加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定畜禽糞便堆肥過程中磺胺及其代謝產物的殘留量

王德全，何思遠，宋偉明，劉萬毅，孟 哲*

(1.寧夏大學土木與水利工程學院，銀川750021;2.寧夏大學化學化工學院，銀川750021)

加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定畜禽糞便堆肥過程中磺胺及其代謝產物的殘留量

王德全1，何思遠1，宋偉明2，劉萬毅2，孟 哲2*

(1.寧夏大學土木與水利工程學院，銀川750021;2.寧夏大學化學化工學院，銀川750021)

畜禽糞便堆肥樣品經加速溶劑萃取及Oasis HLB固相萃取柱凈化進行色譜分離，以Waters Acquity BEH C18色譜柱為分離柱，以不同體積比的0.1%(體積分數)甲酸甲醇溶液和0.1% (體積分數)甲酸-水溶液的混合液為流動相進行梯度洗脫。質譜分析中，采用電噴霧正離子源多反應監測模式檢測?；前芳捌浯x產物在一定的質量濃度范圍內與其峰面積呈線性關系，方法的檢出限(3S/N)在0.5～5.0μg·L－1之間。以空白樣品為基體進行加標回收試驗，所得回收率在67.3%～105%之間，測定值的相對標準偏差(n=6)在4.5%～15%之間。

超高效液相色譜-串聯質譜法;磺胺;畜禽糞便;堆肥過程;加速溶劑萃取

規?；B殖所造成的污染一直是農村面源污染的重要因素，大部分畜禽養殖場的畜禽糞便不經堆肥等綜合處理就直接施于農田，或隨污水、雨水進入水體。家禽的耐藥性隨著抗生素藥物的經常性使用而不斷地加強，導致用藥量不斷加大，畜禽排出糞便殘留的抗生素及其代謝物或攜有抗體基因的抗生素等污染物也隨之增加。這些殘留的抗生素及其代謝物會被動植物吸收，最終被人們食用而影響人體健康［1-2］。研究表明，在動物體內各類抗生素去除的路徑主要是家畜的尿液［3］，而尿液吸附在固體的糞便上，因此當前收集的固體肥料為含有抗生素及其代謝物的尿液和糞便混合形成的。堆肥作為一種將糞便資源化的優良傳統方法，有效降解或去除畜禽糞便中抗生素的研究已有報道［4-5］。據2009年中國抗生素藥物市場結構報告顯示，磺胺類藥物的使用與其他常用抗生素相比處于較高水平，尤其在畜禽糞便中磺胺甲噁唑的檢測率較高［6］。殘留的磺胺甲噁唑對土壤微生物及微生物群落均有顯著的抑制作用［7］。

由于養殖場在動物生長的不同周期使用的抗生素種類及劑量不同，因此，對糞便中可能殘留的多種抗生素及其典型生物標志物的同時測定尤為重要。采用液相色譜-質譜法同時測定磺胺類及其代謝物的研究報道更多集中于動物源食品［8-9］，而對動物糞便中磺胺類測定的研究報道較少［4，10-11］，尤其對畜禽糞便或堆肥中殘留的磺胺類重要生物標志物乙酰代謝物的測定鮮見報道。由于畜禽糞便或堆肥的基質很復雜，殘留代謝物的提取及檢測難度較大。與傳統的樣品前處理過程相比，加速溶劑萃取通過提高溫度和增加壓力來減弱基質與被分析物間的作用力，加快被分析物從基質中解析并快速進入溶劑中，從而提高萃取的效率［12-13］。本工作結合加速溶劑萃取-固相凈化的方法處理樣品，采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)測定堆肥基質中磺胺類及其代謝產物殘留量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity Xevo TQ型超高效液相色譜儀，配Waters Xevo TQ三重四極桿質譜儀;Thermo ASETM350型快速溶劑萃取儀:H2100R型臺式高速冷凍離心機;RE-2000A型旋轉蒸發器;ND100-1型氮吹儀;Waters Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL);0.22μm聚四氟乙烯膜。

磺胺及其代謝物混合標準儲備溶液:100 mg· L－1(包括1 000 mg·L－1代謝物)，分別稱取磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲噁唑(SMX)標準品0.01 g和N-乙?；前粪奏?N-ASDZ)、N-乙?；前芳奏奏?NASMR)、N-乙?；前范奏奏?N-ASMZ)和N-乙?；前芳讎f唑(N-ASMX)標準品0.1 g，用甲醇定容至100 mL。使用時稀釋至所需質量濃度，4℃下密封保存，現配現用。

甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，其他試劑為分析純，試驗用水為三重水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件Waters Acquity BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm);柱溫40℃;樣品池溫度10℃，進樣量5μL;流量0.4 mL·min－1。流動相A為0.1%(體積分數，下同)甲酸甲醇溶液，B為0.1%(體積分數，下同)甲酸溶液。梯度洗脫程序: 0～3 min時，A為8%;3～4 min時，A由8%升至40%;4～5 min時，A由40%升至100%;5～5.1 min時，A由100%降至8%，保持2 min。

2)質譜條件電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，離子源溫度150℃;毛細管電壓3.0 kV;脫溶劑溫度500℃;脫溶劑氣為氮氣，流量900 L· h－1;碰撞氣為氦氣，流量0.18 mL·min－1。采用多反應監測模式(MRM)，掃描時間間隔為0.05 s。其余質譜參數見表1，其中“*”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 堆肥試驗

堆肥試驗采用自然通風的靜止堆肥技術，將6 m3的新鮮豬糞平均分成兩堆，體積為3 m×2 m× 1 m。待堆溫升至50℃后每隔1 d翻堆一次，進入二次腐熟期后停止翻堆。前25 d為一次堆肥期，第25～50 d為二次堆肥期。

1.3.2 樣品采集及預處理

在堆肥的0 d、25 d和50 d分別于3個取樣點各取樣500 g后在樣品袋中混合均勻、陰干。按四分法稱取干燥堆肥樣品200 g研磨，過0.3 mm (60目)篩，置于－4℃冰柜存放。稱取經研磨的堆肥樣品4.00 g，加入硅藻土(3～4)g混合均勻后裝入22 mL的萃取池;以20%(體積分數，下同)乙腈-50 g·L－1三氯乙酸(100+1)混合液為萃取劑進行快速全自動提取。提取壓力10 MPa，提取溫度120℃，靜態提取時間5 min，淋洗體積40%，吹掃時間60 s，循環周期2次。取約40 mL的提取劑于萃取瓶中，加10 mL正己烷除脂(連續3次)后旋轉蒸發至近5 mL移入10 mL離心管，在6℃以10 000 r·min－1轉速離心20 min，上層清液轉移至已經活化的Oasis HLB固相萃取柱凈化，用水淋洗，用0.1%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液氮吹至近干后，用50%(體積分數，下同)甲醇溶液溶解，過0.22μm微孔濾膜，轉移至自動進樣瓶，在儀器工作條件下進行分析。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

50μg·L－1(含500μg·L－1代謝物)的8種化合物混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖1。

峰號1～8所對應的化合物同表1

圖1混合標準溶液的總離子流色譜圖

Fig.1 TIC chromatogram of mixed standard solution

2.2 儀器工作條件的選擇

酸性的乙腈和甲醇溶液作為流動相均適合用于各種抗生素的檢測。試驗選擇以0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸甲醇溶液作為流動相，流量為0.4 mL· min－1，8種化合物可在3 min內獲得很好的分離。

對比8種化合物在混合標準溶液和在基質匹配混合標準溶液中的保留時間和相關質譜參數，結果表明:保留時間的誤差小于±0.05 min，質譜參數相符，但基質對待測化合物離子化的信號有影響，尤其對代謝產物離子化的信號有較大抑制作用。因此，試驗采用基質匹配混合標準溶液既能有效地減少基質效應的影響，又能改善基質帶來的分析誤差。

2.3 加速溶劑萃取條件的選擇

試驗考察了萃取溫度(100，120，140℃)和提取劑［20%乙腈溶液、50%乙腈溶液、20%乙腈-50 g· L－1三氯乙酸(100+1)混合液、20%乙腈-100 g· L－1三氯乙酸(100+1)混合液］對測定的影響。結果表明:相較之提取劑對目標化合物的提取回收率的影響，提取溫度的影響較小，故試驗選擇萃取溫度為120℃。在該萃取溫度下，比較了不同的提取劑對8種磺胺類及其代謝產物的提取效率，見圖2。

圖2 萃取劑對回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on values of recovery

由圖2可知:以20%乙腈溶液為提取劑對8種化合物的提取回收率在40%～65%之間，高于50%乙腈溶液為提取劑的提取回收率;但遠低于以20%乙腈-50 g·L－1三氯乙酸(100+1)混合液為提取劑的提取率(78%～96%)。試驗表明:三氯乙酸的添加有利于化合物的提取，但以20%乙腈-100 g·L－1三氯乙酸(100+1)混合液為提取劑對8種化合物的提取率在60%～84%之間，其中N-ASDZ和NASMX的回收率低于70%。綜合考慮，加速溶劑萃取的最佳條件:提取壓力10 MPa，提取溫度120℃，提取劑20%乙腈-50 g·L－1三氯乙酸(100+1)混合液，提取循環周期2次和靜態提取時間5 min。

2.4 標準曲線和檢出限

分別配制基質匹配混合標準溶液系列，按儀器工作條件進行測定。結果表明:8種化合物在一定的質量濃度范圍內與其峰面積呈線性關系，線性范圍、基質匹配線性回歸方程和相關系數見表2。

以定量離子對3倍信噪比和10倍信噪比的響應值計算方法的檢出限(3S/N)和方法的測定下限(10S/N)，其結果見表2。

表2 線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.5 回收試驗

按試驗方法分別對3個空白樣品進行加標回收試驗，每個加標樣品平行測定6次，其結果見表3。

表3 精密度和回收率試驗結果(n=6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n=6)

2.6 堆肥過程中磺胺類及其代謝產物殘留量的變化

依據歐洲共同體委員會制定2002/657/EC決議，對0，25，50 d的堆肥樣品中陽性化合物進行確認，堆肥0 d、25 d和50 d提取樣品的總離子流色譜圖見圖3。

基于該方法建立的基質匹配標準曲線，對堆肥樣品中已被確認的目標化合物進行測定，其結果見圖4。

由圖4可知:在堆肥處理初期的樣品中檢測到多種磺胺類抗生素，其中SMZ和SMX的檢出率和殘留量較高，檢出率為100%，殘留量在26～45.5μg·kg－1之間，高于文獻［4，10-11］中報道的殘留量(20μg·kg－1以內)。SDZ的檢出率及殘留量最低。糞肥樣品中同時檢測出多種磺胺類化合物，很可能是因為抗生素制劑不純或畜禽養殖場存在抗生素的污染。具有抗微生物活性的乙?；前反x物同樣在動物的糞肥中存在，而且含量較高，尤其是N-ASMZ和N-ASMX的檢出率高達100%，殘留量為104.2～156μg·kg－1，所有糞肥樣品中未檢出N-ASDZ。畜禽糞便樣品中存在含量較高的活性代謝物不容忽視，因為具有活性的乙?；前奉惔x物的總殘留量遠遠超過了土壤中抗生素生態毒害效應的觸發值(100μg·kg－1)［14］。在25 d堆肥處理的樣品中發現乙酰代謝物N-ASMZ和N-ASMX的殘留量顯著下降，但其相應母體磺胺類抗生素的殘留量略有增加，表明乙?；前反x物可去乙?；D化成母體化合物［14］。在堆肥處理50 d的樣品中，乙?；前反x物和母體磺胺類化合物的殘留量呈緩慢下降趨勢。以上結果說明在堆肥處理過程中，動物糞便中殘留的磺胺類及其高含量的乙?；前反x物在推擠過程中可能降解或去除，為加快其降解速率有必要對堆肥化處理工藝加以進一步的改進。

本工作對堆肥樣品中8種磺胺類及其代謝產物進行加速溶劑提取;同時考慮到堆肥樣品的復雜性、保護色譜柱的必要性，以及堆肥樣品中殘留抗生素的含量很低等因素，提取液需進一步的凈化和濃縮，故采用固相萃取凈化處理，建立了一種有效可靠的同時測定畜禽糞便和堆肥樣品中抗生素及其代謝物殘留量的UHPLC/MS/MS定量分析方法。該方法有效地監測出堆肥過程中多種磺胺及其乙?；前反x產物的殘留量。給出畜禽糞便堆肥過程中磺胺類及其乙酰代謝物殘留量的降解趨勢，為堆肥處理能否降低或避免農田土壤的二次污染等問題提供理論依據。

圖3 不同堆肥階段的樣品的總離子源色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of the sample at different composting stages

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圖4 不同堆肥階段的樣品中磺胺及其代謝產物的測定結果Fig.4 Determination results of sulfonamides and their metabolites in the samples at different composting stages

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ASE-UHPLC-MS/MS Determination of Residual Amounts of Sulfonamides and Their Metabolites in Livestock Manure During Its Composting Course

WANG Dequan1，HE Siyuan1，SONG Weiming2，LIU Wanyi2，MENG Zhe2*
(1.College of Civil Engineering and Water Conservancy，Ningxia University，Yinchuan 750021，China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan 750021，China)

The sample of composted livestock manure was treated with ASE and the extract obtained was purified by passing through Oasis HLB-SPE column.The purified extract was then separated by HPLC using.Waters Acquity BEH C18chromatographic column as stationary phase，and mixtures of 0.1%(φ)formic acid-methanol solution and 0.1%(φ) formic acid-H2O solution with various ratios as mobile phase in gradient elution.ESI+and multi-reactions monitoring were adopted in MS/MS.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of the sulfonamides and their metabolites were kept in definite ranges.Detection limits(3S/N)found were ranged from 0.5 to 5.0μg·L－1.On the base of blank sample，test for recovery was made by standard addition method，values of recovery found were in the range of67.3%－105%，with RSD's(n=6)in the range of4.5%－15%.

UHPLC-MS/MS;sulfonamides;livestock manure;composting course;ASE

O657.63

A

1001-4020(2017)05-0532-06

10.11973/lhjy-hx201705008

2016-05-12

科技部十二五科技支撐項目(2011467017);村鎮環境綜合整治重大科技工程(2012BAJ21B00)

王德全(1968－)，男，寧夏銀川人，副教授，研究方向為農村環境綜合整治和資源化利用技術集成與示范

*通信聯系人。meng_z@nxu.edu.cn