miRNA-210在癡呆中的調控作用及機制

黃菁菁，燕蘭云，余真，馮美江，魯翔

(1.南京醫科大學第二附屬醫院老年科，江蘇 南京 210011；2.南京醫科大學第一附屬醫院神經內科，江蘇 南京 210029； 3.南京醫科大學附屬逸夫醫院老年科，江蘇 南京 211166)

miRNA-210在癡呆中的調控作用及機制

黃菁菁1，燕蘭云2，余真1，馮美江1，魯翔3

(1.南京醫科大學第二附屬醫院老年科，江蘇 南京 210011；2.南京醫科大學第一附屬醫院神經內科，江蘇 南京 210029； 3.南京醫科大學附屬逸夫醫院老年科，江蘇 南京 211166)

目的：觀察miRNA-210在癡呆或嚴重認知功能障礙老年患者血漿中的表達變化，探討miRNA-210對老年癡呆患者的臨床意義。方法：利用miRNA芯片檢測老年患者(有無癡呆或嚴重認知功能障礙)血漿中miRNA-210水平變化。結果：癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者血漿中miRNA-210的表達水平明顯高于無癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者。結論：miRNA-210在癡呆或嚴重認知功能障礙的發生發展過程中可能起著重要調控作用，可進一步深入研究其內在機制。

癡呆；嚴重認知功能障礙；miRNA

近些年來隨著人口老齡化的加劇，老年癡呆的發病率逐年遞增[1]。該病起病隱襲，進展緩慢，早期癥狀輕微，且缺乏相關診斷標志物。其中血管性癡呆占老年癡呆的80%以上，與腦組織的缺血缺氧密切相關。而隨著對于miRNA的研究越來越深入，我們發現miRNA參與調節了生長發育、細胞增殖、分化、信號通路、新陳代謝和凋亡[2]，其中miR-210與缺血性卒中的關系也逐漸明朗。本項研究旨在研究miRNA-210在癡呆或嚴重認知功能障礙老年患者血漿中的表達變化，為研究老年癡呆的分子調控機制提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗組 選取2015年1月至2015年12月期間在我院老年?？崎T診診斷(診斷標準參照2011年中國癡呆與認知障礙診治指南[3])為癡呆或嚴重認知功能障礙的65歲以上男性45例。入選時符合納入實驗組要求。中途退出實驗3例，最終完成實驗人數42例。年齡65～96歲，平均年齡(83.2±7.9) 歲。隨訪2年，每年收集1次實驗組血漿(分別為實驗組1年和實驗組2年)，所有標本-80 ℃保存。研究對象均了解和同意該項研究并簽署同意書。

1.1.2 對照組 選取2015年1月至2015年12月期間在本院老年?？崎T診就診，排除癡呆或嚴重認知功能障礙診斷的65歲以上男性45例。入選時符合納入對照組要求。中途退出實驗1例，最終完成實驗人數44例。年齡66～92歲，平均年齡(78.8±8.2) 歲。隨訪2年，收集1次對照組血漿，所有標本-80 ℃保存。研究對象均了解和同意該項研究并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 包括姓名、年齡、婚姻狀況、教育年數、既往史、家族史、MR檢查。排除標準:(1)大血管性梗塞或腦出血，短暫性腦缺血發作病史;(2)帕金森病等神經變性或退行性疾病;(3)其他可能影響認知的神經系統疾病、腫瘤等; (4)聽力嚴重下降影響交流或認知測試; (5)不能接受磁共振成像檢查。

1.2.2 認知功能測試 主要包括評價總體認知水平的簡易智能量表(mini-mental state examination，MMSE) ?！?5分為認知正常；14～24分為輕度認知功能障礙；≤13分為癡呆或嚴重認知功能障礙。

1.2.3 實驗方法 (1)主要儀器：美國ABI ViiA7實時定量PCR儀。(2)主要試劑：miRNA提取分離試劑盒來自GeneMark公司。反轉錄試劑盒、用于熒光定量聚合酶鏈反應(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)的SYBR試劑源自TaKaRa公司；miR-210、U6的反轉錄和PCR引物由上海生工生物有限公司提供。(3)總RNA提取 按miRcute miRNA提取分離試劑說明書抽提樣品總RNA。(4)總RNA純度和濃度檢測 純度檢測:用RNase-free水將分光光度計調零,取待測總RNA,測定其A260與A280的OD值。重復3次,求平均值,取A260/A280=1.8～2.1的樣本用于下一步實驗。濃度測定:操作同上,取三次平均值。加入適量RNase-free水調整濃度至0.1μg /μL。樣品RNA濃度計算公式為：OD260×40×稀釋倍數(μg /μL)。(5)逆轉錄反應和熒光定量PCR 用AMV逆轉錄酶和與其互補的反義引物逆轉錄成cDNA。再取2 μg cDNA加入20 μL Real-time PCR體系，擴增條件為：95 ℃預變性15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，測定熒光強度，重復40個循環；72 ℃延伸7 min。使用U6為實驗內參。miR-210 Forward Primer:5’-ACACTCCAGCTGG

GCUGUGCGUGUGACAGC-3’,Reverse Primer:5’-CT

CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTC

AGCCGC-3’,U6 Forward Primer:5’-CTCGCTTCGGC

AGCACA-3’,Reverse Primer:5’-AACGCTTCACGAA

TTTGCGT-3’。

1.3 數據分析

數據采用2-△△CT法進行分析。變化倍數>2為高表達，<0.5為低表達。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者的臨床資料比較

符合標準的入組患者共90例，實驗過程中出現排除標準中的疾病，大血管性梗塞患者1例，確診腫瘤患者1例、失去聯系患者1例，死亡患者1例，共排除4例，最終分析病例為86例。從病例資料入選時的一般特點可見，年齡、腔隙性梗死與癡呆或嚴重認知功能下降有關，組間比較差異有統計學意義(P<0.05) ，見表1。

表1 兩組患者的基本臨床資料比較

*P<0.05，對照組與實驗組比較。

2.2 miR-210的表達

對照組、實驗組1年和實驗組2年中miR-210的表達水平分別為：0.98±0.10、2.44±0.15和2.54±0.09。與對照組相比，實驗組1年和實驗組2年miR-210的表達顯著升高(P<0.05)，兩組實驗組之間則無明顯差異(P>0.05)。說明有癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者血漿中miRNA-210的表達水平明顯高于無癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者。見圖1。

3 討論

癡呆現已發展為老年醫學科臨床常見疾病之一，其中血管性癡呆和阿爾茲海默病最為常見，臨床上以記憶力下降，執行力、注意力、精神反應速度損害為特點，嚴重影響了患者的生活質量[4]，故該疾病的診治是醫學領域目前相當熱門的話題。

傳統的神經病學認為阿爾茲海默病的發病機制與血管性癡呆絕對不同，阿爾茲海默病為神經變性病，故該病的診斷將血管因素絕對排除在外[5]。但近些年來的研究發現這兩類癡呆均存在低灌注狀態，與皮質下缺血缺氧息息相關[6]，其中阿爾茲海默病患者可能是由于血流動力學的改變，促進了神經纖維纏結和老年斑形成。而這兩類癡呆患者均由于腦動脈血流量減少或中斷，導致局部腦組織長期缺血、缺氧，從而引起了相應神經功能的缺損[7-8]。miR-210就是一種在缺氧狀態下，由HIF-1α(hypoxia induced factor 1α)誘導產生的miRNA[9]。在缺血的腦皮質中miR-210表達明顯上調，通過激活Notch1 信號通路，調節缺血后的血管再生[10]。由于miR-210在血漿和腦脊液中可以直接檢測到，并且其含量與大腦中miR-210含量成正比，這就方便我們通過監測外周血中miR-210的含量間接了解大腦中miR-210的含量[11]。這不同于其他標志物，miR-210可以反應分子水平的變化，幫助我們研究疾病的機制[12]。從本研究結果發現，有癡呆或嚴重認知功能障礙的老年患者血漿中miRNA-210的表達水平明顯高于無癡呆的老年患者。但隨著腦損傷的進一步加重，腦組織在長期的皮質下缺血缺氧的過程中產生的miR-210可能達到相對穩態，所以對于已經確診的癡呆患者的miR-210并沒有隨著時間的推移快速增長。在今后的研究中，可以以不同時間節點和癡呆嚴重程度對miR-210進行監測。另由于對照組2年miR-210采集數量不足，故僅以1年抽取的數值作為對照，結合實驗1年和2年miR-210的結果，我們推測對照組1年與2年miR-210的數值可能也無明顯差異。該推論可在今后的研究中再行證實。

我國既是人口大國，同時也進入了老齡化快速發展期，我國老年癡呆的患病人數也將迅速增加，預計到2040年，我國老年癡呆患者人數將是所有發達國家癡呆患者的總和。對于癡呆的精準診斷和有效治療的研究就刻不容緩，本研究發現miRNA-210在癡呆或嚴重認知功能障礙的發生發展過程中可能起著重要調控作用，可進一步深入研究其內在機制。

[1] Wimo A,Jonsson L,Bond J,etal.The worldwide economic impact of dementia 2010[J].Alzheimers Dement,2013,9(1):1-11.

[2] Moreno-Moya JM,Vilella F,Microrna SC.MicroRNA:Key gene expression regulator[J].Fertil Steril,2014,101(6):1516-1523.

[3] 賈建平,王蔭華,李焰生,等.中國癡呆與認知障礙診治指南(二)：癡呆分型及診斷標準[J].中華醫學雜志,2011,91(10):651-655.

[4] O’Sullivan M.Imaging small vessel disease:lesion topography,networks,and cognitive deficits investigated with MRI[J].Stroke,2010,41(10 Suppl):S154-S158．

[5] 方興.血管性癡呆早期診斷與生物標記物相關性研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志, 2016, 14(16):1867-1870.

[6] 高薇薇,薛蓉,程焱.腦梗死及白質病變臨床分型與血管性認知功能障礙的相關性[J].中華神經科雜志,2012,45(5):318-322.

[7] Giannopoulos S,Katsanos AH,Kosmidou M,etal.Statins and vascular dementia:a review[J].J Alzheimers Dis,2014,42(Suppl 3):S315-320.

[8] Davey DA.Alzheimer’s disease and vascular dementia:one potentially preventable and modifiable disease Part Ⅱ:Management,prevention and future perspective[J].Neurodegener Dis Manag,2014,4(3):261-270.

[9] Pulkkinen K,Malm T,Turunen M,etal.Hypoxia induces microRNA miR-210 in vitro and in vivo ephrin-A3 and neuronal pentraxin 1 are potentially regulated by miR-210[J].FEBS Lett,2008,582(16):2397-2401.

[10]Lou YL,Guo F,Liu F,etal.miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia[J].Mol Cell Biochem,2012,370(1-2):45-51.

[11]Dorval V,Nelson PT,Hebert SS.Circulating microRNAs in Alzheimer’s disease:the search for novel biomarkers[J].Front Mol Neurosci,2013,6:24.

[12]Redis RS,Calin S,Yang Y,etal.Cell-to-cell miRNA transfer:from body homeostasis to therapy[J].Pharmacol Ther,2012,136(2):169-174.

(學術編輯：張小東)

本刊網址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

Effects and mechanism of miRNA-210 in plasma of elderly patients with dementia

HUANG Jing-jing1，YAN Lan-yun2，YU Zhen1，FENG Mei-jiang1，LU Xiang3

(1.DepartmentofGeriatrics，TheSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011;2.DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversityNanjing210029;3.DepartmentofGeriatrics，SirRunRunHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing211166,Jiangsu,China)

Objective：Investigate the expression change of miRNA-210 in the plasma of elderly patients with dementia or severe cognitive impairment,and explore the clinical significance of miRNA-210.Methods：MiRNA-chips were used to detect changes in plasma miRNA-210 levels in elderly patients (with or without dementia or severe cognitive impairment).Results:The expression of miRNA-210 in the plasma of elderly patients with dementia or severe cognitive impairment was significantly higher than that in elderly patients without dementia or severe cognitive impairment.Conclusion:MiRNA-210 may play an important regulatory role in the development of dementia or severe cognitive impairment,and further study its intrinsic mechanism.

Dementia;Severe cognitive impairment;miRNA

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.010

南京醫科大學科技發展基金重點資助項目(2015NJMUZD036)

2017-04-14

黃菁菁(1983-)，女，博士，主治醫師，講師。E-mail:jingjinghuang@njmu.edu.cn

魯翔，E-mail:luxiang66@njmu.edu.cn

時間：2017-6-21 18∶09 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.020.html

1005-3697(2017)03-0352-03

R749.16

A