.pilosus)或紫色紅曲霉菌(M.purpureus)3個種。

紅曲霉菌；ITS；LSU；SSU；鑒定

紅曲霉菌(Monascussp.)為絲狀真菌，可用于生產安全的天然色素和食品添加劑[1]。紅曲霉菌最有名的產品當屬紅曲(紅曲霉菌發酵過的大米)，在東亞和東南亞國家被廣泛用作食品著色劑、魚肉防腐劑、醋酒發酵劑以及心血管病治療藥[1]。近20多年的研究發現紅曲霉菌在代謝中可產生多種次級代謝產物，包括色素、莫納可林、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、多不飽和脂肪酸、黃酮等多個種類的生物活性物質，具有降血脂、降血壓、降血糖、抑菌、抗癌和提高免疫力等多種功效[2-3]?，F階段市售的血脂康和脂必妥中的主要成份即來源于紅曲。紅曲的產地主要分布在我國福建、浙江、廣東、臺灣等地，其中福建的古田紅曲最為著名[4]。

我國對制作紅曲所用紅曲霉菌的研究于1960年代開始。經過10多年的研究，中國科學院和福建省的相關學者應用傳統的微生物分類方法，從紅曲產品中發現并鑒定了9個不同的紅曲霉菌種類，并從以古田紅曲為主來源的150多個生產菌株中選出11株[分別歸屬紅曲紅曲霉菌(Monascusanka)和變紅紅曲霉菌(Monascusserorubescens)]，推向全國用于色素和黃酒的生產[5]。半個世紀以來，古田紅曲生產工藝不斷得以改進、生產菌種性狀不斷得以改良、產品類型和質量標準不斷得以提升，但生產中使用的紅曲霉菌的主要種類是否發生變化，至今未見相關的研究報道。

由于傳統分類方法的不足，致使紅曲霉菌屬種間的分類和命名尚有交叉、存在爭議，在一定程度上制約了紅曲霉菌的深入研究及更好應用。DNA條形碼(DNA barcoding)技術作為一種新興的物種鑒定方法，以其靈敏、精確、方便和客觀的優勢，在動植物和真菌中已經得到廣泛應用[6]。SCHOCH等提出核糖體DNA內轉錄間隔區(rDNA internal transcribed spacer，rDNA ITS)可作為真菌界通用的DNA條形碼，以利于真菌分類學和生物多樣性的研究[7]。如今，大部分實驗室都采用ITS作為分子標記進行紅曲霉菌的分類鑒定，國內一些學者也已將ITS序列分析用于紅曲霉菌的分類鑒定[8-11]。rDNA ITS一般包含兩個部分：ITS1和ITS2，5.8S RNA 基因也被包括在ITS之內[6]。但ITS序列較短(真菌的ITS長度一般為650-750 bp)[6]，有時不同種紅曲霉菌的ITS序列完全一樣[8]，說明在紅曲霉菌的分子鑒定中僅僅采用ITS還不能完全滿足需要，還需聯合其他的分子標記。核糖體大亞基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene，LSU)和核糖體小亞基(18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene, SSU)也常被用于真菌的系統發育分析和分子鑒定，并且LSU在一些真菌類群中具有良好的種間區分能力[7]。

本研究從福建省微生物研究所的紅曲霉菌種資源庫中選取收藏自福建省古田縣的60株紅曲生產用紅曲霉菌，在傳統的形態分類基礎上，輔以ITS、LSU和SSU基因作為分子標記來進行菌種鑒定，以期闡明現有古田紅曲產品中紅曲霉菌的主要種類。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本所紅曲霉菌資源庫中古田紅曲生產用菌株60株(其中40株為原古田紅曲廠的生產菌株，20株分離自古田的色曲和酒曲產品)，給予編號M1-M60。前期的研究表明，這些菌株分別具有生產色曲、酒曲和功能紅曲的優越特性。購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)的5株紅曲霉菌，即CICC5018(M.ruber)、CICC5032(M.purpureus)、CICC5034(M.anka)、CICC5044(M.purpureus)和CICC5045(M.pilosus)(分別給予編號M61、M62、M63、M64和M65)，作為本研究對照菌株。

1.2 固體培養基配制及菌落形態觀察

麥芽汁瓊脂培養基(Wa)：麥芽汁(15°Bx)1 000 mL，瓊脂15g。1.0×105kPa 滅菌30 min。

察氏酵母提取物瓊脂培養基(CYA)：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KC1 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母提取物5.0 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL。1.0×105kPa 滅菌30 min。

甘油硝酸鹽瓊脂(G25N)：CYA加25% (質量分數)甘油。1.0×105kPa 滅菌30 min。

采用點接種法接種斜面保藏的菌種于Wa、CYA和G25N培養基上，于25 ℃培養7 d后進行菌落形態觀察，包括菌落大小、顏色等[10]。

1.3 菌株的液體培養

液體培養基配制(g/L)：葡萄糖50、蛋白胨15、KH2PO41、NaNO33、酵母粉10、MgSO40.5。加熱完全溶化后進行分裝，1.0×105kPa 滅菌30 min，冷卻備用。

用扁鏟從PDA培養基上刮取黃豆大小的紅曲霉菌，接入裝有新配置液體培養基的三角瓶，置于28℃恒溫下培養72h左右，收集菌絲體用于DNA提取。

1.4 DNA提取、PCR擴增和測序

采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取流程按照產品說明書進行。

ITS采用引物ITS5 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS4 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)進行擴增；LSU采用LR0R(5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’)和LR5(5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’) 進行擴增；SSU采用NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS4(5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’)進行擴增[7]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基因擴增采用50 μL反應體系： 10×PCR反應緩沖液 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 3 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.75 μL，10 mmol/L的正向引物和反向引物各1 μL，Taq聚合酶(2U/μL) 0.5μL，DNA模板2 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52℃(LSU退火溫度為48 ℃)退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個循環；72 ℃終末延伸10 min，10 ℃保持。每次反應均設立不含DNA模板的空白對照組。擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后, 用OMEGA凝膠回收試劑盒(OMEGA Bio-Tek)回收目的片段。純化產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.5 紅曲霉菌的分子生物學鑒定

測序后的基因序列用BioEdit進行拼接，獲得所擴增基因的完整序列；采用Clustal X[12]軟件對DNA序列進行排序，參數值為默認值，并對排序結果進行手工校正，將5’和3’端的非對位排列區去除。采用ITS序列數據(因為65株紅曲霉菌之間的ITS序列差異大于LSU和SSU，見結果與分析)，用MEGA6軟件[13]基于Kimura 雙參數模型的鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)構建系統發育樹，分析進化關系，自展1000次估計各分支的支持率。從GenBank下載的紅曲霉菌屬物種的ITS序列為AY498573、AY498574、AY498581、AY498583- AY498586、JF922045和JF922046；以曲霉屬的黃曲霉(Aspergillusflavus，DQ683124)、寄生曲霉(A.parasiticus，EF661568)和煙曲霉(A.fumigatus，HQ026746)的3個物種作為外類群。

將所測得的ITS、LSU和SSU序列在GenBank中進行BLAST比對。用MEGA6[13]軟件計算GC含量、基于Kimura 雙參數模型計算遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 菌落的形態特征

紅曲霉菌在Wa、CYA和G25N培養基上的菌落形態特征在紅曲霉菌的分類和鑒定中具有重要的參考價值。本研究發現65株紅曲霉菌在相同的培養條件下其菌落形態特征存在差異，在Wa培養基上的菌落形態特征最穩定[10,14]。因此，以Wa培養基上65株紅曲霉菌的菌落形態特征作為主要分類鑒定依據，以在另2種培養基上的菌落形態特征作為輔助鑒定依據。形態鑒定結果見表1。

表1 65株紅曲霉菌基于菌落形態特征的鑒定結果

根據形態特征，初步可將61株紅曲霉菌分別歸于紅色紅曲霉菌、紫色紅曲霉菌或叢毛紅曲霉菌，其中9株為紅色紅曲霉菌，38株為紫色紅曲霉菌，14株為叢毛紅曲霉菌。其余4株依據形態特征無法鑒定到種，需輔以分子生物學方法加以鑒定。

2.2 紅曲霉菌的分子生物學鑒定

本研究測定了65株紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU基因序列，經過排序后的長度分別為581 bp、879 bp和1021 bp，可變位點數分別為2個、1個和1個，簡約信息位點數分別為2個、1個和1個。利用本研究獲得的ITS基因序列和從GenBank下載的紅曲霉菌屬和曲霉屬物種的ITS序列構建分子系統發育樹?；贙imura 雙參數模型進行1 000次自展檢驗構建的50% 多數一致性NJ樹見圖1。從圖1可以看出，M2、M4、M5、M12-M31、M34-M49、M62-M64與紫色紅曲霉菌聚為一支，支持率為81%；M1、M3、M6-M11、M32、M33、M50-M61、M65與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌聚為一支，支持率為86%。

圖1 利用ITS序列基于Kimura 雙參數模型構建的50%多數一致性NJ系統發育樹Fig.1 50% majority-rule consensus tree resulted from analysis of the ITS sequence data using the Kimura two-parameter model

進一步的序列分析表明，M1、M3、M6- M11、M32、M33、M50-M61、M65的ITS、LSU和SSU基因序列分別相同(組1)，而本研究中其余42株紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU基因序列分別相同(組2)。BLAST結果顯示，組1菌株的ITS與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的ITS同一性為100%， LSU與紅色紅曲霉菌的LSU同一性為100%，SSU與叢毛紅曲霉菌和煙色紅曲霉菌(M.fuliginosus)的SSU同一性為100%(表2)。由于煙色紅曲霉菌在Wa培養基上7天菌落直徑為65 mm[14]；而組1紅曲霉菌株在Wa培養基上的菌落直徑為40～45 mm，因此組1所包含的菌株不應為煙色紅曲霉菌，而應為紅色紅曲霉菌或叢毛紅曲霉菌。組2菌株的ITS、LSU及SSU分別與紫色紅曲霉菌的ITS、LSU及SSU的同一性均為100%(表2)。

65株紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU序列的平均遺傳距離分別為0.0017、0.0005和0.0004。據形態特征鑒定為紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU的遺傳距離均為0。組1紅曲霉菌和組2紅曲霉菌的ITS、LSU和SSU的遺傳距離分別為0.0037、0.0011和0.0010。

綜上結果表明：(1)本所保存的M1、M6、M7、M8、M9、M10、M50、M58為紅色紅曲霉菌，M2、M4、M5、M15- M31、M34-M38、M40-M49為紫色紅曲霉菌，M3、M11、M32、M33、M51、M52、M53-M56、M57、M59為叢毛紅曲霉菌。以上56株紅曲霉菌形態鑒定結果和分子生物學鑒定結果一致。(2)結合基因序列數據后，通過形態數據無法鑒定到種的4株紅曲霉菌(M12-M14、M39)均被鑒定為紫色紅曲霉菌。(3)從CICC購買的5株紅曲霉菌中，4株(M61、M62、M64和M65)的鑒定結果與原分類吻合，只是原歸類紅色紅曲霉菌的M63的形態學特征和3個基因序列的信息與紫色紅曲霉菌的一致。

本研究用的60株古田紅曲是當今生產廣泛使用的紅曲霉菌，經鑒定，分別為紅色紅曲霉菌、紫色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌。該結果與“工業化應用的紅曲菌株多為紅色紅曲霉菌、叢毛紅曲霉菌和紫色紅曲霉菌”[2]實際情況相符。

3 討論

紅曲霉菌屬中種的分類鑒定至今國際上仍未能形成統一的標準，對某些獨立的種，仍有異議[14-15,20]；但現階段，部分研究者認為紅曲霉菌屬包含9種紅曲霉菌[16]。目前紅曲霉菌的鑒定主要依賴傳統的形態學方法[14]，并輔以生理生化的鑒定方法[10,17-18]。傳統的形態和生理生化方法鑒定紅曲霉菌是一種重要的方法，但耗時耗力；由于菌落顏色、直徑和形狀易受培養條件的影響，導致結果不穩定。因此紅曲霉菌的鑒定需引入其他方法進行菌種鑒定。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術作為一新興的物種鑒定方法在紅曲霉菌中也逐漸得到應用。郭芳和李鐘慶對白色紅曲霉菌、火紅色紅曲霉菌、煙灰色紅曲霉菌和橙色紅曲霉菌ITS序列進行了研究，測序結果顯示，橙色紅曲霉菌與火紅色紅曲霉菌相同，而白色紅曲霉菌與煙灰色紅曲霉菌相同，這兩組序列僅有2個堿基不同[8]。Lv 等從不同的紅曲酒發酵劑中分離出5株紅曲霉菌，ITS序列長度均為581 bp，這5株紅曲霉菌與紫色紅曲霉菌的ITS序列同一性均為100%[9]。楊成龍等以不同來源的41個紅曲霉菌為材料，結合ITS序列分析、形態特征及生理生化特征，最終將41株紅曲霉菌鑒定為紫色紅曲霉菌、叢毛紅曲霉菌、橙色紅曲霉菌、紅色紅曲霉菌、煙灰色紅曲霉菌和白色紅曲霉菌六大類[10]。劉穎等分離出一株功能紅曲霉菌菌株NW3-2，其ITS序列與叢毛紅曲霉菌、發白紅曲霉菌、紅色紅曲霉菌都只相差1個堿基，與紫色紅曲霉菌和橙色紅曲霉菌相差2個堿基[11]。Park等首先通過紅曲霉菌LSU的D1/D2序列比較闡述了紅曲霉菌的系統發育關系[19]。雖然以上研究對不同種的紅曲霉菌進行了一定程度的區分，但單獨靠一種手段很難將一些特殊的紅曲霉菌準確鑒定到具體的種，因此需綜合形態學和分子生物學的鑒定手段，相互驗證，以獲得更加可靠的分析結果。本研究中就有4株僅依據形態特征無法鑒定到種的菌株，結合基因序列數據后鑒定到種。

本研究表明紫色紅曲霉菌(CICC5032和CICC5044)和紅色紅曲霉菌(CICC5034) 的形態特征非常接近，在所選的3個分子標記上均沒有差異；Park和Jong的研究也表明這兩種紅曲霉菌在LSU的D1/D2區域完全相同[19]，這兩種紅曲霉菌的形態特征也非常相似，因此我們支持Hawksworth和Pitt的觀點：M.anka是M.purpureus的同種異名[20]。此外，Hawksworth和Pitt觀點，以及Park和Jong的研究結果，都認為M.serorubescens與M.pilosus是同種異名[19-20]。因此，本研究鑒定出的現今古田紅曲生產用的主要紅曲霉菌種類與中國科學院1970年代推廣的11株紅曲霉菌主要種類(M.anka和M.serorubescens)大體相符，只是現在用的紅曲霉菌中紅色紅曲霉菌(M.ruber)的比例明顯提高。

表2 65株紅曲霉菌株ITS、LSU和SSU基因序列的GC含量及BLAST結果

國外學者的研究表明紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的LSU的D1/D2區域完全相同[19]，ITS和β-tubulin的序列也完全相同[15]。本研究中經形態學初步鑒定為紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌菌株的ITS、LSU和SSU也完全相同。由于紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌在形態特征上具有較明顯的差異[19-20]，因此大部分學者認為M.ruber和M.pilosus為兩個不同的種。由于這兩個種在ITS、LSU、SSU和β-tubulin均沒有表現出差異，說明這兩個種的親緣關系非常近，要區分它們，還需借助其他的分子標記才行。本研究在紫色紅曲霉菌與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的鑒別中，還參考了這些菌株的β-tubulin基因的分析結果(具體數據另文發表)。

ITS是在真菌的分子鑒定中應用最廣泛的一個分子標記，2012年時GenBank約有172000條真菌的ITS序列，其中56%的ITS序列具有拉丁名[7]。本研究中紫色紅曲霉菌與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的遺傳距離為0.0037，65條ITS序列的平均遺傳距離為0.0017，表明這些菌株的親緣關系很近。在楊成龍等人的研究中，41株紅曲霉菌ITS序列間的平均遺傳距離為0.0052[10]，也是很小的。紫色紅曲霉菌與紅色紅曲霉菌和叢毛紅曲霉菌的ITS可變位點有2個：1個可變位點位于ITS1，另一個可變位點位于ITS2。ITS1和ITS2均為非編碼區域，中度保守，其保守性基本上表現為種內相對一致，種間具有差異，這也與本研究的結果有較好的一致性。而本研究采用的LSU和SSU，雖然獲得的序列長度比ITS長，但變異位點數目均只有1個，少于ITS的2個。這或許與LSU和SSU在蛋白質合成中具有重要的功能有關，其基因序列及二級結構高度保守。

本研究涉及的60株紅曲霉菌可謂是福建省古田縣當今紅曲生產中應用的主要紅曲霉菌株，具有廣泛的代表性。古田紅曲產品中是否還含有紅曲霉菌的其他種，我們將繼續收集樣品進行深入、全面的研究。

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Identification of majorMonascussp. involved in industrial production of Gutian Hongqu

LI Zhi-qiang, LIU Ying, LIN Feng*, WU Li-yun*

(Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products, Fujian Institute of Microbiology, Fuzhou 350007，China)

To characterize and classify major industrial strains ofMonascussp. originated from Gutian Hongqu, we compared 60 strains selected from our institute’s biobank with 5 strains obtained from China Center of Industrial Culture Collection (CICC). The first classification criterion was based upon their colonial morphological characteristics on Wa，CYA and G25N media. Further characterization was performed by comparing the sequences of rDNA internal transcribed spacer (ITS), 28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene (LSU), and 18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene (SSU) of the strains with available sequences in GenBank by BLAST. Neighbor-Joining (NJ) tree was constructed according to the ITS sequences. Based upon the morphological characteristics and the nucleotide sequences comparison, the 60Monascussp. strains were classified asM.ruber,M.pilosusorM.purpureus.

Monascus; rDNA internal transcribed spacer (ITS); 28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene (LSU); 18S nuclear ribosomal small subunit rRNA gene (SSU); identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705011

博士，助理研究員(林風副研究員和吳麗云教授級高級工程師為通訊作者，E-mail：life8810@aliyun.com；lywu66717@163.com)。

福建省公益類科研院所專項(2015R1009-4)；福建省財政廳省直教育科研專項(閩財指[2015]1297號)；福建省公益類科研院所專項(2014R1009-6)；福州市倉山區科技創新公共服務平臺項目(2015K03)；福州市倉山區科技計劃項目(2015S05)

2016-10-24，改回日期：2017-02-13