不同提取方法對牛乳脂肪分析的影響

楊昕艷

（秦皇島金海特種食用油工業有限公司，河北秦皇島066000）

不同提取方法對牛乳脂肪分析的影響

楊昕艷

（秦皇島金海特種食用油工業有限公司，河北秦皇島066000）

分別采用石油醚-乙醚溶劑系統和氯仿-甲醇溶劑系統，并結合凍干后提取和液液萃取等方法，對牛乳乳脂的總脂肪酸和乳脂脂肪sn-2脂肪酸的組成進行分析。結果表明，在分析乳脂的脂肪酸組成方面，氯仿-甲醇溶劑系統比石油醚-乙醚溶劑系統具有更好的提取效果，尤其對于長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸；液液萃取比凍干后提取具有更好的平行性和穩定性。

乳脂肪；脂肪酸；sn-2脂肪酸；分析；提取方法

脂肪的提取，通常涉及到溶劑的選擇性萃取和被提取對象在脂肪提取之前的處理。脂肪的溶解性是脂肪提取的一個重要標準，其在很大程度上取決于樣品中脂肪的存在類型和非極性脂肪（主要是甘油三酯）與極性脂肪（主要是磷脂和糖脂）所占的比例[1]。因此，可以根據樣品類型及其組成成分的特點，選擇不同的溶劑系統來提取脂肪組分。

此外，為了從樣品中提取出脂肪，往往需要對樣品進行前處理，以方便脂肪的提取，如干燥、減小樣品的粒徑、破壞包被脂肪的成分等。就乳脂肪來說，在脂肪提取之前需要使用氨水對乳樣進行處理，以溶解酪蛋白，使乳脂肪從包被的基質（乳脂肪球膜、酪蛋白膠束）中釋放出來[2-3]。此外，有時還需要對樣品進行預干燥，以便更高效、更完全地提取脂肪。

脂肪的類型、脂肪酸組成、脂肪結構的組成、脂類物質的氧化狀況等的分析，都需要將脂肪從所處的基質中分離出來。就脂肪的脂肪酸組成來說，不僅需要了解總脂肪的脂肪酸組成，也需要了解這些脂肪酸在脂肪結構中所處的位置，如sn-2脂肪酸組成等。

脂肪提取的結果將直接影響脂肪各個屬性的分析。鑒于此，試驗對氯仿-甲醇和石油醚-乙醚2個溶劑系統分別在凍干后提取和液液萃取時，對提取總脂肪的脂肪酸和脂肪結構中sn-2脂肪酸的影響進行了對比。

1 試驗方法

1.1 石油醚-乙醚凍干提取

稱取25 g樣品，進行冷凍干燥。凍干后的樣品加入25 mL乙醇和100 mL石油醚-乙醚（1∶1，V/V）并攪拌均勻（500 r/min，10 min，室溫），然后靜置待溶液澄清，分離出上清液；重復提取5次后，將所有上清液以轉速4 000 r/min離心3 min，再將上清液于40℃，100 r/min旋轉蒸發去除溶劑；將所得乳脂貯藏于-18℃備用。

1.2 石油醚-乙醚液液萃取

稱取25 g樣品，加入5 mL氨水和25 mL無水乙醇并搖勻；加入62.5 mL無水乙醚和62.5 mL石油醚，混合均勻后靜置分層，下層液體用75 mL石油醚-乙醚（1∶1，V/V）重復萃取5次；將所有上清液合并，于40℃，100 r/min條件下旋轉蒸發去除溶劑；將所得乳脂貯藏于-18℃備用。

1.3 氯仿-甲醇液液萃取

稱取10 g樣品，加入2 mL濃氨水，振蕩搖勻后加入30 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）和適量NaCl，再次振蕩搖勻；以轉速6 000 r/min離心5 min，上層液體重復提取2次；合并所有提取的下層清液，加入適量超純水并振蕩搖勻，離心后用旋轉蒸發儀蒸干溶劑；將所得乳脂貯藏于-18℃備用。

1.4 氯仿-甲醇凍干提取

稱取10 g樣品，加入2 mL濃氨水并振蕩搖勻1 min；將樣品進行冷凍干燥，在凍干后樣品中加入30 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）和少許NaCl，振蕩搖勻；以轉速6 000 r/min離心5 min，取出下層清液后再次加入氯仿-甲醇溶液重復提取2次；合并所有提取液，后續處理方法同氯仿-甲醇液液萃取。

1.5 乳脂脂肪酸組成分析

稱取0.3 g乳脂于15 mL樣品瓶中，加入5 mL正己烷和0.5 mol/mL的KOH-CH3OH溶液3 mL；加蓋混勻后置于60℃烘箱加熱0.5 h，取出后立即以轉速4 500 r/min離心5 min后，取上清液用Agilent 7820型GC進行分析。氣相色譜升溫程序：140℃保持5 min，以10℃/min升溫至180℃并保持10 min，以2℃/min升溫至210℃并保持10 min，最后以10℃/min升溫至230℃并保持15 min。氣相色譜柱Agilent CP-SIL88型（100 m×0.25 mm×0.2 μm），37種脂肪酸甲酯（Supelco，CRM47885 LC08286V）。

1.6 乳脂sn-2脂肪酸組成分析

（1）樣品處理。取約0.1 g樣品在15 mL離心管中，加入200 μL正己烷使樣品完全溶解；稱取0.02 g豬胰脂肪酶，加入2 mL的Tris緩沖溶液輕輕搖動，加入500 μL膽酸鈉，200 μL飽和CaCl2溶液，在40℃水浴鍋中振搖2 min；然后于室溫下手搖1 min，立即加入1 mL鹽酸及1 mL無水乙醚，劇烈搖勻；以轉速4 500 r/min離心3 min，靜置1 min；將上清液加入1支干凈的15 mL離心管中，加入無水硫酸鈉搖勻。

（2）TLC分離。取一塊100 mm×200 mm硅膠板（青島海洋化工GF254），用展開劑（正己烷∶無水乙醚∶乙酸乙酯∶甲酸=60∶38∶2∶1）進行分離；在256 nm的紫外燈下熒光顯色，刮下目標區域，裝入15 mL離心管中；離心管中加1 mL正己烷和1 mL BF3-甲醇溶液，放入60～70℃烘箱中酯化30 min，以轉速4 500 r/min離心，取上層清液檢測。

檢測方法如乳脂的脂肪酸組成分析所述。

2 結果與討論

2.1 不同溶劑系統和提取方法分析的乳脂脂肪酸組成差異

不同溶劑系統和提取方法對乳脂脂肪酸組成的分析結果見表1。

表1 不同溶劑系統和提取方法對乳脂脂肪酸組成的分析結果

對于石油醚-乙醚溶劑系統來說，無論是凍干提取還是液液萃取，二者提取的乳脂脂肪酸組成具有接近的脂肪酸組成，說明2種提取方法的準確性較好。在測量數據平行性方面，除了飽和脂肪酸C14∶0和C16∶0含量在液液萃取條件下的波動大于凍干提取方法外，其余各種類型脂肪酸測定的平行性方面液液萃取方法優于凍干提取方法（具有較小的標準差）。

對于氯仿-甲醇溶劑系統來說，凍干提取方法得到的結果平行性和穩定性明顯比液液萃取方法的差，凍干提取的標準差曲線波動特別大，有些甚至超過9%。

氯仿-甲醇溶劑系統液液萃取與石油醚-乙醚溶劑系統相比而言，其分析結果也比較接近，同時也具有較好的數據平行性，但二者沒有顯著的差異性。

2.2 不同溶劑系統和提取方法分析的乳脂sn-2脂肪酸組成差異

不同溶劑系統和提取方法對乳脂sn-2脂肪酸組成的分析結果見表2。

表2 不同溶劑系統和提取方法對乳脂sn-2脂肪酸組成的分析結果

由表2可知，試驗中的同一溶劑系統無論采用凍干提取還是液液萃取，方法之間的差異性很小，結果極為接近，并且這些方法檢測結果的重現性也較好，標準差都較低。對于不同溶劑系統，氯仿-甲醇溶劑系統平行樣本間的標準差基本在0.7以內，顯示出良好的穩定性和重現性。同時，氯仿-甲醇溶劑系統進行液液萃取方法獲得的檢測結果平行性和穩定性也更優于凍干方法的結果；石油醚-乙醚溶劑系統中凍干提取方法和液液萃取方法的標準差基本在0.5以上，波動最大的在2左右。因此，氯仿-甲醇溶劑系統的效果更優于石油醚-乙醚溶劑系統對乳脂sn-2脂肪酸的分析。

對于中短鏈脂肪酸（C8∶0，C10∶0，C12∶0，C14∶0），不同溶劑系統和提取方法之間都有較好的提取效果；而對于長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸（C16∶0，C18∶1，C18∶0），氯仿-甲醇溶劑系統明顯優于石油醚-乙醚系統。由表2可知，氯仿-甲醇溶劑系統提取到不飽和脂肪酸C18∶1的相對百分含量大于石油醚-乙醚溶劑系統。因為在乳脂脂肪的sn-2位置，不飽和脂肪酸含量相對較少，因此石油醚-乙醚溶劑系統帶來的結果誤差大于氯仿-甲醇溶劑系統的結果誤差。對于不同乳脂來說，尤其是駱駝乳、人乳等，長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸含量較多的乳類，氯仿-甲醇溶劑系統比石油醚-乙醚溶劑系統具有更好的提取效果。

3 結語

作為脂肪提取常用的溶劑系統，其對總脂肪的提取都具有良好的效果，均在脂肪的分析中得到廣泛應用。在試驗中，2種溶劑系統對總脂肪酸的分析結果相近，沒有顯著性差異，說明這2種溶劑系統都比較適合總脂肪酸組成的分析。然而，對于脂肪結構sn-2位脂肪酸組成的分析中，2種溶劑系統表現出了明顯的不同，氯仿-甲醇溶劑系統比石油醚-乙醚溶劑系統在sn-2位脂肪酸分析中具有更好的效果。同時，氯仿-甲醇溶劑系統以液液萃取分析sn-2位脂肪酸結果也比以凍干后分析sn-2位脂肪酸具有更好的平行性和穩定性。

[1]商允鵬，生慶海，王貞瑜，等.三酰甘油sn-2位上棕櫚酸生理功能及研究概況[J].中國糧油學報，2010（10）：119-123.

[2]袁小武，鄧澤元，李靜，等.胰脂肪酶法測定食用油甘油三酯中脂肪酸的位置分布[J].食品科學，2008（11）：544-547.

[3]朱啟思，唐家毅，周珞，等.豬油酸解制備人乳脂替代品的研究[J].中國油脂，2009（2）：39-42.◇

Analysis and Evaluation on Fatty Acids and sn-2 Fatty Acids in Commercial Infant Formula

YANG Xinyan
（Qinhuangdao Goldensea Speciality Oils&Fats Industries Co.，Ltd.，Qinhuangdao，Hebei 066000，China）

The total fat and the compositon of cholesterol fat sn-2 fatty acid are analyzed by petroleum ether-ether solvent system and chloroform-methanol solvent system respectively，and the effects of freeze-drying and direct liquid-liquid extraction are studied.The results show that the chloroform-methanol solvent system had better extraction effect than petroleum ether-ether solvent system in the analysis of fatty acid compositon of milk fat.Especially for long-chain fatty acids and unsaturated fatty acids；liquid-liquid extraction is better than freeze-drying the result of parallelism and stability.

milk fat；fatty acids；sn-2 fatty acids；analysis；extraction method

TS816.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.032

1671-9646（2017）05b-0015-03

2017-05-26

楊昕艷（1980—），女，本科，工程師，研究方向為食品科學、油脂化學和乳品科學。