半滑舌鰨潰瘍病原殺鮭氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗

周紅霞，姚俊杰，房文紅，李新蒼，趙 姝，王 元，吳俁學，周俊芳

（1.貴州大學動物科學學院水產科學系，貴陽 550025；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090）

半滑舌鰨潰瘍病原殺鮭氣單胞菌的
分離鑒定與藥敏試驗

周紅霞1，姚俊杰1，房文紅2，李新蒼2，趙 姝2，王 元2，吳俁學1，周俊芳2

（1.貴州大學動物科學學院水產科學系，貴陽 550025；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）是廣受我國消費者認可的名優魚類，具有很高的營養價值和經濟價值，然而，隨著工廠化養殖模式的不斷發展，疾病成為制約半滑舌鰨養殖業健康發展的關鍵因素，其中，體表潰瘍病為其常見病癥。從嚴重潰瘍病半滑舌鰨體內分離到1株優勢菌株HX0416，該菌可在TCBS培養基上生長，并可在綿羊血平板上形成清晰的β-溶血環；經過16S rRNA和rpoD基因序列同源性分析并結合生化特性鑒定為殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）。健康半滑舌鰨幼魚感染試驗表明，該菌對半滑舌鰨具有較強致病性，感染72 h（1.04×106cfu·mL-1）對攻毒魚的致死率達91.7%。藥敏試驗結果顯示，該菌對環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星等喹諾酮類和頭孢曲松、頭孢吡肟等頭孢菌素類藥物比較敏感，而對硫酸新霉素、土霉素等氨基糖苷類和四環素類藥物多重耐藥，尤其是對磺胺甲噁唑、氨芐西林等磺胺類和β-內酰胺類藥物嚴重耐藥。

半滑舌鰨；殺鮭氣單胞菌；潰瘍??；生化特征；藥敏試驗

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）屬鰈形目（Pleuronectiformes），舌鰨科（Cynoglossidae），舌鰨屬，主要分布于我國黃渤海海域。半滑舌鰨生長速度快，營養豐富，味道鮮美，具很高的營養價值和經濟價值，是倍受消費者推崇的名優品種，養殖規模不斷擴大。然而，隨著工廠化、集約化養殖模式的不斷推進，半滑舌鰨病害問題日趨嚴重，臨床常見體表潰瘍病、爛尾病、腹水癥和腸炎病等［1-4］，對半滑舌鰨養殖業造成重大經濟損失。

到目前為止，研究人員已經對半滑舌鰨相關疾病進行了廣泛的探究，但是，由于半滑舌鰨疾病命名的依據主要是臨床表現，而且在養殖生產中常常呈現兩種以上臨床癥狀并存等原因［1］，導致其病原認定存在一定分歧，僅導致半滑舌鰨“潰瘍病”的病原就有多種報道：徐曉麗等［5］從潰瘍病半滑舌鰨體表病灶、肝臟和腎臟分離得到2株優勢菌株，經16S rDNA序列分析鑒定為牙鲆腸弧菌（Vibrio ichthyoenteri）和哈維弧菌（V.harveyi）；陳政強等［6-7］從患有嚴重潰瘍病的半滑舌鰨病灶中分離出4種優勢菌，人工感染后確認其中哈維弧菌和輪蟲弧菌（V.rotiferianus）均為潰瘍病病原；除了弧菌外，還有報道認為半滑舌鰨潰瘍病與美人魚發光桿菌殺魚亞種（Photobacterium damselae subsp.piscicida）［2］和鰻利斯頓菌（Listonella anguillarum）［3］的感染密切相關。本研究從嚴重潰瘍病半滑舌鰨病灶深處分離到1株優勢菌株HX0416，人工感染表明其可導致健康半滑舌鰨幼魚死亡。隨后，本研究利用分子生物學和生化特征鑒定方法對該分離菌株進行了種屬鑒定，并對其藥物敏感性進行了檢測，以期為半滑舌蹋潰瘍病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

江蘇某工廠化養殖（流水養殖模式）的半滑舌鰨發生嚴重的皮膚潰瘍病，本研究采集部分瀕死半滑舌鰨，充氧空運到實驗室；健康半滑舌鰨幼魚（≈48.13 g）購自山東半滑舌鰨養殖戶，充氧空運到實驗室。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與純化

用75%的酒精棉對瀕死半滑舌鰨體表消毒后，從病魚的初期潰瘍點深處截取少量潰爛肌肉，用無菌鹽水沖洗并剪碎，劃線接種于2216E海水細菌培養基（海博），28℃恒溫箱培養24 h，挑取形態特征一致的優勢菌落再次劃線分離，獲得純培養菌株，命名為HX0416。同時，把純化后的菌株接種于TCBS平板（海博）和含5%綿羊血營養瓊脂平板上，28℃恒溫箱培養24 h，觀察菌落顏色及形態特征。

1.2.2 分子鑒定及系統發育分析

挑取少量純化菌株HX0416，參照細菌基因組DNA提取試劑盒（天根）說明書提取細菌基因組DNA，作為PCR模板，分別用下列引物擴增分離菌株的16S rRNA和rpoD基因片段。16S rRNA的引物為：正向27F：5′-AGAGTTTGATC（C／A）TGGCTCAG-3′和反向1492R：5′-TACGG（C／T）TACCTTGTTACGACTT-3′［8］，擴增條件為：95℃預變性5 min；然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環30次；最后72℃延伸10min；rpoD基因的引物為：正向rpoD 70Fs：5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTA-3′和反向rpoD 70Rs：5′-ATAGAAATAACCAGACGTAAGT T-3′［9］，擴增條件為：95℃預變性5 min；然后95℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，循環30次；最后72℃延伸5min。PCR產物直接送上海生物工程有限公司測序，所得序列經BLAST比對分析序列同源性；同時，下載GenBank中相似性較高的菌株16S rRNA序列以及已經報道的鲆鰈類潰瘍病相關病原的16S rRNA序列，采用MEGA 7.0軟件包中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹，并通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數據集為1 000次。

1.2.3 生理生化特征

對純化菌株HX0416進行革蘭氏染色，確定菌的形態特性。然后，參照法國生物梅里埃公司API 20NE試劑條說明書對菌株進行生化鑒定，參考魚類細菌性病原生化特征［10］進一步確定分離菌株的特征；同時，利用梅里埃ATB自動細菌鑒定儀和相應的細菌鑒定卡對其各項理化指標進行分析。

1.2.4 藥敏試驗

采用文獻［11-13］描述的微量肉湯稀釋法測定分離菌株HX0416對16種常用抗菌藥物（表3）的敏感性。以大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株，并設置陽性（無抗生素菌液）和陰性（MH肉湯）對照，將無菌生長的最低藥物濃度視為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.5 健康舌鰨感染實驗

將上述鑒定的純化菌株HX0416接種于含鹽TSB肉湯（TSB+1.5%NaCl）培養，28℃培養24 h后，取1 mL菌液用PBS（0.1 mol·L-1，pH 7.4）作10倍梯度稀釋，得到不同濃度的稀釋菌液（100～109）。根據分離菌生長狀況和預實驗結果，取3個較高稀釋度（107～109）的菌液涂布2216E平板培養，50μL／板，采用平板計數法計數；同時，另取3個較低稀釋度（104～106）的菌液腹腔注射，每個梯度攻毒12 ind，注射量為100μL ·ind-1，對照組注射等量PBS（0.1 mol·L-1，pH 7.4）。試驗組和對照組分別暫養于玻纖桶中（6 ind／桶，2桶／組，桶容積300 L，水量200 L），水溫控制在（21±1）℃。正常投喂顆粒飼料，保持充氧和正常換水，觀察并記錄半滑舌鰨的發病和死亡情況，持續觀察7 d。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

患潰瘍病半滑舌鰨體表、頭部呈現不同大小、潰爛程度不一的潰瘍灶，體表粘液增多，嚴重發病魚創面大且潰爛出血，病魚瀕死（圖1）；背鰭不同程度潰爛，部分魚還有爛尾現象。該病常年都有發生，2～3月發病最為嚴重；不同養殖池和不同時期養殖魚的發病率和死亡率差異較大，嚴重池發病率達90%，死亡率60%。

圖1 患潰瘍病半滑舌鰨Fig.1 A C.sem ilaevis Günther suffering from severe skin ulceration disease

2.2 分離菌特點

潰瘍組織初次在2216E上培養出生長快速、表面光滑、輕微隆起、濕潤、圓形的乳白色優勢菌落。純化菌株可以在TCBS培養基生長，菌落為黃色，直徑約0.2 cm；在綿羊血平板上出現清晰的β-溶血環。革蘭氏染色鑒定為G-短桿菌，命名為菌株HX0416。

2.3 16SrRNA和rpoD基因鑒定

PCR擴增HX0416分離株16S rRNA基因后得到1466bp左右的產物。利用BLAST程序，對測得產物的序列在GenBank中進行同源序列搜索，結果顯示，該分離菌與多種氣單胞菌的同源性均在99%以上，在16S rRNA系統發育樹中與不同種氣單胞菌聚為一簇（圖2），歸在同一分支，而與美人魚發光桿菌殺魚亞種、哈維弧菌、鰻利斯頓菌以及輪蟲弧菌等親緣關系較遠，分屬不同分支，可見，分離菌株HX0416為氣單胞菌屬細菌，但是，僅憑16S rRNA結果不能鑒定到種。

PCR擴增氣單胞菌HX0416菌株rpoD基因后得到860bp左右的產物，對應序列提交GenBank后獲得序列號為MF071282。經過BLAST分析和構建系統發育樹后發現，氣單胞菌HX0416與多株殺鮭氣單胞菌的同源性均在99%以上，與殺鮭氣單胞菌聚為一簇，而與其它種氣單胞菌遺傳距離較遠（圖3），因此，氣單胞菌HX0416分離株應為殺鮭氣單胞菌。

2.4 生化特征分析

利用梅里埃公司API 20NE試劑條和梅里埃ATB自動細菌鑒定儀配套G-細菌鑒定卡獲得HX0416菌株的生化鑒定結果，如表1和表2所示。全面分析各項指標，發現該菌與氣單胞菌的生化特征相似度最高；而且該菌氧化酶陽性、O／129耐受、β-溶血、吲哚試驗陽性、精氨酸雙水解酶陽性、發酵葡萄糖產酸產氣，發酵蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖，且能水解七葉靈等，根據《細菌性魚類病原：養殖和野生魚類疾病》中不同細菌性病原的特征［10］，進一步確認該分離菌株HX0416為氣單胞菌屬的殺鮭氣單胞菌。

圖2 16S rRNA基因序列分析聚類結果Fig.2 Cluster results of 16S rRNA gene sequence

圖3 氣單胞菌rpoD基因序列分析聚類結果Fig.3 Cluster results of rpoD gene of Aeromonas sp.sequence

從表1還可以看到，該菌株只對API 20NE項目中的脲素、癸酸、己二酸、檸檬酸和苯乙酸這5個鑒定項目反應陰性，其它鑒定項目均為陽性，而且具有β-溶血的特點，與殺鮭氣單胞菌各個亞種的生化特性比對［10］，結果顯示，HX0416菌株與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種最為接近。

表1 氣單胞菌菌株HX0416的生化特征Tab.1 Biochem ical characteristics of Aeromonas strain HX0416

表2 氣單胞菌菌株HX0416的其它生化特性Tab.2 Other biochem ical characteristics of Aeromonas strain HX0416

2.5 藥物敏感試驗

所試的16種抗生素中，氣單胞菌菌株HX0416對環丙沙星、氯霉素、美洛培南、頭孢曲松、慶大霉素、頭孢吡肟、恩諾沙星和諾氟沙星等8種抗生素敏感，而對硫酸新霉素、利福平、氟苯尼考、土霉素、氨芐西林、磺胺甲噁唑等6種抗生素具有抗性，尤其是對氨芐西林和磺胺甲噁唑耐藥嚴重（表3）。

2.6 健康舌鰨感染試驗

平板計數法顯示，107稀釋度組每板平均菌落數為52個（50μL／板），因此，107稀釋度組對應菌液濃度為1.04×103cfu·mL-1，104～106稀釋度組對應的菌液濃度為1.04×106～1.04×104cfu·mL-1。氣單胞菌菌株HX0416經腹腔注射半滑舌鰨幼魚36 h后，攻毒魚開始出現死亡，至72 h時，最高濃度組（1.04×106cfu·mL-1）攻毒魚的死亡率已經達91.7%（表4）。

表3 氣單胞菌菌株HX0416對16種抗菌藥物的M IC結果Tab.3 M IC of Aeromonas strain HX0416 to 16 antim icrobial agents

表4 健康半滑舌鰨幼魚感染菌株HX0416后的死亡率Tab.4 M ortality of C.sem ilaevis Günther infected w ith Aeromonas strain HX0416

3 討論

氣單胞菌是水生革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海淡水動物及其環境中，宿主眾多。隨著水產養殖模式向高度集約化發展之勢和養殖環境的日趨惡化，氣單胞菌種類及其所致疾病也隨之逐漸增多。其中，對養殖動物有重要影響的氣單胞菌有嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、維氏氣單胞菌（A.veronii）和殺鮭氣單胞菌等［14-15］，可導致養殖動物腸炎、腹水、潰瘍等多種疾病。其中，嗜水氣單胞菌還是一種典型的人-獸-魚共患病原菌，可致患者腹瀉或其它病原繼發感染［16］，因此，氣單胞菌及其所致疾病受到廣泛重視。

殺鮭氣單胞菌最初從鮭科魚類［17］分離獲得，近年來在鯉科魚類、鲆鰈類等魚［15，18-19］中也有相關報道，以導致感染動物體表疥瘡、潰瘍為主要特征。隨著發病動物和分離菌的增多，該種已有殺鮭亞種（salmonicida）、無色亞種（achromogenes）、殺日本鮭亞種（masoucida）、史氏亞種（smithia）和非典型亞種（atypical）共5個［10］，而且，新的亞種［20］還在不斷增加中：張曉君等［20］從患細菌性敗血癥的石鰈（Kareius bicoloratus）體內分離到一株優勢菌，通過形態特征、理化特性等表觀分類學指征以及16S rRNA系統發育分析，鑒定該分離菌株為殺鮭氣單胞菌，但其與殺鮭氣單胞菌所有已知亞種在生化特性上差異較大，因此，命名為新的亞種——殺鰈亞種（A.salmonicida subsp.flounderacida subsp.nov）。本研究分離的殺鮭氣單胞菌生化特性（API 20NE）與經典殺鮭亞種［10］非常接近，但是，也存在少數生化特征的差異：經典殺鮭亞種不能分解色氨酸（TRP），且不能利用阿拉伯糖（ARA）和甘露糖（MNE），而本研究分離的殺鮭氣單胞菌菌株HX0416不僅能分解色氨酸產生吲哚，而且既能利用阿拉伯糖又能利用甘露糖。我們推測，造成這種差異的原因可能是由于生存環境改變、宿主動物種屬差異等致使病原自身的某些生物學特性發生了輕微變化。

由于分離菌株的生化特征常常與經典菌株不完全相同［3，5］，因此，隨著分子生物學的迅速發展，基因水平的分子生物學鑒定方法被廣泛應用于細菌種屬的鑒定中。由于細菌16S rRNA基因序列在系統發育過程中高度保守而最先被廣泛用于細菌的種屬鑒定，但是，在應用過程中越來越多的研究發現，16S rRNA基因序列在某些細菌屬內高度保守，以致不能有效鑒別細菌的不同種或亞種［6，20］，因此，目前分離菌株的鑒定常常采用生化特征分析與基因鑒定相結合的方法，相互印證［3，5-6，21］。本研究結合16S rRNA、rpoD基因系統發育分析以及氣單胞菌及其種和亞種的生化特征、菌落特點等經典分類學指征，最終將分離菌株HX0416鑒定為殺鮭氣單胞菌，并與殺鮭亞種最為接近。從該菌的16S rRNA系統發育分析中，我們發現，菌株HX0416與前期報道的半滑舌鰨潰瘍相關病原菌——美人魚發光桿菌殺魚亞種、哈維弧菌、鰻利斯頓菌以及輪蟲弧菌等不在同一個大的分支，親緣關系較遠。造成這種潰瘍病相關病原種類較多的原因，我們認為主要有以下兩種：1）不同養殖環境以及不同抗菌藥物的使用可能導致不同養殖場出現不同的優勢菌種，這些不同的菌種有可能導致同樣的潰瘍癥狀，而半滑舌鰨疾病命名的依據主要是其臨床癥狀（如潰瘍?。?，因此，同為“潰瘍病”卻有多種病原菌。2）半滑舌鰨養殖生產中常常存在兩種以上臨床癥狀并存的情況，比如有些潰瘍病也存在腹水的癥狀［5-7］，有些腹水病也存在爛尾的情況［3］等，細菌或其它病原的并發與繼發可能導致了優勢病原種屬的差異。因此，除了建議盡可能從病原角度進行疾病命名外［22］，本研究認為這些研究并不矛盾，這些病原對半滑舌鰨的健康養殖均具有重要影響，均為半滑舌鰨養殖過程中需要重點關注的病原。

本研究對分離菌株HX0416的藥敏試驗顯示，雖然該殺鮭氣單胞菌對喹諾酮類和頭孢菌素類的多種藥物比較敏感，但是對氨基糖苷類、四環素類藥物多重耐受，尤其是對β-內酰胺類和磺胺類藥物嚴重耐受，胡夢華等［23］在研究海水副溶血弧菌時也發現了類似耐藥現象。這些結果既說明同為海水來源菌可能攜帶了類似的耐藥基因／質粒［24-26］，但也可能像YI等［27］指出的那樣，我們在養殖生產中藥物使用的頻繁與偏好導致了耐藥的累積與傳播?？傊?，本研究結果表明，在半滑舌鰨養殖過程中存在多種病原感染、致病的情況，在疾病防治過程中要加強綜合管理，注重用藥的針對性和科學性，避免多種病原并發或繼發感染，嚴防耐藥菌的產生與傳播。

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Isolation and identification＆antim icrobial susceptibility test of Aeromonas salmonicida associated w ith the skin ulceration disease of Cynoglossus sem ilaevis Günther

ZHOU Hong-xia1，YAO Jun-jie1，FANGWen-hong2，LIXin-cang2，ZHAO Shu2，WANG Yuan2，WU Yu-xue1，ZHOU Jun-fang2
（1.Department of Fisheries Science，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.East China sea Fisheries Research Institute，CAFS，Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，Shanghai 200090，China）

Cynoglossus semilaevis Günther is known as a famous fish in China for its high nutritional and economic value.However，with the continuous development of factory farmingmodel，diseases have become the key factor to restrict the healthy development of Cynoglossus semilaevis Günther aquaculture，and skin ulceration disease was themost common one.In this study，one dominant strain HX0416 was isolated from Cynoglossus semilaevis Günther with severe skin ulceration disease.The bacterium could grow well on the TCBS agar and form the obvious beta hemolytic ring on the sheep blood agar.Analysis of16S rRNA and rpoD gene sequence combined with biochemical characteristics demonstrated that the isolate HX0416 was Aeromonas salmonicida.Animal infection experiment showed that the strain was pathogenic to Cynoglossus semilaevis Günther.When the concentration of bacterium was 1.04×106cfu／mL，about91.7%juvenile fishes died at 72 h after infection.Antimicrobial susceptibility tests indicated that strain HX0416 was sensitive to quinolones and cephalosporins such as ciprofloxacin，enrofloxacin，norfloxacin，ceftriaxone and cefepime，while resistant to aminoglycosides and tetracyclines such as neomycin sulfate and oxytetracycline，and severely resistant to both sulfonamides andβ-lactams such as sulfamethoxazole and ampicillin.

Cynoglossus semilaevis Günther；Aeromonas salmonicida；skin ulceration disease；biochemical characteristics；antimicrobial susceptibility test

Q 93-331

A

1004-2490（2017）03-0322-09

2017-03-19

公益性行業（農業）科研專項（201303047）；國家自然科學基金（31372550）

周紅霞（1989-），女，碩士研究生，研究方向為水產動物繁殖與發育生物學。

周俊芳，副研究員。Tel：021-65699301，E-mail：zhoujf＠ecsf.ac.cn