線粒體自噬在百草枯中毒大鼠模型肺纖維化中的作用研究

劉開翔，占志朋，謝席勝

(川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院腎內科，四川 南充 637001)

線粒體自噬在百草枯中毒大鼠模型肺纖維化中的作用研究

劉開翔，占志朋，謝席勝

(川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院腎內科，四川 南充 637001)

目的：建立百草枯(paraquat，PQ)中毒大鼠模型，觀察不同階段肺線粒體膜電位(JC-1染色)、調控線粒體自噬關鍵性蛋白PINK1、Parkin及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化，探討線粒體自噬是否參與PQ中毒肺纖維化的發生。方法：成年雄性SD大鼠42只，隨機分為正常對照組(n=6)、模型組(n=36)，模型組下設2 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d共6個時間點，每個時間點各6只大鼠。使用20%PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃大鼠建立PQ中毒模型。通過流式細胞儀檢測血紅細胞ROS濃度；HE染色和Masson染色觀察PQ中毒后肺組織病理損害；JC-1染色檢測肺組織線粒體膜電位變化；Western blot檢測PINK1、Parkin蛋白變化。結果：與對照組相比，隨著PQ中毒時間的延長，肺纖維化病理評分較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；PQ組ROS熒光陽性強度率比值在中毒后2 h顯著升高，中毒后12 h達高峰后逐漸下降(P<0.05)，中毒后14 d與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；PQ組肺組織JC-1紅綠熒光比均較對照組降低，Western blot提示隨中毒時間延長，PINK1及Parkin蛋白表達均升高，差異有統計學意義(P<0.01)。PQ組肺組織JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分均呈負相關(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01)。在PQ中毒12 h內，血紅細胞ROS熒光強度陽性率與JC-1紅綠熒光比呈負相關(r=-0.712，P<0.01)，與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分呈正相關(r=0.571，P<0.01；r=0.484，P<0.01；r=0.602，P<0.05)。結論：PQ中毒導致大鼠產生了明顯氧化應激，誘發了線粒體自噬。ROS的產生與線粒體自噬的發生密切相關，共同參與了PQ大鼠肺纖維化的發生發展。

百草枯；肺纖維化；線粒體自噬；PINK1；Parkin；氧化應激

百草枯(paraquat，PQ)又名“對草快”、“克無蹤”，是我國廣大農村地區廣泛應用的季胺類高效能除草劑，同時也是目前致人類中毒死亡率最高的除草劑。PQ中毒后可造成體內肺、腎上腺和腦等器官損傷。其特征性病變是肺損傷，致死率極高。PQ導致的肺損傷主要表現為肺泡炎、急性肺水腫，以及進行性肺間質纖維化[1]。

當PQ進入體內被肺泡上皮細胞主動攝取后，PQ通過一系列連鎖反應產生大量的自由基，構成活性氧類(reactive oxygen species，ROS)系統[2-3]。研究發現，ROS不僅通過脂質過氧化參與肺泡上皮細胞的凋亡[4]，還能通過DNA損傷、線粒體功能障礙、炎癥因子活化、細胞因子激活、蛋白酶失衡等途徑參與肺纖維化的發生[2,5-6]。

通常機體在各種因素(如低氧、饑餓、光致福照、氧化應激等)刺激下，細胞內會發生去極化損傷以及老化的線粒體被特異性地包裹進自噬體中，并通過溶酶體被降解,這個過程稱為線粒體自噬。百草枯誘導自由基產生的過程中，線粒體既是主要場所，又是自由基損傷的首要細胞器。當PQ進入線粒體后，經過一系列氧化還原反應，細胞功能受損，甚至出現凋亡/壞死。PQ中毒時產生的大量ROS能否誘導肺發生線粒體自噬，進而導致肺纖維化呢？目前對此問題的研究未見文獻報道，其潛在的分子機制更是未闡明。

本研究通過建立PQ中毒大鼠模型，觀察PQ中毒大鼠不同階段肺線粒體膜電位及在線粒體自噬這一特殊過程中, 具有關鍵性調控作用的細胞線粒體外膜蛋白PINK1及胞質蛋白Parkin的變化，初步探討線粒體自噬是否參與PQ中毒誘導大鼠發生肺纖維化。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

6周齡雄性清潔、健康SD大鼠42只，體重(200±20)g(川北醫學院實驗動物中心提供)。20%的PQ溶液(先正達-中國投資有限公司)。戊巴比妥鈉 (分析純，蘇州瑞和)，活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；線粒體JC-1熒光探針試劑盒(上海貝博生物試劑公司)、線粒體蛋白提取試劑盒(上海貝博生物試劑公司)。anti-PINK1(Santa Cruz Biotechnology)、anti-Parkin(Santa Cruz Biotechnology)，鼠抗β-actin 單克隆抗體(上海生工生物工程股份有限公司)。25%戊二醛、HE染色試劑盒、MASSON染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)。流式細胞儀(FC500，Beckman公司)。正置顯微鏡(Nikon 80i，Nikon公司)。

1.2 動物分組及處理

將健康成年雄性SD大鼠42只，隨機分為對照組(生理鹽水灌胃)6只，染毒組(PQ 50 mg/kg，灌胃)36只。各組分別于灌胃后2 h、12 h、24 h、72 h、7 d和14 d各取6只，2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg注射麻醉，腹主動脈采血，于-4 ℃冰箱中保存。取部分新鮮肺組織于潔凈試管中保存；部分肺組織用%戊二醛溶液浸泡，-4 ℃冰箱中保存；余肺組-80 ℃冰箱中保存。

1.3 動物模型建立

及根據預實驗結果，中毒組用20%PQ溶液按50 mL/kg一次性灌胃建立PQ中毒模型，對照組用生理鹽水按50 mL/kg一次性灌胃。灌胃后以無嘔吐、抽搐、呼吸困難、呼吸頻率改變等情況視為灌胃成功[7]。實驗過程中嚴密觀察并記錄動物的行為改變，以出現食欲降低、反應遲鈍、毛發蓬松、鼠尾發紺、呼吸困難、易捕捉等標準選擇中毒組模型動物。

1.4 血標本采集和活性氧檢測

腹腔注射20%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉實驗對象，開腹分離結蹄組織暴露腹主動脈，以5 mL空針迅速抽取1 mL血液置于血常規管中保存于4 ℃冰箱，按照活性氧檢測試劑盒操作。

1.5 線粒體膜電位的檢測

取新鮮肺組織使用玻璃勻漿器將肺組織制成細胞懸液，采用JC-1綠色熒光探針檢測線粒體膜電位，具體步驟按JC-1熒光探針試劑盒說明操作。

1.6 肺組織HE、Masson染色

將大鼠右肺取下，以肺門為中心，水平切斷肺組織，留取大小約1 cm3的肺組織，用10%中性福爾馬林固定，肺組織常規脫水、石蠟包埋，用于制備石蠟切片。3 mm切片，行HE、Masson染色后，光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。參照Szapiel[8]方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。具體方法如下：(1)肺泡炎,分為4級：無肺泡炎0分；輕度肺泡炎1分，單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結構正常；中度肺泡炎2分，受累面積占全肺的20%～50%，近胸膜部較重；重度肺泡炎3分，面積大于50%，偶見肺泡腔內有單核細胞及出血造成的實變。(2)肺纖維化：無肺纖維化0分；輕度肺纖維化1分，受累面積<20%；中度肺纖維化2分，受累面積20%～50%；重度肺纖維化3分，受累面積>50%，肺泡結構紊亂。

1.7 Western blot印跡

取新鮮肺組織使用玻璃勻漿器將肺組織進行勻漿，鏡下觀察細胞破碎率80%以上，按線粒體蛋白提取試劑盒說明提取線粒體蛋白。參考文獻方法，采用BCA法定量蛋白濃度[9]。每個上樣孔上樣15 μg蛋白，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉至PVDF膜。用2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫孵育2 h，然后加兔抗鼠PINK1抗體(1∶500)，兔抗鼠Parkin抗體(1∶500)，和β-actin(1∶1 000)脫脂牛奶封閉4 ℃過夜；加HRP標記羊抗兔IgG (1∶20 000)，室溫孵育2 h；TBST(含0.1% Tween-20 的Tris 鹽緩沖液，pH7.4)中洗滌5 min，3次。DAB試劑顯色。采用β-actin為內參照，Image J軟件分析蛋白條帶平均光密度，以β-actin平均光密度值進行內標準校正。實驗重復3次。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

3只PQ組大鼠分別于灌胃后72 h、5 d、9 d死亡，2只PQ組大鼠于灌胃后36 h出現消化道出血。PQ組大鼠2 h后即出現倦怠，煩躁；12 h出現毛發成縷、嗜睡，進食飲水減少，呼吸急促；24 h開始出現口周、鼠尾及腳趾發紺、呼吸困難、稀便，體重下降；72 h后體重明顯下降；7 d大鼠明顯活動減少，呼吸急促；14 d大鼠基本無活動，極度呼吸困難。

2.2 各組大鼠肺組織病理結果及統計

光學顯微鏡下，對照組(圖1A、圖2A)肺組織無明顯病理學改變，PQ 2 h組肺組織開始出現肺泡炎癥，少量膠原纖維形成。隨時間的增加，炎性細胞浸潤、紅細胞滲出以及膠原纖維不斷增加，至14 d時，大量膠原纖維形成，肺泡結構紊亂。與對照組比較，染毒組大鼠肺組織HE染色肺泡炎半定量病理評分、Masson染色肺纖維化半定量病理評分較正常組明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖1-圖3。

2.3 各組大鼠血紅細胞ROS

與正常對照組相比，模型組大鼠血紅細胞ROS的熒光陽性率比值在2 h即出現明顯升高，持續至中毒7 d后，差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見圖4。

2.4 各組大鼠肺組織JC-1檢測結果

與正常對照組相比，正常組紅綠熒光比為(1.83±0.53)，2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d染毒組大鼠比值紅綠熒光比分別為(1.63±0.56)、(1.40±0.79)、(1.11±0.71)、(0.96±0.80)、(0.78±0.88)、(0.59±0.34)，較正常組均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見圖5-圖6。

2.5 Western blot結果

與正常對照組相比，PQ組大鼠肺組織中PINK1、Parkin蛋白的表達顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.01)。不同時間組間肺組織PINK1、Parkin水平變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖7-圖8。

2.6 相關性分析

Pearson相關性分析結果顯示，PQ中毒大鼠肺組織JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分均呈負相關(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01;r=-0.573,P<0.01)。在PQ中毒12 h內，血紅細胞ROS熒光強度陽性率與JC-1呈負相關(r=-0.712,P<0.01)，與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分呈正相關(r=0.571,P<0.01;r=0.484,P<0.01；r=0.602,P<0.05)。

3 討論

PQ急性中毒者可迅速出現各臟器功能衰竭，死亡率極高，即使度過急性期，后期也多發展為肺纖維化引起呼吸衰竭而死亡[10]。本次研究結果顯示，PQ2 h組肺組織開始出現大量炎性細胞浸潤，肺泡上皮水腫，毛細血管擴張，紅細胞漏出，以及膠原纖維形成。隨著時間的延長，PQ組肺組織的肺泡炎逐漸減輕、纖維化不斷加重，呈肺纖維化改變，與Yang等[11]的研究結果一致，說明本研究使用20%PQ溶液按50 mL/kg一次性灌胃成功建立了PQ肺纖維化模型。

既往研究表明，當PQ進入線粒體后，與遞氫體NADH-Q發生反應，進而抑制呼吸鏈中的NADH-Q還原酶的活性，導致有氧代謝減弱，無氧代謝增強，同時產生大量的乳酸和過量的含氧自由基，攻擊線粒體膜，使線粒體內膜通透性增加，線粒體功能發生障礙，以致大量含氧自由基釋放入細胞質，甚至進入細胞核，經過一系列氧化還原反應，細胞功能受損，甚至出現凋亡/壞死[12-13]。

ROS可反映體內氧化應激狀態，故本研究使用流式細胞儀檢測了PQ中毒大鼠血紅細胞ROS的濃度，發現ROS濃度在PQ中毒后2 h即出現顯著升高，隨著中毒時間延長，其濃度持續升高，直到7 d后逐漸降低，再次證實PQ中毒導致大鼠體內發生了明顯的氧化應激。

目前認為，線粒體膜電位降低可以導致線粒體自噬，故檢測線粒體膜電位可以間接反映線粒體自噬的發生[14]。在線粒體自噬這一特殊過程中，哺乳動物細胞線粒體外膜蛋白PINK1具有關鍵性的調控作用。線粒體膜電位崩解是線粒體自噬的早期事件，當線粒體膜電位崩解時，全長型的PINK1將會穩定蓄積在線粒體外膜上，誘導Parkin選擇性轉位到受損的線粒體，最終介導線粒體自噬的發生選擇性清除受損的線粒體[15]。故本課題使用Western blot檢測了PINK1及Parkin蛋白的變化，進一步觀察百草枯中毒后線粒體自噬的現象。

本研究結果發現，PQ組大鼠肺組織細胞JC-1紅綠熒光比隨著時間的延長，與正常對照組比較明顯降低，而PINK1及Parkin蛋白與正常對照組比較不斷升高，相關性分析表明，JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin呈負相關。我們的研究初步證實，PQ中毒導致了大鼠肺線粒體自噬的發生，且JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin有很好的參照性，共同反映了線粒體自噬的現象。

本研究相關性分析還發現，線粒體自噬指標與肺泡炎癥及纖維化密切相關，故線粒體自噬可能參與了PQ導致的肺纖維化的發病機制。我們的結果還提示，ROS與JC-1呈負相關，與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分呈正相關，進一步說明，線粒體自噬可能參與了PQ導致的肺纖維化過程，且此過程可能通過ROS的作用，經過一系列氧化還原反應，引發細胞功能受損實現的。

綜合以上結果，我們初步證實，PQ中毒誘導大鼠體內發生了氧化應激，產生大量ROS。同時，PQ中毒誘發了肺線粒體自噬，并參與了肺纖維化的發生發展。但線粒體自噬在PQ中毒發生肺纖維化的過程中發揮的具體作用及分子細胞機制還有待進一步研究明確。

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(學術編輯：杜飛)

本刊網址：http：//www.nsmc.edu.cn

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郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

To evaluate the effects of mitophagy in paraquat-induced rat pulmonary fibrosis model

LIU Kai-xiang,ZHAN Zhi-peng,XIE Xi-sheng

(DepartmentofNephrology,TheSecondClinicalMedicalSchoolofNorthSichuanMedicalCollege,NanchongCentralHospital,Nanchong637001,Sichuan,China)

Objective：To investigate the effect of mitophagy on the occurrence of pulmonary fibrosis in paraquat poisoning by observe the changes of JC-1， PINK1，Parkin and the reactive oxygen species(ROS)in different stages of paraquat-induced rat pulmonary fibrosis model.Methods：42 adult male sprague-dawley (SD) rats were randomly divided into normal group(n=6) and PQ group(n=36).PQ group rats were divided into six time points:2 h,12 h,24 h,72 h,7 d,14 d,each time point includes 6 rats.20% PQ solution with adose of 50 mg/kg were selected for once administration gavage to establish PQ poisoning model,through the detection of red blood cell ROS concentration by flow cytometry,HE staining and Masson staining of lung tissue damage was observed after PQ poisoning,JC-1 staining was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential changes in lung tissue,PINK1,Parkin protein was detected by Western blot.Results:Compared with normal group,the degrees of pulmonary fibrosis was gradually increased with the increase of PQ poisoning time,the difference was significant (P<0.05).In the PQ groups, the positive rate of ROS fluorescence intensity increased significantly at 2h after poisoning,and peaked at 12 h after poisoning, and then decrease gradually(P<0.05),the difference between normal group and 14 d after poisoning has no statistical significance (P>0.05).The ratio of JC-1,red green fluorescence in lung tissue of PQ group was lower than that of control group,and Western and blot indicated that the expression of PINK1 and Parkin protein increased with the duration of poisoning, and the difference was statistically significant (P<0.01).Pearson test shows there is a negative correlation between the red green fluorescence ratio and PINK1,Parkin and the pathology score of pulmonary fibrosis.(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01).In 12 h after PQ poisoning,there is a negative correlation between the ratio of the positive rate of ROS fluorescence intensity in erythrocyte and the red green fluorescence (r=-0.712,P<0.01)，and a positive correlation between the positive rate of ROS fluorescence intensity and PINK1,Parkin and the pathology score of pulmonary fibrosis(r=0.571,P<0.01;r=0.484,P<0.01;r=0.602,P<0.05).Conclusion:The mitophagy and oxidative stress were induced by PQ poisoning. The generation of ROS closely related to the development of autophagy in mitochondria and is involved in the development of pulmonary fibrosis in PQ rats.

Paraquat;Pulmonary fibrosis;Mitophagy; PINK1;Parkin;Oxidative stress

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.003

四川省科技廳基金項目(2011JTD0014)；南充市科技局基金項目(2015-855)

2016-08-26

劉開翔(1990-)，男，碩士研究生。E-mail:254442802@qq.com

謝席勝，E-mail:xishengx@163.com

時間：2017-6-21 18∶09 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.006.html

1005-3697(2017)03-0324-05

R595.4

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