雞IL—18和IFN—γ協同抗病毒機制分析

李曉婷++宋佰芬++王歆桐++王夢瑤++余崴++馬金柱++于立權++崔玉東

摘 要：禽病毒性疾病如禽傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD）一直困擾著養禽業的健康、快速發展。在其他抗病毒感染的藥物效果不理想時，有必要應用細胞因子制劑來改善機體免疫并提高抗病毒能力。已證明，雞白細胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）和雞干擾素γ（Chicken interferon，ChIFN-γ）對多種病毒感染具有抑制作用。為了研究新型細胞因子制劑，該實驗分析了雞白細胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）和雞干擾素γ（Chicken interferon，ChIFN-γ）以及二者混合后的抗病毒機制。ChIL-18和ChIFN-γ蛋白注射雛雞后7d內，應用試劑盒檢測雛雞體內血清中細胞因子的變化情況。利用雞外周血單核細胞分析ChIL-18和ChIFN-γ對細胞內NO、幾種Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）及下游信號通路的影響。實驗結果表明，混合組蛋白可刺激雛雞血清中產生高水平IL-6，IL-12，及IL-17?；旌辖M蛋白可以誘導巨噬細胞中NO的分泌水平顯著升高，TLR 2、TLR 3、TLR 4和MHC-II的表達量升高，MAPK和NFκB信號通路被激活。綜上結果表明，ChIL-18和ChIFN-γ以及二者協同可誘導機體對病毒感染產生有效的防御作用，為新型細胞因子制劑的研究提供參考。

關鍵詞：雞白細胞介素18；雞干擾素γ；抗病毒；免疫調節

中圖分類號 S855.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）11-0040-07

Synergistic Antiviral Mechanism of Chicken IL-18 and IFN-γ

Li Xiaoting1 et al.

（1College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：The healthy and rapid development of poultry industry was troubled by avian viral diseases such as Infectious Bursal Disease（IBD）. With other anti-viral drug effect is not ideal，it is necessary to use cytokine preparations to improve the immune system and improve the anti-virus ability. Chicken interleukin-18 （ChIL-18）and chicken interferon gamma（ChIFN-γ）have been shown to inhibit a variety of viral infections. In order to study the novel cytokine preparations，the effects of ChIL-18 and ChIFN-γ and the two mixed antiviral mechanism was analyzed. The results of this laboratory had showed that ChIL-18 and ChIFN-γ can inhibit IBDV proliferation in chickens，especially with the mixed group，which indicates that the mixed group has better antiviral effect. Within 7 days after ChIL-18 and ChIFN-γ injection of chickens，the kit was used to detect the changes of cytokines in the chicks. The effects of ChIL-18 and ChIFN-γ on intracellular NO，several Toll-like receptors （TLR）and downstream signaling pathways were analyzed by using peripheral blood mononuclear cells of chickens. The results showed that the levels of IL-6，IL-12 and IL-17 in the serum stimulated by mixed group ware significantly different from those in the PBS group. Mixed group proteins could induce NO production，the expression levels of TLR2，TLR3，TLR4 and MHC-II were increased and MAPK and NFκB signaling were activated. These results indicated that the mixed group had a better theoretical basis for antiviral ability，ChIL-18 and ChIFN-γ，both of which could induce the body to produce effective defense against virus infection and provide reference for the study of new cytokine preparations.

Key words：Chicken interleukin 18；Chicken interferon γ；Antiviral；Immunoregulation

1957年，Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒的干擾現象時發現了一種與病毒干擾作用有關的活性物質，命名為干擾素（interferon，INF）[1]。1958年Nagano和KoJima報道了同樣的發現[2]，這也是第一個純化到同質，克隆，測序完全的細胞因子，并以重組的形式生產并被廣泛的應用于臨床[3]。IFN應答在對病毒的先天免疫中起重要作用[4-5]。病毒入侵誘導許多細胞類型產生IFN，并且IFN作用于鄰近的健康細胞以防止進一步的病毒感染。IFN-γ是唯一的Ⅱ型干擾素，又被稱為免疫型IFN[6]，主要由活化的T、B淋巴細胞和自然殺傷（Natural killer，NK）細胞產生，是緊密參與先天和獲得性免疫應答的促炎性細胞因子[7]。IFN-γ可以有效的刺激NK細胞和巨噬細胞活化[8]，激活抗微生物和抗原呈遞功能，在抗胞內病原體的宿主防御中起關鍵作用[9]。發生免疫應答時，IFN-γ的循環擴增可以快速警告相鄰細胞以及先天免疫系統的效應細胞對抗可能的感染。IFN-γ可以廣泛的影響細胞程序[10]，也可以引起細胞表面Ⅰ類和Ⅱ類主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）分子的表達增加[11]。IFN-γ具有較為嚴格的種屬特異性。

IL-18在1989年首次在小鼠腹腔內注射內毒素后從血清中分離，被描述為“IFN-γ誘導因子”。許多研究者得出結論，該血清因子是IL-12，直到1995年從小鼠肝臟純化和“IFN-γ誘導因子”的分子克隆，才更名為IL-18[12]。IL-18屬于IL-1家族的第四成員，由巨噬細胞，樹突細胞（DC），嗜中性粒細胞，脂肪細胞，枯否細胞，小膠質細胞和大腦中的某些神經元等多種細胞產生。這種細胞因子呈現許多獨特的生物學效應，包括多效性、多功能性、免疫應答和促炎作用[13-16]。IL-18與家族中的IL-1β相似，其分泌不通過內質網和高爾基體，然而，IL-18的生物學活性并不能用IL-1β來概括。自1995年以來，許多研究已經使用內源性IL-18或IL-18缺陷型小鼠來研究IL-18的多種生物學功能。已有研究表明IL-18可以刺激激活NK細胞[17]、細胞毒性T淋巴細胞[18]以及對癌細胞生長和轉移的抑制作用[19]。

本實驗為了進一步研究IFN-γ和IL-18及二者的協同抗病毒活性與機制，對IFN-γ和IL-18及它們的協同免疫調節活性進行了誘導細胞因子分泌、NO產生和TLR表達和通路激活的分析。本實驗獲得的單一IFN-γ和IL-18蛋白將為產業開發和臨床應用奠定了一定的物質基礎，對后續的應用研究具有重要意義。在研究結果中，蛋白的協同作用具有較好的抗病毒效果，且具有較單一蛋白更好地免疫調節能力，為新型抗病毒的細胞因子制劑的開發和利用奠定了夯實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用動物 14日齡SPF（specific-pathogen-free）級三黃雞和9～11日齡雞胚購自大慶興旺養殖場。

1.1.2 主要試驗試劑 ChIL-18和ChIFN-γ為本實驗室制備，GM-CSF和VGX（TLR-4抑制劑）購自abcam公司；反轉錄試劑盒購自Bio NEER公司；質粒提取及DNA純化試劑盒購自Axygen公司；白介素-2（IL-2），白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-10（IL-10），白介素-12（IL-12），白介素-17（IL-17），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒購自云克隆有限公司，NO檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理 原核表達的ChIL-18和ChIFN-γ蛋白為本實驗室前期制備，已證明這2種蛋白具有抗IBDV感染的作用（未發表）。14日齡SPF級三黃雞雛雞20只，自由采食及飲水。隨機分成4組，每組5只，注射制劑分為ChIL-18組、ChIFN-γ組、ChIL-18+ChIFN-γ的混合組及PBS組。給藥方式為腹腔注射。實驗流程為：對14日齡雛雞分別以腹腔注射的方式進行初次注射純化后的濃度為1mg/mL的重組蛋白，每只雛雞注射200μL，24h后進行二次注射同樣水平的蛋白。具體實驗方法見表1。分別在注射后1d、2d、3d、5d和7d檢測血清中細胞因子IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-17的分泌水平。

表1 試驗動物分組

[組別 注射方式 數量（只） 14日齡

（mL/只） 15日齡

（mL/只） PBS 腹腔 5 0.2 0.2 IFN-γ 腹腔 5 0.2 0.2 IL-18 腹腔 5 0.2 0.2 IFN-γ+ IL-18 腹腔 5 0.2 0.2 ]

1.2.2 分離雛雞血清 對注射后雛雞靜脈采血，放于37℃恒溫培養箱中靜置1h，取出后放入4℃后3h，800g離心10min，吸取血清用于檢測細胞因子水平。

1.2.3 細胞因子檢測 檢測注射蛋白后雛雞血清中細胞因子的分泌情況。按照Gallus IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17Precoated ELISA Kit操作步驟進行檢測。使用前將試劑盒所提供的Washing buffer（30×）、Dilution buffer R（1×）、Precoated ELISA plate和TMB取出室溫平衡一段時間，所有試劑需充分混勻且避免在此過程中產生泡沫。

將血清轉入試劑盒所提供的預包被平板條內，每孔50μL。實驗過程中需設置標準品孔及空白孔。每孔加入50μl稀釋后的Biotinylated antibody，輕輕振動混勻，酶標板上加封板膜，37℃溫箱孵育。60min后取出平板，傾倒孔內液體并于無菌濾紙上拍干，每孔加入250μL1×Washing buffer，洗滌3次，每次5min。最后一次洗滌結束后于無菌濾紙上拍干，每孔加入100μL稀釋后的Streptavidin-HRP，加上覆膜，37℃溫箱孵育30min。取出平板后傾倒孔內液體，再次用1×Washing buffer清洗平板5次，每次5min，最后一次洗滌結束后將平板拍干。加入TMB，37℃靜置避光顯色。約顯色8min后每孔加入Stop solution終止反應。在加入Stop solution 10min內測定平板內各孔450nm波長處的光密度。根據標準品濃度及其對應吸光度值繪制標準曲線并計算其所對應公式，依照公式計算血清中細胞因子含量。

1.2.4 檢測巨噬細胞中NO分泌 雞外周血單核細胞制備。用10mL無菌注射器抽取肝素（100μg/mL），濕潤注射器管壁后推出，抽取成年三黃雞的翅根靜脈血5mL，按TBD的外周血淋巴細胞分離液的操作說明分離出淋巴細胞。將細胞濃度調整為1.0×106cells/mL，轉移細胞到10cm細胞培養板中，37℃，5% CO2條件下培養4h，棄掉培養基，用37℃預熱的培養基清洗3遍，用胰酶將剩下的貼壁細胞消化下來，重新調整細胞濃度到1.0×106cells/mL，于24孔板中加入50ng/mL的GM-CSF繼續培養，當細胞密度到80%或90%單層融合狀態時，用無血清培養基終止培養12h，給予不同的蛋白組刺激。蛋白刺激24h后取出細胞培養皿，取細胞培養上清液400μL，按照試劑盒中的方法檢測上清液中NO的含量。

1.2.5 TLR信號通路分析 提取的巨噬細胞中加入不同組蛋白刺激培養24h后收集細胞按2.2.2中的方法提取細胞總RNA，按2.2.9.3中的方法對TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9、MHC-I和MHC-II的mRNA水平進行鑒定。對蛋白刺激后的巨噬細胞提取胞內蛋白質，利用western-blot方法檢測巨噬細胞中MAPK和NFκB信號通路中p38和p65的表達情況以及其他幾種關鍵蛋白的表達水平。在24孔培養皿中的巨噬細胞中加入蛋白刺激24h后同時加入TLR-4抑制劑（VGX）和1×TCID50的IBDV，用無血清培養基繼續培養直至陽性孔完全病變，觀察實驗細胞孔中細胞的病變情況，利用qRT-PCR的方法定量檢測細胞培養液中病毒的復制水平。

1.2.6 數據統計分析 所有的數據進行生物統計學分析，采用SPSS軟件進行單因素方差分析，*表示P<0.05為差異顯著，**表示P<0.01為差異極顯著有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白體內刺激血液中細胞因子檢測 使用純化后的ChIL-18和ChIFN-γ蛋白以腹腔注射方式接種雛雞，加強注射1天后開始分離雛雞外周血血清。雛雞血清中細胞因子檢測結果。如圖1所示，與PBS組相比，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白注射后，血清中IL-2的分泌水平有所增加，到第3天之后，細胞因子水平逐漸下降。IL-4的分泌在第1天開始升高，知道7d仍然高于PBS組，3個蛋白組都能明顯地升高其分泌水平。在蛋白注射后，IL-6的分泌水平逐漸升高，并在第7天達到高峰，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白組可以更有效地刺激IL-6的分泌。與PBS組相比，混合組蛋白雖然可以增加IL-10的分泌，但增加的量不高，整體分泌水平都很低。在檢測的第2天，IL-12的分泌水平明顯升高，之后逐漸下降恢復正常水平，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白組的刺激分泌效果相對較好，其他兩組與PBS沒有統計學差異。蛋白組可以刺激IL-17，且在檢測的第1天開始分泌，之后逐漸下降，但仍然可以在幾天內持續較高的分泌水平。綜上，注射蛋白后血清中的IL-4、IL-6、IL-12和IL-17能顯著分泌，其中IL-2，IL-10和IL-12的分泌水平較其他組低，證明蛋白刺激可以在體內引起較強的細胞免疫，而在使用PBS刺激的情況下，這幾種細胞因子的分泌不明顯。結果說明ChIL-18和ChIFN-γ蛋白刺激幾種細胞因子分泌具有特異性。

[IL-2pg（mL）][IL-4pg（mL）][IL-6pg（mL）][IL-10pg（mL）][IL-12pg（mL）][IL-17pg（mL）]

圖1 注射蛋白后血清中細胞因子水平

2.2 蛋白誘導巨噬細胞產生NO 以雞外周血單核細胞制備的巨噬細胞為研究對象，分析蛋白對NO產生的影響。加入ChIL-18、ChIFN-γ、ChIL-18和ChIFN-γ蛋白及PBS刺激巨噬細胞24h，利用試劑盒檢測細胞上清中NO的含量，結果如圖2所示。與PBS組相比較，ChIL-18和ChIFN-γ蛋白明顯刺激細胞產生更多的NO，混合蛋白刺激細胞產生NO相比于ChIL-18組具有明顯差異，而相比于ChIFN-γ組沒有統計學差異。結果表明混合組蛋白能夠更有效地刺激NO的產生，從而使細胞具有更好地抗感染的微環境。

[NO（μmol/L）]

圖2 蛋白刺激后巨噬細胞中NO水平的檢測

2.3 蛋白激活巨噬細胞中信號通路 在巨噬細胞中加入ChIL-18、ChIFN-γ、ChIL-18+ChIFN-γ和PBS 4組刺激物，繼續培養24h后收集細胞提取細胞總RNA，并對TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9、MHC-I和MHC-II的mRNA水平進行鑒定，結果如圖3所示。ChIL-18和ChIFN-γ混合蛋白組刺激后TLR-2、TLR-3、TLR-4和MHC-II的轉錄水平升高。表明混合蛋白激活了巨噬細胞中這幾種TLR的信號，使細胞具有更強的抗感染能力?；旌系鞍滋岣進HC-II的轉錄水平表明混合蛋白可以更好地激活CD4+細胞免疫應答。

圖3 蛋白刺激后巨噬細胞中TLR和MHC的表達情況分析

利用western-blot方法檢測MAPK和NFκB信號通路中幾種關鍵蛋白的表達水平，結果如圖4所示。蛋白刺激后4～24h檢測p38和p65的表達，結果與PBS相比，3組蛋白都能夠刺激p38和p65蛋白的表達升高，而ChIL-18+ ChIFN-γ混合蛋白組中蛋白的水平更高，而且蛋白高表達時間延長。ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白同樣能刺激通路中其他幾種關鍵蛋白的表達量升高，IκBα降解量增多。表明混合蛋白可以更強烈地激活MAPK和NFκB信號通路并延長通路活化時間。

圖4 Western-Blot方法檢測巨噬細胞中蛋白水平

在24孔培養皿中的巨噬細胞中加入蛋白刺激24h后同時加入TLR-4抑制劑和1×TCID50的IBDV，用無血清培養基繼續培養直至陽性孔出現完全病變，觀察實驗細胞孔中細胞的病變情況，結果如圖5所示。在加入VGX之后蛋白組巨噬細胞仍會發生與PBS組相似的死亡和溶解，表明蛋白并不能抑制病毒感染引起的細胞病變和死亡。qRT-PCR定量分析蛋白組在加入VGX之后細胞培養液中的IBDV含量沒有減少。說明TLR-4信號對蛋白發揮的抗病毒感染的能力具有至關重要的作用。

圖6 蛋白不能抑制巨噬細胞加入VGX后對病毒的感染

3 討論

本研究使用原核表達系統表達出的ChIFN-γ和ChIL-18注射到14日齡雛雞體內，1d后進行二次注射，對注射后7d內的幾種細胞因子進行體內分析，檢測的細胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17?；旌辖M蛋白能明顯提高幾種細胞因子的轉錄水平。作為Th1型細胞免疫的主要效應分子，IFN-γ可以自動擴增Th1應答并交叉調節其他Th型[20]，IL-18不僅誘導IFN-γ產生，也在增強Th1反應中發揮重要作用[21]，本研究結果中混合組蛋白注射后在血清中檢測到更高水平的IL-12。與Qiao Y等的研究一致，IFN-γ可以增加IL-12的表達[22]，也有報道表明，IL-18不能誘導IL-12的產生[23]，可能是由于實驗的條件不同，所以出現不一樣的實驗結果。本實驗表明，混合組蛋白可以提高IL-4、IL-10和IL-6的水平，已知IFN-γ對Th2和Treg免疫反應具有抑制作用，對促炎性細胞因子的產生具有促進作用，而IL-18可以通過CD14+單核細胞誘導IL-10產生[23]，IL-18還誘導NK細胞，肥大細胞和嗜堿性粒細胞產生IL-4[24]。實驗結果中IFN-γ和IL-18組及混合組蛋白誘導強烈的IL-17分泌，Th17細胞的分化被IL-6、IL-1、TGF-β和IL-21所驅動，IL-1β和IL-18在內環境穩定和炎癥條件下促進Th17細胞分化[25]，本實驗中IFN-γ和IL-18明顯增加IL-6的表達，但由于實驗設計缺陷沒有檢測TGF-β的水平。以上結果說明IFN-γ和IL-18蛋白注射后會引起機體強烈的細胞免疫應答，使機體具有較強的抗病毒內環境。

巨噬細胞是對宿主防御具有重要作用的先天免疫細胞，可以產生介導宿主防御的多種促炎性細胞因子，這些細胞因子的基因表達強烈地受到TLR等模式識別受體與各種內源性炎癥因子所調節。所以本實驗利用雞外周血巨噬細胞研究蛋白對細胞產生NO的能力以及對TLR信號通路的影響進行鑒定及分析。結果表明混合組蛋白可以明顯提高巨噬細胞培養液中NO的含量，與Schroder K等的研究一致，IFN-γ可以提高巨噬細胞產生NO的水平[9]，IL-18也可以通過促使巨噬細胞表面受體和IL-10的表達而間接誘導NO產生[26]。在TLR家族中，TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9位于細胞內區域，識別病毒核酸種類；TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-6位于細胞表面，主要識別細菌細胞壁成分，TLR-2和TLR-4還能識別病毒結構蛋白。本實驗利用qRT-PCR的方法對幾種TLR和MHC分子進行轉錄分析，結果TLR-2、TLR-3和TLR-4的轉錄水平升高；TLR-5、TLR-7和TLR-9的轉錄水平沒有變化。IFN-γ刺激誘導細胞表面TLR-2和TLR-4蛋白的表達[27]。IFN-γ可以上調巨噬細胞中TLR-9的表達，但本實驗結果中TLR-9沒有變化，可能是因為在GM-CSF的存在下抑制了TLR-9的轉錄[28]。IL-18可以增加CD14+單核細胞中TLR-4的表達，而對TLR-2的表達沒有影響[23]。另一方面，Radstake等的研究表明在患有類風濕性關節炎患者的滑膜組織中表達TLR-2和TLR-4與IL-18的水平相關[29]。當IL-18處理PBMC時，同樣會觀察到TLR-2和TLR-4的上調。IFN-γ發揮抗病毒作用，在抗原呈遞細胞中誘導MHC-II類分析的表達和運輸，并影響吞噬作用和微管形成[30]?；旌辖M蛋白刺激巨噬細胞會引起MHC-II類分子的轉錄水平明顯升高，而MHC-I類分子沒有明顯變化。這些結果表明蛋白刺激巨噬細胞可以改變細胞內效應分子的表達，使細胞具有更好的抗感染能力。

IFN-γ和IL-18刺激也影響TLR誘導的MAPK和NFκB信號通路的活化。本實驗中巨噬細胞在蛋白刺激24小時內利用western-blot分析表明，混合組蛋白可以明顯升高p38和p65的表達水平，IFN-γ和IL-18混合組蛋白刺激p38和p65表達升高都持續24h，表明混合蛋白可以激活MAPK和NFκB信號通路并使通路的激活狀態延長。之后對MAPK和NFκB信號通路中幾種關鍵蛋白進行表達分析。IκBα作為NFκB的抑制劑，二者具有拮抗作用，通過檢測IκBα的降解來反向證明NFκB的激活；細胞對趨化因子的反應性可以通過調節信號分子JNK來觀察；轉錄因子STAT1是IFN-γ應答的關鍵介質，可以增加組蛋白乙?；?，使TLR下游多種促炎性細胞因子基因的表達增加；C/EBPβ作為TLR誘導的轉錄因子，可以促進其他轉錄因子的募集和促炎性細胞因子基因的轉錄。當JNK、STAT1和C/EBPβ的表達上調時，表明蛋白可以促進多種細胞因子的產生。實驗結果與之前的報道一致，IFN-γ和IL-18刺激可以引起NFκB抑制劑IκBα的快速降解[31]，JNK在受蛋白刺激的細胞中普遍存在，而在IFN-γ和混合組蛋白刺激的細胞中磷酸化的JNK水平較高，STAT1被IFN-γ刺激所激活，有研究表明在IFN-γ預處理的巨噬細胞中C/EBPβ的募集也增強[22]，與其一致，本實驗結果中IFN-γ和混合組蛋白能明顯提高巨噬細胞中C/EBPβ的表達。以上結果表明IFN-γ和IL-18刺激巨噬細胞可以誘導TLR介導的MAPK和NFκB信號通路的激活，促進其他轉錄因子和炎性細胞因子的表達，并使細胞更敏感。在巨噬細胞中加入蛋白24h后同時加入TLR-4抑制劑和IBDV，結果在加入抑制劑之后，巨噬細胞的抗病毒能力明顯下降，表明TLR-4信號對巨噬細胞的抗病毒活性具有重要作用。綜上所述，IFN-γ和IL-18都可以誘導機體和細胞產生抗病毒能力，但二者的協同作用效果優于單一蛋白，為后續的抗病毒機制的研究打下夯實基礎。

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（責編：張宏民）