黃桷樹葉總黃酮提取物對A549細胞的保護作用研究

汪 洋，胡 魁，陳 玲，蘇 燕，馬佳卉，肖 虹，白群華△

(1.重慶醫科大學實驗教學中心，重慶 401331 ；2.廣東省工傷康復醫院職業健康檢查科，廣州 510970；3.重慶醫科大學公共衛生與管理學院，重慶 400016；4.重慶醫科大學10級預防醫學，重慶 400016；5.重慶醫科大學公共衛生與管理學院衛生檢驗教研室，重慶 400016)

論著·基礎研究

黃桷樹葉總黃酮提取物對A549細胞的保護作用研究

汪 洋1，胡 魁2，陳 玲1，蘇 燕3，馬佳卉4，肖 虹5，白群華5△

(1.重慶醫科大學實驗教學中心，重慶 401331 ；2.廣東省工傷康復醫院職業健康檢查科，廣州 510970；3.重慶醫科大學公共衛生與管理學院，重慶 400016；4.重慶醫科大學10級預防醫學，重慶 400016；5.重慶醫科大學公共衛生與管理學院衛生檢驗教研室，重慶 400016)

目的 探索黃桷樹葉總黃酮的提取和初步了解提取物是否具有細胞損傷的保護作用，為黃桷樹葉藥用價值的研究提供依據。方法 采用乙醇浸提法，提取黃桷樹葉中的總黃酮，以蘆丁為標準計算提取效率。以魚藤酮誘導A549A549人肺腺癌細胞損傷為模型，研究提取物對細胞活力、細胞形態、活性氧的產生、凋亡率的影響作用。結果 對黃桷樹葉中的總黃酮，60%的乙醇的提取效率為5.02%；提取物32 mg/L可明顯抑制100 μg/L魚藤酮誘導的細胞活力的降低、細胞形態的改變、活性氧的產生和凋亡。結論 乙醇浸提法能用于提取黃桷樹葉中的總黃酮；提取物具有保護魚藤酮誘導的A549細胞損傷的作用；黃桷樹葉具有進一步研究開發其藥用價值的潛力。

黃桷樹葉；總黃酮提取物；A549人肺腺癌細胞；活性氧；細胞凋亡

黃桷樹(又名黃葛樹、馬尾榕)屬高大落葉喬木，為?？崎艑僦参?，原產我國華南和西南地區，尤以重慶、四川、湖北等地最多?！度珖胁菟巺R編》和《中華本草》中有記載黃桷樹的根、葉均可入藥。但現代對黃桷樹的藥用價值研究不多，尚無對其藥效進行系統科學的研究報道[1-3]。黃酮類化合物是榕屬植物的重要藥用成分[1]?，F代研究表明，黃酮類化合物具有抗自由基、抗衰老、抗癌及降壓、降血脂、抗心律失常、抗骨質舒松等多種藥理作用,并且黃酮類化合物多安全、無毒，使其在醫藥、食品領域具有廣闊的應用前景[4]。為了研究黃桷樹葉黃酮類化合物存在的情況，本文利用乙醇浸提法提取了黃桷樹葉黃酮類化合物。魚藤酮是常用的殺蟲劑，是線粒體復合酶1阻斷劑，可對A549人肺腺癌細胞(A549細胞)造成氧化損傷[5-6]。為了研究所提取得黃桷樹葉提取物的藥效，作者初步測定了所得黃桷樹葉提取物對魚藤酮所致A549細胞氧化損傷的保護作用。本研究結果表明，乙醇浸提法可用于提取黃桷樹葉黃酮類化合物，且所得提取物對魚藤酮導致的A549細胞的活性氧(ROS)的產生和凋亡具有抑制作用，可能具有抗細胞氧化損傷的藥理作用，值得進一步研究開發?，F將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 黃桷樹葉，5月初采于重慶醫科大學校內；A549細胞來源于重慶醫科大學基礎醫學院細胞與分子生物教研室；DMEM高糖培養基和胎牛血清購自美國GIBCO公司；胞內活性氧(ROS)熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-DCFH-DA)購于碧云天生物技術研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司；MTT、DMSO購自sigma公司；其他試劑全部為分析純，購于商業試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 黃桷樹葉黃酮化合物的提取 將新采集的黃桷樹葉洗凈、晾干、剪碎后，于真空冷凍干燥機-20 ℃以下干燥3 h，再打成粉，置于廣口瓶中，干燥保存備用。稱取黃桷樹葉粉末25.0 g 4份，分別以500 mL的50%、60%、70%、80%乙醇于磁力加熱攪拌器上60 ℃提取3 h。所得提取液先用3層紗布粗過濾，再用三氯甲烷與粗濾液以1∶3的比例萃取2次，去掉下層綠色液體，得上層黃色液體。然后再調節萃取液的pH為5.0，加硅藻土，攪拌并沉降后，于3 500 r/min，離心1 h，取上清液為提取液。提取液于真空冷凍干燥機中，先于常溫下抽真空揮去乙醇和三氯甲烷，再于-50 ℃，20 Pa以下抽真空除去水分，約10 h，得到棕黃色固體產物。

1.2.2 提取物總黃酮的測定 將提取物用甲醇溶解后，以蘆丁為標準，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法對總黃酮進行定量[7]，即在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下,黃酮類化合物可與鋁鹽生成螯和物,在510波長有穩定特征吸收峰，通過比色而定量提取液中的總黃酮水平。蘆丁標準曲線的繪制：蘆丁以甲醇溶解，配制為100 mg/L標準溶液；分別吸取蘆丁標準溶液0.00、0.80、1.60、2.40、3.20、4.00、4.80 mL于10.00 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，靜置6 min，再加10%硝酸鋁0.5 mL，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉4.00 mL，甲醇定容后，靜置10 min，于510 nm測吸光度。

1.2.3 A549細胞魚藤酮損傷模型的建立 A549細胞在含100 mL/L的胎牛血清及100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的完全IMDM培養基中，在37 ℃，50 mL/L的CO2孵箱中常規培養，當細胞達到對數生長期時傳代。A549細胞以每孔3 000個接種于96孔培養板中，培養16 h貼壁后，進行藥物處理。魚藤酮與黃桷樹葉提取物以DMSO溶解后，用IMDM培養基稀釋成相應濃度處理細胞，根據MTT實驗結果選擇最佳的魚藤酮和黃桷樹葉提取物的干預濃度。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(MTT法) A549細胞以每孔3 000個接種于96孔培養板中，培養16 h貼壁后，進行藥物處理。黃桷樹葉提取物和魚藤酮單獨或共同作用于細胞48 h，然后吸掉培養液，換為含5 g/L MTT的完全培養液100 μL，37 ℃繼續孵育4 h，小心吸去上清液，加150 μL 的DMSO，振蕩10 min，在酶標儀上用490 nm 波長測定吸光度(A)值，以空白對照組為標準計算細胞活力。公式為：細胞存活率(%)=藥物處理組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%。

1.2.5 細胞形態的觀察 A549細胞以每孔3 000個接種于96孔培養板中，培養16 h貼壁后，進行藥物處理。黃桷樹葉提取物和魚藤酮單獨或共同作用于細胞48 h，然后，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.2.6 細胞內ROS測定 A549細胞接種于6孔培養板，細胞數6×106個/孔。藥物處理到預定時間后，去除培養液，以PBS(pH 7.4)洗2次，每孔加入1 mL的ROS熒光探針DCFH-DA (20 μmol/L)，37 ℃孵育1 h，以PBS(pH 7.4)洗3次，收集細胞用流式細胞儀分析細胞的熒光強度量。

1.2.7 流式細胞儀測定細胞凋亡 A549細胞接種6孔板，細胞數6×106個/孔。藥物處理到預定時間后，收集細胞，按細胞凋亡測定試劑盒說明書操作處理細胞，用流式細胞儀雙標法分析分析細胞的熒光強度。

2 結 果

2.1 黃桷樹葉黃酮類化合物的乙醇浸提 提取物中總黃酮的含量以蘆丁為標準品，以標準曲線定量。蘆丁標準曲線的配制按“材料方法”中的描述，其回歸方程：A=1.225 4C+0.045 46；r=0.999 6，如圖1。

圖1 蘆丁濃度-吸光度標準曲線

25 g黃桷樹葉粉末分別經50%、60%、70%、80%乙醇溶液提取后，經萃取、絮凝、離心后，分別得到約400 mL提取液，定容至500 mL后，各取1 mL，加9 mL甲醇稀釋后，取1 mL以蘆丁定量提取物總黃酮，并計算總黃酮的提取效率，見表1。

表1 不同濃度乙醇對黃桷樹葉黃酮的提取效率

由以上結果得知，60%的乙醇的提取效率最高，為5.02%。然后將60%乙醇提取的提取液經真空冷凍干燥，最終得到2.61 g固體提取物，此提取物的總黃酮的百分含量為43.4%，用于以下藥效活性的初步測定。

2.2 黃桷樹葉提取物與魚藤酮對A549細胞活力與形態的影響 為了建立有效的實驗模型，首先分析黃桷樹葉提取物和魚藤酮在實驗條件下對細胞活力的直接影響，以排除提取物的細胞毒性對模型的干擾作用，以及初步確定魚藤酮對A549細胞活力的損傷作用，并分析了提取物對魚藤酮的細胞活力損傷是否具有保護作用。細胞活力的測定采用MTT法。A549細胞損傷時，在形態上也有明顯的變化，表現為空泡增多和細胞收縮、變圓、不貼壁。因此，提取物和魚藤酮在實驗條件下對細胞損傷的影響還可通過細胞形態的變化進行初步判斷。見圖2、3。

2.2.1 提取物對A549細胞活力的影響 固體提取物以DMSO溶解，以8、16、32、64、128 mg/L不同濃度處理A549細胞48 h，其中8、16、32 mg/L濃度處理的細胞活力與DMSO對照組及空白對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，而64、128 mg/L濃度處理可明顯導致細胞活力的降低，細胞活力分別降為對照組的0.61±0.15(P<0.05)和0.30±0.12(P<0.05)，見圖2A。說明在實驗條件下，提取物濃度在8～32 mg/L范圍對A549細胞無明顯的細胞毒活性，以下試驗均在此藥物濃度范圍內進行。

CON：空白對照；DMSO：DMSO對照；H8～H128：提取物8～128 mg/L處理；R10～R200：魚藤酮10～200 μg/L處理；*：P<0.05，與空白對照比較；##：P<0.05，與魚藤酮(100 μg/L)處理比較。

圖2 提取物與魚藤酮處理對細胞活力的影響

CON：空白對照；DMSO：DMSO對照；H8～H32：提取物8～32 mg/L處理；R100：魚藤酮100 μg/L處理。

圖3 提取物與魚藤酮處理對細胞形態的影響

2.2.2 魚藤酮對A549細胞活力的影響 魚藤酮以DMSO溶解，以10、100、200 μg/L不同濃度作用于A549細胞。結果顯示，10 μg/L濃度處理48 h后，細胞活力與DMSO對照組及空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，而100、200 μg/L濃度處理48 h可明顯導致細胞活力的降低，細胞活力分別降為空白對照組的(0.68±0.14)倍(P<0.05)和(0.55±0.13)倍(P<0.05)(圖2B)。由于200 μg/L濃度的魚藤酮使細胞活力降低較為嚴重，以下試驗均以100 μg/L的魚藤酮建立A549損傷模型，以利于觀察提取物的保護作用。

2.2.3 提取物對魚藤酮導致的A549細胞活力損傷的影響 為了觀察提取物對魚藤酮導致的A549細胞活力的損傷是否具有保護作用，以魚藤酮100 μg/L單獨或同時與提取物8～32 mg/L作用48 h后，測定細胞活力。實驗結果顯示(圖2C)，魚藤酮100 μg/L單獨作用時，細胞活力降低至空白對照的(0.65±0.09)倍(P<0.05)；當同時與提取物8、16 mg/L作用時，則細胞活力與魚藤酮100 μg/L單獨作用時無明顯差異；而同時與提取物32 mg/L作用時，則細胞活力增加，為空白對照的(0.88±0.12)倍(P<0.05)。結果提示，提取物32 mg/L對魚藤酮導致的A549細胞活力損傷具有保護作用。

2.2.4 提取物及魚藤酮對A549細胞形態的影響 提取物(8～32 mg/L)及魚藤酮(100 μg/L)單獨或同時處理A549細胞48 h，對其形態的影響見圖3。結果顯示，與對照相比，提取物單獨作用時，濃度在8、16、32 mg/L時，對A549細胞形態無明顯影響；而魚藤酮100 μg/L單獨作用時可明顯導致細胞收縮變圓數量增多，細胞數量減少。當100 μg/L魚藤酮同時加用提取物處理細胞時，提取物8、16 mg/L的濃度對魚藤酮導致的細胞形態的變化無明顯影響，而32 mg/L的濃度可明顯減少細胞的收縮變圓，并使細胞的數量增多。結果提示，提取物32 mg/L對魚藤酮100 μg/L導致的A549細胞形態的損傷具有保護作用。

2.3 提取物對魚藤酮導致A549細胞ROS產生的影響 魚藤酮阻斷細胞線粒體復合酶Ⅰ的電子傳遞，可導致大量ROS的產生，從而造成A549細胞活力的降低和形態的變化。為了測定提取物是否可以通過抑制ROS的產生而起保護魚藤酮的細胞損傷作用，本研究利用ROS熒光探針和流式細胞儀計數，測定了提取物(8～32 mg/L濃度)對魚藤酮100 μg/L導致的A549細胞內ROS的產生的影響。實驗結果顯示(圖4)，魚藤酮作用48 h可導致細胞內ROS濃度增加至空白對照的(3.9±0.5)倍(P<0.01)；魚藤酮分別和8、16 mg/L的提取物同時處理細胞時，ROS的產生量與魚藤酮單獨作用時無明顯差異；而當同時使用32 mg/L提取物時，則ROS的產生量較魚藤酮單獨作用明顯降低，為空白對照的(2.3±0.4)倍(P<0.05)。結果說明，提取物對魚藤酮誘導的A549細胞內ROS的產生具有抑制作用。

2.4 提取物對魚藤酮導致A549細胞凋亡的影響 當細胞發生嚴重損傷時，即可發生凋亡。細胞內ROS大量產生導致的氧化損傷是發生凋亡的重要原因。因此，提取物可能通過抑制細胞中ROS的產生而抑制魚藤酮導致的細胞凋亡。為了驗證提取物是否對魚藤酮導致的A549細胞凋亡具有影響，本研究分別用魚藤酮100 μg/L或同時加用黃酮提取物8～32 mg/L處理細胞48 h，用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。實驗結果顯示(圖5)，與空白對照組相比，魚藤酮處理48 h可導致細胞的凋亡率由(5.4±0.9)%增加至(14.7±1.1)%(P<0.01)；而魚藤酮同時加提取物處理時，加8、16 mg/L提取物對凋亡無明顯影響，而加32 mg/L的魚藤酮可導致凋亡率降低至(10.72±1.4)%(P<0.05)。結果提示，提取物對魚藤酮誘導的A549細胞凋亡具有抑制作用。

A：空白對照；B：魚藤酮(100 μg/L)處理；C：魚藤酮(100 μg/L)與提取物(32 mg/L)處理；D：總趨勢圖，細胞內 ROS平均熒光強度(空白對照組的倍數)；##：P<0.01，與空白對照；*：P<0.05，與魚藤酮處理比較；CON:空白對照；R100:魚藤酮100 μg/L;R100+H8：魚藤酮100 μg/L+提取物8 mg/L；R100+H16:魚藤酮100 μg/L+提取物16 mg/L；R100+H32:魚藤酮100 μg/L+提取物32 mg/L。

圖4 提取物對魚藤酮誘導A549細胞內ROS產生的影響

A：空白對照；B：魚藤酮(100 μg/L)處理；C：魚藤酮(100 μg/L)與提取物(32 mg/L)處理；D：總趨勢圖。##：P<0.01，空白對照比較；*：P<0.05，與魚藤酮處理比較；CON:空白對照；R100:魚藤酮100 μg/L;R100+H8：魚藤酮100 μg/L+提取物8 mg/L；R100+H16:魚藤酮100 μg/L+提取物16 mg/L；R100+H32:魚藤酮100 μg/L+提取物32 mg/L。

圖5 提取物對魚藤酮誘導A549細胞凋亡的影響

3 討 論

在本文的初步研究當中，證實黃桷樹葉含有較多量的黃酮類成分，60%乙醇的提取效率達到5.02%，提取方法可進一步研究和改進。黃酮類化合物種類繁多，理化性質也存在著較大的差異[4]。其中黃酮苷元一般難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑，易溶于稀堿液。黃酮類化合物的羥基糖苷化后，水溶性相應加大，而在有機溶劑中的溶解度相應減少。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶劑，難溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有機溶劑。黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。本次實驗僅提取黃桷樹葉中粗黃酮，采用三氯甲烷進行萃取，雖然能夠除去其油性雜質但同時卻使部分可溶于有機溶劑中的黃酮苷元進入有機相而損失。本文所得到的僅為易溶于水的無機相黃酮苷。故黃酮類成分可能有較大損失。在進一步的研究當中，可以將乙醇浸提液濃縮后，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等萃取，每個萃取部分所得到的萃取物再進行分離純化，使黃酮類成分的損失減少[8]。另外，乙醇浸提的條件也需要進一步優化。文獻顯示，乙醇的濃度是影響黃酮類浸提效率的重要的因素[9-10]，故本文比較了50%、60%、70%、80%的乙醇提取效率，發現60%的乙醇提取效率是最優的。但是，提取的溫度、時間、超聲的頻率、時間也可對提取效率有一定的影響[8,11]，故需在進一步的研究中優化。

黃桷樹為榕屬植物，現有的研究表明，本屬植物的化學成分多樣，近年來從本屬植物中共分離得到47個三萜化合物、14個黃酮類化合物、4個倍半萜、15個香豆素、16個生物堿以及木脂素、甾醇、脂肪烴、有機酸、高級脂肪酸酯、芳香化合物、氨基酸、維生素、糖等化合物[1]，但對其大部分的成分的藥理活性的研究還不多。至今已從本屬植物中分離到降糖、降血壓、抗腫瘤、抗菌、抗瘧的成分[1]，近來在本屬植物中還分離到具有治療腹瀉、關節炎和抑制細胞凋亡的成分[12-14]。但對黃桷樹葉中的藥效成分還未見研究報道。而本文的初步研究結果表明，黃桷樹葉中含有較高濃度黃酮類，且得到的含黃酮的提取物具有抑制魚藤酮誘導A549細胞ROS的產生和凋亡的作用。細胞中ROS的產生是導致細胞氧化損傷的重要因素；而細胞的氧化損傷和凋亡是細胞和組織在各種不良因素，如炎性細胞因子、缺血缺氧、線粒體損傷、能量障礙等作用下發生損傷和衰老的重要機制[15]。因此，黃桷樹葉中可能含有能保護細胞氧化損傷的有效成分，可能在抗衰老、抗炎性損傷等方面發揮藥效作用，值得進一步研究開發。但本文所用的提取物為混合物，除黃酮類外，還含有多種其他成分。在進一步研究當中，應當結合多種分離純化方法，得到高純度的成分，再進行進一步的藥理活性研究，以確認抗氧化損傷和抗凋亡的藥效成分，并進行進一步的藥效機制的研究，為開發黃桷樹葉的藥用價值打下基礎。

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Protective effects of total flavonoids extraction from ficus lacor leaves on A549 cells*

WangYang1,HuKui2,ChenLing1,SuYan3,MaJiahui4,XiaoHong4,BaiQunhua4△

(1.ExperimentalTeachingCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China;2.DepartmentofOccupationalHealthExamination,GuangdongProvincialHospitalofOccupationalInjuryRehabilitation,Guangzhou,Guangdong510970,China;3.PostgraduateStudentofMaster,Grade2014,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;4.TeandResearchingSectionofHealthInspection,PreventiveMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;5.TeandResearchingSectionofHealthInspection,SchoolofPublicHealthandManagement,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To investigate the extraction method of total flavonoids from the leaves of ficus lacor and the protective effects of extraction on the cellular damage to provide a basis for the research on the phamaceutical value of ficus lacor leaves.Methods The ethanol extraction method was adopted to extract the total flavonoids in the leaves of ficus lacor and the extraction efficiency was calculated with rutin as the standard.The rotenone induced human lung adenocarcinoma cellular damage served as the model,then the influences of the extraction on the cellular viability,cellular morphology,production of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis were researched.Results The extraction efficiency of total flavonoids in the leaves of ficus lacor by 60% ethanol was 5.02%;the extraction at the concentration of 32 mg/L could significantly inhibit the decrease of cell viability,cellular shape change,ROS production and apoptosis of A549 cells induced by 100 μg/L rotenone.Conclusion The ethanol extraction method can be used to extract the total flavonoids in the leaves of ficus lacor and the extraction has the protective effects on the A549 cellular damage induced by rotenone,the leaves of ficus lacor have the potential for further researching its pharmaceutical value.

leaf of Ficus Lacor;total flavonoids extraction;A549 human lung adenocarcinoma cell;reactive oxygen species;cell apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.006

重慶市科委前沿與應用基礎研究計劃項目基金(cstc2014jcyjA10019)；重慶醫科大學大學生科學研究與創新項目基金(201306)；重慶市創新創業計劃項目(201310631007)。 作者簡介：汪洋(1970-),博士，副教授，主要從事遺傳毒理研究?！?/p>

，E-mail:1253811562@qq.com。

R961

A

1671-8348(2017)16-2178-05

2017-01-16

2017-03-20)