艾比湖濕地土壤纖維素降解菌篩選及酶活測定

白旭明

摘要：篩選了采自新疆艾比湖濕地的土壤中的纖維素降解菌，并測定了其中具有較高降解效率的8株菌的纖維素酶活。結果表明：經過初篩分離純化后，共得到纖維素降解菌74株菌，屬26個種，篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細菌最多，有14個種，菌株13C12（Bacillus aquimaris）的纖維素酶活最高，濾紙酶（FPase）活為21.4 U/mL，內切葡聚糖酶酶活達37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）為19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為24.6 U/mL，Bacillus aquimaris可嘗試作為工業產酶菌株進行后續試驗。

關鍵詞：艾比湖；纖維素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株

中圖分類號：S182

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）10011304

1 引言

新疆艾比湖濕地國家級自然保護區是中國內陸荒漠物種最為豐富的區域之一，由于其特殊的地理位置，使得該地形成了沼澤、灘涂、鹽湖、沙漠、石漠、礫漠、鹽漠等多種土壤類型。依此而生的土壤微生物資源經歷了長期的進化演變，成為我國干旱區重要的種質基因庫，具有典型性和較高的保護價值[1]。纖維素是地球上最豐富的碳質資源之一，由于難以被大量分解利用，而被人們大量堆積或燃燒，從而對環境造成極大的污染和資源浪費。如果能通過纖維素水解酶轉化利用，必將產生很好的經濟和社會效益[2]。纖維素酶是由一系列酶系組成，濾紙是純纖維素材料，其聚合度和結晶度都比較適中，降解濾紙的濾紙酶（FPase）活性所代表的是纖維素酶的總活力，體現了纖維素酶系內的協同能力。濾紙酶活力的測定主要依據纖維素酶水解濾紙產生還原糖的數量[3]。研究中試圖通過分離和篩選具有較高纖維素酶活性的菌株，為開發具有應用前景的工業菌種做出貢獻。

2 材料與方法

2.1 供試土壤

試驗土壤采自新疆北部艾比湖濕地國家級自然保護區內的蘆葦地和紅柳地。采取距表層0～20 cm土壤約200 g，去除土壤中可見的動植物殘體和石子，用自封袋封裝帶回實驗室，過2 mm篩，立即進行篩菌測酶活。

2.2 實驗方法

2.2.1 纖維素降解菌篩選

稱取1.0 g 土樣到10 mL離心管中，加入無菌水9.0 mL 和幾粒無菌鋼珠，經高速振蕩混勻后靜置，取上清液1 mL稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個濃度梯度。取100 μL涂布于培養基上，30℃ 恒溫倒置培養24 h后，用牙簽挑取形態有差異的單菌落，接種到固體平板培養基上，用于純化后測序鑒定。

另取上清液1 mL加入液體培養基中，恒溫搖床120轉/min，30℃富集三代后，劃線接種在固體培養基上，24 h后，用牙簽挑取形態有差異的單菌落（產外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，產β-葡萄糖苷酶的菌落周圍有黑圈），接種到固體平板培養基上，用于純化后測序鑒定。

注意：液體培養基不加顯色劑和瓊脂。

2.2.2 纖維素酶活測定

（1）濾紙酶（FPase）。取100±0.5 mg濾紙與1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值為4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液l mL，50℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫。

（2）內切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫。

（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纖維素溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫。

（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水楊苷溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫[4]。

酶促反應結束之后，立即加入0.8 mL DNS 試劑，沸水浴5 min之后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容10 mL。在530 nm波長處測定吸光度OD 值，對照葡萄糖標準曲線計算葡萄糖量P。以高溫滅活的粗酶液為對照組。

葡萄糖標準曲線繪制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸餾水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS試劑0.8 mL，混勻后煮沸5 min，取出立即用冷水冷卻，用水定容至10 mL，搖勻，530 nm測吸光度OD值，以OD值為縱坐標，葡萄糖的含量為橫坐標，繪制標準曲線。

酶活定義：底物在一定反應條件（pH值為4.8，50℃，恒溫l h）下，與1 mL粗酶液反應1 min生成1 μg葡萄糖為1個酶活單位（U/mL）。

計算：酶活力（U/mL）=P×K×1000/時間*體積，其中K為稀釋倍數。

2.3 數據處理

利用Excel 2003，Origin 8.0和SPSS 17.0對數據進行統計、分析及繪圖。重復性實驗結果用平均值±標準誤表示。

3 結果與分析

3.1 菌株的篩選結果

采用3種培養基和常規的分離技術對土樣中的纖維素降解菌進行初步篩選，分離。然后對分離的細菌進行16S rRNA測序，獲得序列后，在NCBI進行Blast比對，經過比對的結果如表1。

經過初篩分離純化后，共得到74株菌，屬26個種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細菌最多有14個種。Bacillus是一類好氧或兼性厭氧、能產生抗逆性孢子的桿狀細菌。多數為腐生菌，主要分布于土壤、動植物體表及水體中。由于芽孢桿菌屬的細菌可以產生多種有用代謝產物，芽孢又是菌體度過不良環境的休眠體，因此，在工、農業生產上有較高的應用價值[5]。例如枯草芽孢桿菌是工業上生產淀粉酶、蛋白酶的主要菌種，蘇云金芽孢桿菌用于生產生物農藥，巨大芽孢桿菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillus aquimaris能利用羧甲基纖維素鈉，水解淀粉，耐鹽[6]。Bacillus aryabhattai可以利用纖維二糖，促進植物生長，具有溶磷作用、產植物激素。Bacillus litoralis采自海水淤泥，利用纖維二糖和醋酸纖維素，水解淀粉。Bacillus oceanisediminis具有硝酸鹽還原作用，還能利用纖維二糖、醋酸纖維素。Bacillus firmus能富集鉻、砷，或用于生物修復[7]。Bacillus vietnamensis中等耐鹽、產氧化酶，抗溶菌酶（區別于B.firmus）?？稍趐H值為4.5和9.0的環境生長，不同于B.aquimaris。Altererythrobacter xinjiangensis能水解酪蛋白和纖維素，可利用葡聚糖。Arthrobacter nicotianae降解尼古丁，脫硫，聚磷。Planococcus rifietoensis產纖維素酶、脫氨酶，促進植物生長（固氮，溶磷作用，產吲哚乙酸）[8]。Microbacterium amylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomyces coelicoflavus能降解纖維素，還原硝酸鹽[9]。

3.2 纖維素酶酶活測定

選取其中水解圈較大的8株菌進行纖維素酶活測定（表2）。分別測定了濾紙酶（FPase）、內切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（Avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。

由圖1可知，菌株13C12、03C5、05B2的濾紙酶活顯著高于其它，其中13C12的酶活最高達21.4 U/mL。菌株MZ2、03C9、13C3的酶活次之，約為3.2 U/mL。菌株132和13A4的濾紙酶活最低。

4 結論與討論

（1）經過初篩分離純化后，共得纖維素降解菌到74株菌，屬26個種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細菌最多，有14個種。

（2）菌株13C12的纖維素酶活最高。濾紙酶（FPase）活為21.4 U/mL，內切葡聚糖酶酶活達37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）為19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為24.6 U/mL。

（3）接種量的多少會影響產纖維素酶菌株在發酵液中的生長、代謝和繁殖速度。選擇較大的接種量可以縮短發酵液內菌體密度達到高峰的時間，有利于產物的形成以及培養基質的利用，并減小被雜菌污染的概率。然而接種量過大則會導致發酵液中溶氧不足，限制產物的合成，菌體易老化；接種量過小則會延長發酵周期，影響產率。

（4）由于許多土壤細菌生活力較差，樣本采集回來后應盡快篩菌，否則，擱置時間過長會嚴重影響篩菌的效率和成功率。此外，土壤細菌大多數不可培養，通過傳統篩菌方法篩到的菌落有限，所以探尋新的實驗方法具有重要意義。

致謝：中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室周杰民博士對本實驗方案設計過程中的支持；感謝新疆生產建設兵團第五師農科所的工作人員在采樣過程中的幫助。

參考文獻：

[1]

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[2]Ding S Y， Xu Q， Crowley M， et al. A biophysical perspective on the cellulosome： new opportunities for biomass conversion.[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2008， 19（3）：218～227.

[3]Dashtban M， Maki M， Leung K T， et al. Cellulase activities in biomass conversion： measurement methods and comparison[J]. Critical Reviews in Biotechnology， 2010， 30（4）：302.

[4]Maki M L， Broere M， Leung K T， et al. Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers[J]. International Journal of Biochemistry & Molecular Biology， 2011， 2（2）：146～154.

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[7]崔麗嬌，王 潔，呂應年，等. 湛江沿海潮間帶產胞外纖溶活性酶類海洋真菌的生物多樣性分析[J]. 微生物學通報， 2016， 43（7）：1448～1461.

[8]Imran A. Salt-tolerant PGPR strain Planococcus rifietoensis promotes the growth and yield of wheat （Triticum aestivum L.） cultivated in saline soil[J]. Pakistan Journal of Botany， 2013， 45（6）：1955.