MPC30-DEA70載AMO-miR-146a對大鼠頸總動脈球囊損傷后血管內膜增生的影響

李志，陸遠，馮輝，張敏，張卓琦，王志榮，楊煜，徐晤

(徐州醫科大學附屬醫院心內科，江蘇徐州221000)

MPC30-DEA70載AMO-miR-146a對大鼠頸總動脈球囊損傷后血管內膜增生的影響

李志，陸遠，馮輝，張敏，張卓琦，王志榮，楊煜，徐晤

(徐州醫科大學附屬醫院心內科，江蘇徐州221000)

目的陽離子磷酸膽堿聚合物(MPC30-DEA70)負載反義miR-146a寡核苷酸(AMO-miR-146a)轉染大鼠頸總動脈球囊損傷處血管平滑肌細胞(VSMC)，觀察其對血管內膜增生的影響。方法60只SD大鼠完全隨機化分為未損傷組、單純損傷組、多聚賴氨酸(PLL)組、AMO-miR-146a組、PLL載MPC30-DEA70/AMO-miR-146a復合物(P/M=3：1組和P/M=5：1組)，每組10只。通過光學顯微鏡觀察4周后大鼠頸總動脈組織形態學變化，q-PCR法檢測miR-146a的表達以及應用Western blot法檢測增殖細胞核抗原蛋白(PCNA)、NFκBp65的表達情況。結果蘇木精-伊紅染色，光鏡下顯示，除未損傷組外，單純損傷組、PLL組、AMO-miR-146a組、P/M=3：1組、P/M=5：1組大鼠頸總動脈血管新生內膜有不同程度的增生，而中膜面積無明顯改變；與單純損傷組比較，PLL組、AMO-miR-146a組新生內膜面積差異無統計學意義(P＞0.05)，P/M=3：1組和P/M=5：1組新生內膜面積明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，后兩組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)；q-PCR及Western blot檢測顯示P/M=3：1組和P/M=5：1組miR-146a及目的蛋白PCNA、NFκBp56的表達較未損傷組高，差異有統計學意義(P＜0.05)，但明顯低于單純損傷組、PLL組、AMO-miR-146a組，差異有統計學意義(P?0.05)，而P/M=3：1組和P/M=5：1組組間miR-146a、PCNA、NF κBp56的表達差異無統計學意義(P＞0.05)；單純損傷組、PLL組、AMO-miR-146a組組間miR-146a、PCNA、NFκBp56的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。結論MPC30-DEA70可與AMO-miR-146a絡合，借助PLL進入VSMC，有效抑制球囊損傷后VSMC的miRNA-146a的表達，使PCNA、NFκBp56下調，抑制新生內膜增生，防止血管狹窄。

陽離子磷酸膽堿聚合物；反義寡核苷酸；miR-146a；血管狹窄；基因載體

冠心病已經成為全球主要的死亡原因之一[1]，目前的治療方法主要包括藥物治療、經皮冠狀動脈成形術，支架植入術以及冠狀動脈旁路移植術。藥物涂層支架植入術已經被醫務人員和患者廣泛接受和認可，其降低了早期支架內血栓形成及再狹窄的發生率[2-3]，但仍面臨藥物涂層支架植入后晚期支架內血栓形成、內膜增生等需要迫切解決的問題[4]。研究發現，在球囊損傷再狹窄的動物模型中，miR-146a的表達水平顯著上調[5]，通過基因沉默技術減少血管平滑肌細胞中miR-146a的表達，可以抑制血管平滑肌細胞增殖[6]。陽離子聚合物作為一類易于制備的新型非病毒類轉基因載體，與其他非病毒載體相比，具有結構穩定、性能易于調整、目的基因容量大、合成簡便及良好的生物相容性等優點。故本實驗采用陽離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70作為非病毒載體，建立大鼠頸總動脈球囊損傷模型，通過多聚賴氨酸的粘附將AMO-miR-146a轉入損傷后的大鼠頸總動脈血管壁，探討其對大鼠頸總動脈內膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料健康雄性SD大鼠60只，體質量150～200 g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，普通飼料分籠飼養。RT-PCR試劑盒(Promega，USA)，大鼠miR-146a反義寡核苷酸(蘇州吉瑪生物技術有限公司)，miR-146a莖環引物、5S莖環引物(上海捷瑞公司)，0.1%的PLL(上海生工生物工程公司)，PCNA兔多克隆蛋白抗體(Santa Cruz公司)，Anti-NFκBP65兔單克隆蛋白抗體(Abcam USA)，GAPDH蛋白一抗(北京巴戊德生物技術有限公司)，FITC標記的山羊抗兔IgG (北京中杉金橋科技有限公司)，MPC30-DEA70由中國礦業大學曹希傳博士惠贈，1.25 mm×6 mm球囊導管等介入器材由美敦力公司提供。

1.2 基因球囊的制備取0.1%PLL溶液30 μL，以去離子水稀釋成100 μL，均勻涂抹于球囊導管的球囊表面，后反復吹干備用。取90 μL、150 μL的MPC30-DEA70溶液(1 g/L)分別加入到兩組30 μL的AMO-miR-146a的溶液中，形成P/M比值為3：1、5：1的MPC30-DEA70/AMO-miR-146a復合溶液，室溫下靜置30 min。以去離子水補充體積至200 μL，涂抹于PLL球囊表面，干燥備用。上述操作均在無菌環境中進行。

1.3 動物模型的制備60只SD雄性大鼠隨機化分為6組，即未損傷組、單純損傷組、多聚賴氨酸(PLL)組、AMO-miR-146a組，以及PLL載AMO-miR-146a基因復合物P/M=3：1組與P/M=5：1組，每組10只。未損傷組僅切開分離頸總動脈，不予球囊損傷處理；單純損傷組僅給予球囊損傷；其余各組不僅給予球囊損傷，而且將涂有干預成分的球囊導管送至大鼠頸總動脈損傷血管段。使用3%戊巴比妥鈉按照體重30 mg/kg經腹腔注射麻醉。常規備皮、消毒、鋪巾，沿頸部正中剪開皮膚，鈍性分離筋膜、肌肉等皮下組織，暴露頸總動脈，及其頸內動脈和頸外動脈，長度約1.5 cm。頸內動脈血管近心端給予縫線穿過備用，遠心端結扎，頸總動脈近心段予以血管夾夾閉，用虹膜剪在頸內動脈正中剪“V”型切口，直視下將插入0.014英寸(大約0.355 6 mm)引導導絲的1.25×6 mm美敦力球囊送入大鼠頸總動脈約1 cm，壓力泵給予4 kPa壓力，緩慢回拉球囊至切口處，再次將球囊送至原處，重復上述過程5次后，制作大鼠頸總動脈球囊損傷模型。各干預組均給予涂有干預成分的球囊于損傷處以4 kPa保持10 min，結束后撤出球囊導管及導絲，結扎近心端頸內動脈并逐層縫合及碘伏消毒，普通飼料喂養。所有SD大鼠術后肌內注射青霉素40萬U(2次/d，5 d)以預防感染，普通飼料喂養。

1.4 動物取材每組大鼠飼養48 h后隨機取出7只用3%戊巴比妥鈉經腹腔麻醉，延頸部正中切口逐層分離筋膜與組織，暴露頸總動脈血管，取出頸總動脈局部藥物轉運段血管，將其放入提前預冷并放置肝素水的培養皿中，用無齒鑷小心輕壓管腔，排出管腔內血液并去除管腔上殘留的脂肪組織，用錫紙標記包好放入液氮罐中，48 h后轉移至-80℃冰箱保存，用于提取總蛋白及總RNA。

1.5 組織病理形態檢測術后4周處死大鼠，取轉基因血管段制作病理標本，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察各組內膜增生及血管管腔狹窄程度，采用Image-pro-plus 6.0軟件進行圖像分析，測量新生內膜面積(NIA)、中膜面積(MA)，并計算新生內膜面積(NIA)/中膜面積(MA)面積比。

1.6 q-PCR檢測大鼠頸總動脈miR-146a的表達采用Trizol試劑一步法提取SD大鼠頸總動脈RNA。采用兩步法進行RT-qPCR反應，反轉錄反應：反應體系為RNA 2 μL、miR-146a莖環引物1 μL、5S莖環引物1 μL、Super Pure dNTP 2 μL，RNase-Free ddH2O 8.5 μL；5×First-Strand Buffer(含有DTT)4 μL；RNasin 0.5 μL；反應條件為42℃50 min，95℃5 min。PCR反應：反應體系為：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、cDNA模板2 μL、50×ROX Reference Dye 1 μL、RNase-Free ddH2O 5.8 μL；反應條件：95℃15 min，循環1次；95℃10 s，58℃30 s 72℃32 s，循環40次。miR-146a莖環引物、上下游引物、內參5S等均由上海捷瑞公司設計與合成。結果采用△△Ct值法進行相對定量分析。

1.7 Western blot檢測PCNA、NFκBp56蛋白的表達取各實驗組損傷處轉基因段血管，嚴格按照組織提取試劑盒操作步驟提取總蛋白，應用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白濃度測定，應用Western blot法檢測各組血管PCNA、NFκBp56蛋白的表達情況。利用Image J圖像分析系統對Western blot結果進行灰度分析。

1.8 統計學方法應用Graphpad Prism 5軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，樣本的統計效能＞0.8，計量資料滿足正態性及方差齊性，應用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理形態學改變大鼠頸總動脈采用HE染色，光鏡下觀察，見圖1：除未損傷組(圖1A)外，所有實驗組均呈現不同程度的內膜增生及血管管腔狹窄，中膜未見明顯變化；單純損傷組(圖1B)、PLL組(圖1C)、 AMO-miR-146a組(圖1D)內膜增生明顯，血管管腔明顯狹窄，高倍鏡下可見增生的內膜主要由平滑肌細胞和膠原纖維構成，平滑肌排列紊亂，形態不一(見圖1b、1c、1d)；P/M=3：1組(圖1E)、P/M=5：1組(圖1F)也可見到新生內膜增生，但內膜增生及管腔狹窄程度較單純球傷組、PLL組、AMO-miR-146a組明顯減輕。

2.2 各組新生血管的內膜面積、中膜面積及內中膜面積比較與單純損傷組比較，PLL組、AMO-miR-146a組新生內膜面積差異無統計學意義(P＞0.05)，P/M=3：1組、P/M=5：1組新生內膜面積顯著減少，差異有統計學意義(P?0.05)，而P/M=3：1組、P/M= 5：1組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)；各組中膜面積差異無統計學意義(P=0.756)；與單純損傷組相比，PLL組、AMO-miR-146a組新生內膜/中膜面積比(I/M)差異無統計學意義(P＞0.05)，P/M=3：1組、P/M= 5：1組新生內膜/中膜面積比(I/M)顯著減少，差異有統計學意義(P?0.05)，而P/M=3：1組、P/M=5：1組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

圖1 各組光鏡下頸總動脈病理形態學改變(HE染色)注：A，未損傷組；B，單純損傷組；C，PLL組；D，AMO-miR-146a組；E，P/M=3：1組；F，P/M=5：1組(均×100)。a、b、c、d、e、f為相應的高倍鏡視野(×400)。

表1 各組新生血管內膜面積、中膜面積及內中膜面積的比較(n=3，x-±s)

2.3 q-PCR法檢測球囊損傷后頸總動脈miR-146a的表達與未損傷組比較，大鼠頸總動脈經球囊損傷48 h后，miR-146a的表達顯著升高，差異有統計學意義(P?0.001)；單純損傷組、PLL組、AMO-miR-146a組miR146a的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，表明裸PLL或AMO-miR-146a都不能影響頸總動脈血管平滑肌細胞miR-146a的表達；P/M=3：1與P/M=5：1組較單純損傷組、PLL組、AMO-miR-146a組的miR-146a的表達明顯減少，差異有統計學意義(P ?0.001)，表明MPC30-DEA70/AMO-miR-146a基因復合物借助PLL的粘附作用，可以成功轉染頸總動脈的血管平滑肌細胞，降低miR-146a的表達，見圖2。

圖2 各組頸總動脈miR-146a的表達情況注：1，未損傷組，2，單純損傷組；3，PLL組；4，AMO-miR-146a組；5，P/M=3：1組；6，P/M=5：1組；與未損傷組比較，aP?0.001；與單純損傷組比較，bP?0.001。

2.4 Western blot法檢測球囊損傷后血管壁PCNA與NFκBp56的表達與未損傷組比較，其余各組PCNA與NFκBp56蛋白的表達均明顯升高，差異有統計學意義(P?0.05)，其中PLL載兩種不同復合物P/M=3：1與P/M= 5：1組蛋白表達量升高程度低于單純損傷組、PLL組、AMO-miR-146a組，差異有統計學意義(P?0.05)；P/M= 3：1與P/M=5：1組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)；單純損傷組、PLL組、裸AMO-miR-146a組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖3。

圖3 各組PCNA、NFкBp56蛋白的表達注：1，未損傷組；2，單純損傷組；3，PLL組；4，AMO-miR-146a組；5，P/M=3：1組；6，P/M=5：1組。

3 討論

micro-RNAs(mi-RNAs)是一種內源性的、高度保守的、單鏈非編碼小分子單鏈RNA，通過降解mRNA或抑制mRNA的翻譯水平，從而調控靶基因表達[7-8]。MiR-146是第一個被發現在免疫系統中具有調節作用的miRNA，在固有免疫和炎癥反應中發揮著重要作用，參與了自身免疫性疾病、膿毒血癥、腫瘤等多種疾病的發展[9-10]。在球囊損傷再狹窄的動物模型中也發現miR-146a的表達水平顯著上調[5]。熊瑋等[6]證實了通過基因沉默技術，在血管平滑肌細胞中轉入AMO-miR-146a基因，能夠減少miR-146a的表達，進一步使NFκBp65、PCNA的表達量明顯降低，血管平滑肌細胞增殖減少、凋亡增多。

隨著基因治療的發展和應用，借助基因載體，可將目的基因導入細胞或組織，抑制目的基因的表達，進一步產生特定的生物學效應。陽離子聚合物作為一類易于制備的新型非病毒類轉基因載體，與脂質體及其他非病毒載體相比，具有結構穩定、性能易于調整、目的基因容量大、合成簡便及良好的生物相容性等優點，成為當前基因載體研究方面的熱點。實驗組前期體外實驗已證實新型陽離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70可以安全、有效地負載反義寡核苷酸進入VSMC內并發揮生物學功能[11]。

本研究以陽離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70作為轉基因載體，利用多聚賴氨酸(PLL)涂層球囊將MPC30-DEA70/AMO-miR-146a基因復合物導入大鼠頸總動脈球囊損傷處。結果發現，球囊損傷后頸總動脈內膜增生明顯，光鏡下可見增生的內膜主要由平滑肌細胞和膠原纖維構成，但未見內膜損傷后的附壁血栓形成?？赡艿脑颍菏紫?，球囊損傷后，經過大鼠自身的凝血及纖容系統作用，4周后大鼠頸總動脈內膜損傷處形成的附壁血栓自行消失；其次，病理取材時，取出的頸總動脈，反復用預冷的肝素鹽水沖洗，并用無齒鑷小心輕壓管腔，排出管腔內血液并去除管腔上殘留的脂肪組織，可能會造成附壁血栓的消失。與未損傷組比較，球囊損傷后的各組大鼠頸總動脈均出現不同程度的管腔狹窄，新生內膜面積明顯增加，miR-146a表達增加，同時NFκBp65和PCNA的蛋白表達水平也相應明顯上升。而轉染P/M=3：1和P/M= 5：1基因復合物治療組血管管腔狹窄程度較其余各球囊損傷組有所減輕，新生內膜增生面積減少，miR-146a以及NFκBp65、PCNA的蛋白表達水平相對下降，證明AMO-miR-146a在無MPC30-DEA70的情況下幾乎不能進人血管內膜發揮其作用，而在MPC30-DEA70轉基因載體的作用下，利用PLL提高基因復合物在血管局部停留和轉染時間，即可大量進入VSMC，通過反義作用與靶細胞內特異和互補的mRNA結合，通過某種信號通路，阻止NFκBp65和PCNA蛋白的表達，抑制VSMC增殖，從而緩解頸總動脈的狹窄程度。

經皮冠狀動脈支架植入術是治療冠心病重要的手段之一，但晚期支架內血栓形成、內膜增生的發生率仍然較高[4]。通過藥物球囊與基因沉默技術相結合，以陽離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70作為轉基因載體，利用MPC30-DEA70負載AMO-miR-146a，借助PLL的黏附作用，將MPC30-DEA70/AMO-miRNA-146a基因復合物導入VSMC，有效抑制miR-146a基因表達和VSMC增殖，防止血管狹窄，為一些支架置入患者防止術后再狹窄提供有益的治療措施。

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EffectsofAMO-miR-146acarriedbycationicphosphorylcholinepolymerMPC30-DEA70onrats' neointimal hyperplasia after common arteria carotis balloon.

LI Zhi,LU Yuan,FENG Hui,ZHANG Min,ZHANG Zhuo-qi,WANG Zhi-rong,YANG Yu,XU Wu.
Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221000,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the influence of the delivery of phosphorylcholine copolymer MPC30-DEA70 carrying antisense mediated oligonucleotide miR-146a gene into vascular smooth muscle cells(VSMC) on the degree of neointimal hyperplasia after balloon injury in rats.MethodsA total of 60 rats were randomly divided into six groups as follows：no-injury group,pure balloon injury group,polylysine(PLL)group,AMO-miR-146a group, PLL-carrier P/M=3：1 group and P/M=5：1 group,with 10 rats in each group.The morphological changes of common carotid arteries in rats after 4 weeks were observed by optical microscope.q-PCR method was used to detect the expression of miR-146a,and Western blot was adopted to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen protein(PCNA)and NFκBp65.ResultsExcept for the no-injury group,the other experimental groups showed varying degrees of neointimal hyperplasia and vascular stenosis with HE staining,but the medial area had no significant change.Compared with the pure balloon injury group,the polylysine group and AMO-miR-146a group had no significant difference in new neointima area (P＞0.05);P/M=3：1 group and P/M=5：1 group were reduced significantly(P?0.05),but there was no significant difference between P/M=3：1 group and P/M=5：1 group(P＞0.05).The detection of q-PCR and Western blot methods showed the expressions of miR-146a and the protein expression contents of PCNA and NFκBp56 in the PLL-carrier P/M=3：1 and P/M= 5：1 groups were significant higher than those in the no-injury groups(P?0.05),but significantly lower than those in the pure balloon injury group,polylysine(PLL)group,andAMO-miR-146a group(P?0.05).There was no significant difference be-tween P/M=3：1 group and P/M=5：1 group in the expression of miR-146a,PCNA,NFκBp56(P＞0.05).There was also no significant difference among pure balloon injury group,polylysine group and AMO-miR-146a group on the expressions of miR-146a,PCNA and NFκBp56(P＞0.05).ConclusionMPC30-DEA70 can be integrated with the AMO-miR-146a and get into VSMC with the help of PLL to effectively inhibit the expression of vascular miRNA-146a after the balloon injury,which can make PCNA and NFκBp56 down-regulation and prevent the neointimal proliferation and the hemadostenosis.

MPC30-DEA70;AMO-miR-146a;miR-146a;Hemadostenosis;Gene carrier

R-332

A

1003—6350（2017）11—1724—04

2017-02-25)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.11.002

徐晤。E-mail：xzxuwu@163.com