C57小鼠毛細胞突觸帶的發育觀察

楊樂柳柯楊仕明龔平桂劉昀逸張軍軍汪雪梅彭宏

1南方醫科大學（廣州510515）

2首都醫科大學附屬友誼醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）

3中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100039）

4廣東省第二人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510310）

C57小鼠毛細胞突觸帶的發育觀察

楊樂1,4柳柯2楊仕明3龔平桂4劉昀逸1張軍軍1汪雪梅4彭宏4

1南方醫科大學（廣州510515）

2首都醫科大學附屬友誼醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）

3中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100039）

4廣東省第二人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510310）

目的了解C57小鼠耳蝸毛細胞突觸帶發育的時間特點。方法全耳蝸基底膜鋪片后免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察和記錄不同發育階段C57小鼠聽覺突觸前膜突觸帶的數目與分布。運用ABR檢測聽力發生的時間。結果C57小鼠出生后0d，在內外毛細胞胞質即可觀察到Ctbp2信號；出生后第3天，Ctbp2信號在毛細胞上逐漸增多；出生后第6天，Ctbp2信號在毛細胞的胞質和基底側膜上的表達達高峰，內毛細胞（35.1±3.4）個/細胞，而外毛細胞上的增加更為顯著，達（21.0±3.2）個/細胞；出生后第12、30和60天，Ctbp2信號數目趨于穩定，在內毛細胞16-20個/細胞，外毛細胞1-3個/細胞，信號的分布也逐漸聚集在毛細胞的基底側膜上。ABR檢測提示C57小鼠聽覺發生的平均時間為13.2天。結論毛細胞突觸帶出生時即已存在，出生后逐漸發育和完善。聽覺發生與突觸帶成熟時間上的高度吻合，表明成熟突觸帶的形成可能是聽覺發生的前提條件之一。

毛細胞；突觸帶；發育；聽覺發生

Projectsupported by the NationalNature Science Foundation of China(GrantNo.81572666).

Declaration of interest:Theauthors reportno conflictsof interest.

毛細胞與聽覺傳入神經間的信號傳遞依賴于毛細胞基底側膜上特化的帶狀突觸（Ribbon Syn?apse，RS）[1]。在每個內毛細胞（Inner Hair Cell，IHC）上有20-30根I型螺旋神經元的軸突與之形成連接，而每個外毛細胞（Outer Hair Cell，OHC）則僅與1-3根II型螺旋神經元的軸突相連[2-4]。經典的毛細胞/傳入神經連接的復合單位包括一個突觸帶（Synaptic Ribbon）結構圍繞以致密神經遞質囊泡形成的可快速釋放池以及與之間隔的突觸后神經末梢膜遞質受體斑[5]。突觸帶的存在使得聽覺信息可瞬時、持續及高保真地由內毛細胞傳入相連的聽覺纖維[6]。然而，突觸帶結構又易受外界因素影響，如衰老[7]、噪聲暴露[8]、基因突變[9]、耳毒性藥物[10]等都會損害突觸帶的形態和數目，引起不同程度和性質的聽覺損傷，表明突觸帶對正常聽功能的維持具有重要的意義。因此，認識毛細胞突觸帶的發育特性對進一步理解與闡釋聽覺生理具有重要意義。

本研究中，我們選取0d、3d、6d、12d、30d和60d C57小鼠為實驗對象，通過免疫熒光單標突觸帶的特異結構蛋白（C-terminalbind protein，Ctbp2）實現對耳蝸基底膜上的突觸帶的標記，運用激光共聚焦顯微鏡對耳蝸不同區域每一層面的突觸帶進行單通道掃描后行最大灰度疊加，觀察和分析毛細胞突觸帶在聽覺發生前后數量和分布上的時域變化特點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

0、3、6、12、30和60日齡SPF級C57小鼠（軍科動物中心）各5只，雄雌不限。

1.1.2實驗試劑

鼠源性Ctbp2抗體（1:100,美國BD公司）；Al?exa Fluorence標記的羊抗鼠抗體（1:400,美國LIFE公司）；免洗DAPI液（4',6-Diamidino-2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚；中杉金橋）。

1.2方法

1.2.1耳蝸基底膜制備

剪刀斷頭乳鼠后取出顳骨，解剖顯微鏡下迅速分離耳蝸，開放圓窗和卵圓窗，用細鑷在蝸尖鉆孔，4%多聚甲醛緩沖液經圓窗、卵圓窗灌流，并4℃固定過夜8-12h后，放入10%EDTA溶液中脫鈣6-12h (6d后小鼠需脫鈣)。解剖顯微鏡下于0.1mmol/L PBS中從頂回向底回剝除蝸殼，切除螺旋韌帶，清除前庭膜及蓋膜。

1.2.2免疫熒光染色

Ctbp2和DAPI標記：將分離好的基底膜置于1%Triton X-100中30 min后，PBS沖洗3次，10-15min/次；5%山羊血清封閉1h；加一抗，鼠源性Ctbp2抗體（1:100）4℃過夜，PBS沖洗3次，15-20min/次；加二抗，37℃孵育1h，PBS沖洗3次，15-20min/次。DAPI染色：載玻片上滴加一滴（約40μl）免洗DAPI液，解剖顯微鏡下鋪片后，將蓋玻片倒扣于載玻片上。

1.2.3激光共聚焦顯微鏡成像

將耳蝸基底膜鋪片置于激光共聚焦顯微鏡（Zeiss780，德國）100×油鏡下觀察，選擇激發光波長分別為358nm和488nm。觀察基底膜中回區域的內外毛細胞，并在所選區域對毛細胞從上至下進行掃描，對標本各層圖像進行連續觀察，本實驗中設定的掃描層距為0.3μm。

1.2.4小鼠ABR測聽

采用美國TDT測聽設備，Biosig測聽軟件對小鼠進行ABR閾值檢測。測聽在隔聲屏蔽室內進行，測聽前使用1%戊巴比妥鈉（9μl/g，腹腔注射）對小鼠進行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于小鼠兩側耳廓前緣連線顱頂中點皮下，參考電極置于測試耳后皮下，接地電極置于對側耳后皮下，測試耳機距外耳道口約0.5cm，檢測小鼠雙耳的ABR閾值。實驗采用短聲（Click）和短純音（Toneburst，Rise/Fall time:1ms；Duration:4ms）作為刺激聲，帶通濾波為300～3000Hz，疊加次數為1024次，掃描時間10ms。刺激聲強度自90dBSPL開始，以10dB逐漸遞減，直至檢測不出重復的ABR波形，再向上增強5dB，直至能檢測出重復的ABR波形，此刺激聲強度即為小鼠的聽閾。

2 結果

出生后0d，內外毛細胞上均可見突觸帶信號，且在內毛細胞胞質和基底側膜上可見不均一散在信號，（18.4±2.3）個/IHC（圖1和3 0d）；外毛細胞則可見少許信號及部分細胞未見信號，（1.6±0.9）個/ OHC（圖2和3 0d）。出生后3d至6d，毛細胞上信號數目逐漸增多，胞質中仍可見多量信號分布，且在第6d時達高峰，（35.1±3.4）個/IHC和（21.0±3.2）個/ OHC（圖3 6d）。出生后12d、30d和60d，突觸帶信號逐漸移向毛細胞的基底側膜，且信號數量上也趨于穩定（圖1,2和3a）。相比內毛細胞，外毛細胞上突觸帶數目經歷著更為劇烈的變化。圖4所示為鼠齡12d時click聲刺激所誘發的ABR波形和聽覺發生的平均時間13.2天。

圖1 不同時間點，內毛細胞突觸帶的數目及分布情況。綠色為突觸帶信號，藍色為內毛細胞胞核。出生后0d至6d，突觸帶數量上逐漸增多，并在第6d時達高峰。6d至12d后,突觸帶急劇減少并趨于穩定。白色箭頭示0d至6d在內毛細胞胞質上可見散在突觸帶信號分布，12d、30d和60d時已逐漸移向基底側膜。Fig.1 Number and distribution of synaptic ribbon in IHCs at different time points.Green for the synaptic ribbon signals, blue for the IHC nucleus.At 0d to 6d after birth,the number of synaptic ribbon gradually increased,and reached the peak at 6d.Then,the number of synaptic ribbon decreased sharply and tended to be stable at6d to 12d.White arrows showed the signal can be observed sporadically in cytoplasm at0d to 6d., the signal gradually moved to the basolateral membrane at 12d,30d and 60d.

圖2 不同時間點，外毛細胞突觸帶的數目變化。綠色為突觸帶信號，藍色為外毛細胞胞核。出生0d至6d，外毛細胞的信號逐漸增多，在6d時達高峰；6d至12d時，信號數目急劇減少；12d、30d和60d時信號數目趨于穩定，1-3個/外毛細胞。Fig.2 Changes in the number of synaptic ribbon in OHCs at different time points.Green for the synaptic ribbon signal, blue for the OHC nucleus.The signal number of the OHCs gradually increased from 0d to 6d,and reached the peak at6d. Subsequently,the number of signals decreased sharply from 6d to 12d.Finally,the number of signals tended to be stable, and 1-3/OHC,at12d,30d and 60d.

圖3 a)隨時間改變，內、外毛細胞突觸帶數目的變化趨勢。0d至6d時，信號數目逐漸增多，并于6d時達高峰；6d至12d時急劇減少；12d后，內、外細胞突觸帶數目趨于穩定。b)相對于出生60d時內、外毛細胞上突觸帶的變化趨勢，提示出生早期外毛細胞上的突觸帶數目經歷著更為劇烈的變化。Fig.3 a)Changes in the number of synaptic ribbon in IHCs and OHCs over time.From 0d to 6d,the number of signals gradually increased,and reached a peak at 6d.Then,a sharp reduction happened from 6d to 12d.Subsequently,the number of synapse ribbon in IHCs and OHCs tended to be stable. b)The changes compared w ith 60d after birth of synaptic ribbon in IHCs and OHCs,suggesting that the number of synaptic ribbon in OHCsunderwentmore dramatic changes.

圖4 a).Click聲刺激下誘發的12d鼠齡的ABR波形。b).C57小鼠聽力出現時間的分布情況，平均聽覺出現時間是出生后13.2d。Fig.4 a)The ABRwaveform of 12-day-oldmice induced by“Click”acoustic stimulation.b)The distribution of hearing onset time in C57m ice,and the average timewas at13.2d afterbirth.

3 討論

耳蝸內毛細胞帶狀突觸是聲音信號傳導通路上的第一個突觸結構，其在聲音信號編碼和傳導過程中的作用已越來越引起關注和重視。但由于該突觸結構所在位置隱蔽，且體積微?。▽儆诩{米級別，直徑范圍波動于100～200nm），致使其研究困難。近年來，隨著帶狀突觸前膜突觸帶結構成分的確定，國內外已逐漸棄用透射電鏡并開始采用免疫熒光標記技術結合激光共聚焦顯微鏡來研究耳蝸帶狀突觸的形態和結構，且功能更強的共聚焦顯微鏡可進行層距十分微小的光學掃描（約0.3μm）并進行三維信號重建，可達計數和定位的目的。在本研究中，我們利用免疫熒光標記結合激光共聚焦顯微鏡觀察的方法來顯示毛細胞突觸帶結構，直觀、定量觀察突觸帶在空間分布和數目上的時域變化特點。

研究表明，RIBEYE是毛細胞突觸帶結構的主要組成部分，借助短絲帶（Short filament）呈棒狀垂直連接于內毛細胞基底側膜的活動區（Active zone），并與軸突末梢形成突觸[11]。結構上含有Do?mainA和DomainB兩部分，其中DomainA為其特異性結構，具有酶活性，介導RIBEYE聚合成更大的分子結構；DomainB則與胞核內2-羥基酸脫氫酶相關的阻遏蛋白Ctbp2的結構相同[12]。因此，本研究中使用的Ctbp2抗體可以和DomainB特異性結合的同時也可使內毛細胞的胞核著色（圖1 30d和60d），從而實現特異性標記突觸帶。

本研究結果顯示，C57小鼠在出生時內、外毛細胞上即可觀察到標記的突觸帶，該信號呈大小不等圓點狀不均一分布于內毛細胞胞質和基底側膜上（圖1 0d），在外毛細胞則可見少許數目信號，部分細胞未見信號存在，提示突觸帶的出現在內毛細胞上早于外毛細胞。對與突觸帶相對的突觸后膜上有關結構的研究發現，剛出生小鼠耳蝸底轉的螺旋神經元傳入軸突末梢上的突觸后致密斑與突觸帶相靠近[13]。運用免疫熒光染色也發現出生時GluR2/R3 AMPA受體即已存在[14]，但此時小鼠尚無聽力，表明出生時突觸連接結構即已成功建立，然該連接功能上尚不成熟，不具信息傳遞功能。隨著突觸的發育，我們發現C57小鼠在聽力出現前，突觸前結構的數目與分布在內、外毛細胞上呈動態變化，出生后數目逐漸增多，第6d達高峰。尤其是外毛細胞上的突觸帶的數量，數目可達18-22個/細胞（圖1和2 6d）。對于毛細胞上突觸帶一過性增長的現象，Echteler和Huang等認為，可能與出生初期大量螺旋神經元傳入纖維分叉，發出的軸突非選擇性支配內、外毛細胞形成大量不成熟的帶狀突觸有關[14-16]。至出生后第12、30和60d，C57小鼠聽力開始出現（圖4）并逐漸趨向成熟。與此同時，突觸帶的數目也逐漸趨于穩定，空間分布上也由散在游離于胞質移向毛細胞的基底側膜。從出生后第6d至12d，我們定量分析了突觸帶數目上的變化，發現內毛細胞上減少約50%，而外毛細胞上則發生著更為劇烈的變化，減少約1000%（圖3）。數目上的巨大變化，不少學者認為這是由于I型螺旋神經元軸突分支的回縮（Retraction）、修剪（Pruning）、精減（Refinement）和圓形突觸前帶相互融合成細長型及多余II型螺旋神經元發生凋亡，使得許多不成熟連接消除所致[14,16-18]。同樣地，出生早期突觸后膜上的GluR2/3 AMPA受體的變化特點也發生著與突觸前膜上突觸帶類似的變化[14]。位置上的變化，被認為同突觸帶的錨鏈蛋白Bassoon的表達密切相關[19]。因此，對突觸帶的單一標記，也可較準確地反映毛細胞與螺旋神經節之間連接的變化，由于是單通道掃描，突觸數目也方便計算。此外，為了驗證毛細胞突觸帶形態上的成熟是否對應小鼠聽力的發生，我們檢測C57小鼠聽覺發生的平均時間是13.2d（圖4b），與突觸帶數目和空間分布穩定出現的時間基本一致，表明成熟突觸帶對聽覺的發生至關重要。然而，關于突觸帶結構在C57小鼠出生早期所呈現的時域變化特點其分子機制和生理意義目前尚不清楚，猜測可能以某種方式影響了螺旋神經元軸突或毛細胞的成熟，為快速、高效的聽覺信息傳遞提供堅實的結構基礎。

綜上，我們的結果顯示相比內毛細胞，外毛細胞上一過性突觸連接的變化及突觸帶空間分布上的改變更為劇烈（圖3b），毛細胞上的突觸帶在出生時即已存在，出生后才逐漸發育和完善，與聽覺發生時間上的高度吻合，提示成熟的突觸帶是聽覺發生的前提條件之一。

1 Delacroix,L.and B.Malgrange,Cochlear afferent innervation de?velopment.Hearing Research,2015.330:157-169.

2 Fuchs,P.A.,E.Glowatzki and T.Moser,The afferent synapse of cochlear hair cells.CurrentOpinion in Neurobiology,2003.13(4): 452-458.

3 Meyer,A.C.,etal.,Tuning ofsynapse number,structure and func?tion in the cochlea.Nature Neuroscience,2009.12(4):444-453.

4 Berglund,A.M.and D.K.Ryugo,Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.J Comp Neurol,1987.255(4): 560-570.

5 Stamataki,S.,et al.,Synaptic alterations at inner hair cells pre?cede spiral ganglion cell loss in aging C57BL/6Jmice.Hearing Research,2006.221(1-2):104-118.

6 LoGiudice,L.and G.Matthews,The Role of Ribbons at Sensory Synapses.The Neuroscientist,2009.15(4):380-391.

7王馳,柳柯,趙立東等.老年性聾耳蝸帶狀突觸數量在時空上的改變[J].中華耳科學雜志,2016,(01):32-36.

Wang C,Liu K，Zhao LD,et al.Time and frequency dependent changes of cochlear ribbon synapses in age-related hearing loss [J].JournalofOtology,2016,(01):32-36.

8 Liberman,L.D.,H.Wang and M.C.Liberman,Opposing Gradi?ents of Ribbon Size and AMPA Receptor Expression Underlie Sensitivity Differences among Cochlear-Nerve/Hair-Cell Synaps?es.JournalofNeuroscience,2011.31(3):801-808.

9 Ruel,J.,et al.,Impairment of SLC17A8 Encoding Vesicular Glu?tamate Transporter-3,VGLUT3,Underlies Nonsyndromic Deaf?ness DFNA25 and Inner Hair Cell Dysfunction in Null Mice.The American JournalofHuman Genetics,2008.83(2):278-292.

10 Liu,K.,etal.,Cochlear Inner Hair CellRibbon Synapse is the Pri?mary TargetofOtotoxic Aminoglycoside Stimuli.Molecular Neuro?biology,2013.48(3):647-654.

11 Schaeffer,S.F.,E.Raviola and J.E.Heuser,Membrane specializa?tions in the outer plexiform layer of the turtle retina.JComp Neu?rol,1982.204(3):253-267.

12 Schmitz,F.,A.Konigstorfer and T.C.Sudhof,RIBEYE,a compo?nentofsynaptic ribbons:a protein's journey through evolution pro?vides insight into synaptic ribbon function.Neuron,2000.28(3): 857-872.

13 Shnerson,A.,C.Devigne and R.Pujol,Age-related changes in the C57BL/6Jmouse cochlea.II.Ultrastructural findings.Brain Res, 1981.254(1):77-88.

14 Huang,L.C.,et al.,Synaptic profiles during neurite extension,re?finement and retraction in the developing cochlea.Neural Dev, 2012.7:38.

15 Echteler,S.M.,Developmental segregation in the afferent projec?tions tomammalian auditory hair cells.Proc Natl Acad Sci U S A,1992.89(14):6324-6327.

16 Huang,L.C.,et al.,Spatiotemporal definition of neurite outgrowth, refinement and retraction in the developing mouse cochlea.De?velopment,2007.134(16):2925-2933.

17 Sendin,G.,et al.,Maturation of ribbon synapses in hair cells is driven by thyroid hormone.JNeurosci,2007.27(12):3163-3173.

18 Barclay,M.,A.F.Ryan and G.D.Housley,Type Ivs type IIspiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.NeuralDev,2011.6:33.

19 Jing,Z.,et al.,Disruption of the presynaptic cytomatrix protein bassoon degrades ribbon anchorage,multiquantal release,and sound encoding at the hair cell afferent synapse.J Neurosci, 2013.33(10):4456-4467.

Observation of developmental changesof hair cellsynaptic ribbons in C57m ice

YANGLe1，4,LIUKe2,YANGShiming3,GONGPinggui4,LIU Junyi1,ZHNAGJunjun1,WANGXuemei1,PENGHong11 Southern MedicalUniversity,Guangzhou 510515,China;
2DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,Friendship Hospitalaffiliated to CapitalMedicalUniversity, Beijing 100050,China;
3DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100039,China;
4DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,Guangdong Second ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou 510310,China

PENGHong Email:doctorpenghong@163.com

Objective To investigate the temporal characteristicsof developmentof the synaptic ribbon in cochlear hair cells in C57m ice.M ethods The number and distribution of presynaptic ribbonson thewhole cochlearbasilarmembranewere exam ined and recorded by confocalm icroscopy w ith immunofluorescence in C57m ice atdifferent developmental stages.ABRswere used to detect the time of hearing onset.Results Ctbp2 signalswere present in the cytoplasm of inner and outer hair cells at day 0,continuing increasing at day 3 and reaching peak values(35.1±3.4/inner hair cell and 21.0±3.2/outer hair cell)at day 6.Subsequently,Ctbp2 signals tended to stabilize at16-20/inner hair cell and 1-3/ outer hair cell,w ith a gradual distribution shift to the basolateralwallof hair cells.In addition,ABR tests suggested that the average time of hearing onset in C57m icewas 13.2 days.Conclusions Synaptic ribbons in hair cells are presentat birth,and continue to develop andmature after birth.The seemingly synchronized developmentof hearing andmatura-tion of synaptic ribbonssuggest that the lattermay bea pre-condition for the former.

Hair cells;Synaptic ribbon;Development;Hearing onset

R764

A

1672-2922（2017）02-234-5

2017-02-11審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.018

國家自然科學基金（81572666）

楊樂，碩士，研究方向：耳顯微外科

楊樂和柳柯為并列第一作者

姓名:彭宏，Email:doctorpenghong@163.com