板栗過氧化氫酶基因CAT1的克隆及生物信息學分析

葛 穎,苗英杰,吳祖芳,翁佩芳,張 鑫

(寧波大學食品科學與工程系,應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)

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板栗過氧化氫酶基因CAT1的克隆及生物信息學分析

葛 穎,苗英杰,吳祖芳*,翁佩芳,張 鑫

(寧波大學食品科學與工程系,應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)

為研究板栗過氧化氫酶基因CAT1的功能,旨在為其采后貯藏中品質變化研究提供分子機理基礎。以板栗為試材,提取總RNA,通過cDNA末端快速擴增技術(RACE),克隆到板栗CAT1基因cDNA全長,并對其進行生物信息學分析。結果表明,該基因序列全長1485 bp,包含一個1479 bp的開放閱讀框,編碼492個氨基酸。氨基酸序列分析表明,板栗CAT1與棗(Ziziphusjujuba)、煙草(Nicotianatabacum)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)等植物過氧化氫酶CAT1氨基酸序列有較高的相似性。蛋白分析表明,該蛋白分子量為56947.31 Da,理論等電點6.65,屬穩定性親水蛋白;亞細胞定位于過氧化氫酶體,存在30個磷酸化位點,無信號肽。二級結構以α螺旋、無規則卷曲為主。保守結構域預測表明,該基因編碼蛋白屬于Catalase-like超家族。本研究克隆獲得了板栗CAT1基因,為進一步研究該基因的生物學功能奠定了基礎。

板栗,CAT1基因,克隆,生物信息學分析

板栗(Castaneamollissimablume)俗稱“栗子”,山毛櫸科栗屬堅果類植物,是我國重要的經濟樹種,栽培歷史悠久,分布廣泛[1-2]。板栗果實營養豐富,富含淀粉,蛋白質,脂肪,多種維生素及礦物質等;據測定,每100 g栗實中含碳水化合物42 g、蛋白質4.8 g、脂肪1.5 g、抗壞血酸46 mg、鐵15 mg[3-4]。板栗既可生食、炒食和煮食,又可制成糕點、栗醬、罐頭、飲料等食品;如糖炒栗子,風味極佳,深受消費者喜愛[5]。然而,板栗果實屬頑拗型種子,采后水分含量高、呼吸強度大、酶類活性強、淀粉水解快,貯藏不當極易發生蟲蛀、栗實發芽、霉爛等現象[6-7]。目前,國內外學者對板栗采后貯藏保鮮進行了大量的研究,而有關植物體內抗氧化酶活性變化與板栗衰老的分子機制研究報道較少[8-9]。

植物體內的抗氧化系統包括非酶類抗氧化和酶類抗氧化系統。非酶類抗氧化劑包括還原性谷胱甘肽、維生素E、β-胡蘿卜及生物堿等;酶類抗氧化劑主要有過氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione,GR)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate,APX)等[10]。過氧化氫酶(CAT)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的氧化酶,主要分布在植物細胞的過氧化物酶體、乙醛酸循環體和細胞質[11]。它能夠清除植物細胞內光呼吸、

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

線粒體電子傳遞及脂肪β-氧化等過程中產生的H2O2,從而保護細胞免于過氧化氫酶的毒害[12]。按照催化中心結構差異CAT可分為兩類:含鐵卟啉結構的CAT,又稱鐵卟啉酶(FeCAT);含錳離子替代鐵的卟啉結構的CAT,又稱錳過氧化氫酶(MnCAT)[13]。研究表明,CAT與植物多種抗逆性和氧化衰老等有關[14-15]。近年來,研究者已陸續從多種植物中克隆出相關CAT基因,并對這些基因功能及表達特性進行了研究[16-17]。如王升平等[18]通過RT-PCR技術克隆獲得煙草NC89 CAT1基因,并對該基因在煙草NC89的不同組織部位表達特征進行分析。結果發現:CAT1基因在煙草NC89的根、莖、葉等部位均有表達;但在根部表達量較低,在葉中相對表達量最高。溫慶放等[19]采用RT-PCR和RACE技術從普通絲瓜果肉克隆到過氧化氫酶CAT1基因。LcCAT1基因全長1755 bp,開放讀碼框1479 bp,編碼492個氨基酸。序列分析發現,LcCAT1氨基酸序列與黃瓜、陸地棉、擬南芥、蘿卜等植物相似性較高,均在92%以上。同時定量PCR分析顯示,普通絲瓜品種‘福絲3號’葉片中表達量最高,將近為花、果實、根和莖中表達量的5倍,表明LcCAT1基因具有組織表達特異性。程華等[20]利用RACE技術從銀杏中克隆獲得過氧化氫酶基因GbCAT1的cDNA全長,并定量分析了該基因在其不同組織部位表達特性。結果表明:GbCAT1在銀杏的根、莖、葉和果中都有表達,在葉中的相對表達量最高,其次為果、莖和根。而板栗中過氧化氫酶基因CAT1的克隆尚未見報道。本研究以板栗為材料,克隆CAT1基因的cDNA全長,運用生物信息學方法對該基因編碼的蛋白質從理化性質、疏水性/親水性,跨膜結構域,亞細胞定位、磷酸化位點及二級結構等方面進行預測分析,同時構建系統進化樹,旨在為后續探索該基因的功能及其在板栗生理活動中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗(Castaneamollissimablume) 選自寧波本地種植魁栗,將栗肉組織切薄片后、以液氮中快速研磨至粉末狀,置于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于總RNA的提??；Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態細胞,pEASY-T1克隆載體 全式金生物技術公司(北京)；TransTaq? HiFi高保真DNA聚合酶 全式金生物技術公司(北京);FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA Marker 天根生化科技有限公司(北京);瓊脂糖凝膠回收試劑盒 OMEGA公司(美國),2×Taq PCR Master Mix 鼎國生物技術公司(北京);引物 上海生物工程有限公司合成;其他化學試劑 均為國產分析純。

5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;IT041-0001梯度PCR儀 上海吉泰依科賽生物儀器公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備公司;GenoSens1880 凝膠成像采集系統 上海勤翔科學儀器公司;NanoDrop2000超微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗總RNA的提取及cDNA模板的合成 采用CTAB法提取板栗總RNA[21]。RNA提取質量及純度以1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白儀檢測。按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明將RNA反轉錄成cDNA,-20 ℃保存備用。

1.2.2 基因克隆

1.2.2.1 板栗CAT1基因的RACE擴增 使用SMARTer? RACE Kit(Clontech Laboratories,Inc)試劑盒進行板栗CAT1基因RACE擴增。參照試劑盒說明書,以反轉錄合成cDNA為模板,根據試劑盒說明書關于特異性引物的要求使用Oligo7.0設計5′RACE和3′RACE所需的特異性引物GSP1和GSP2(表1),克隆過程操作依據試劑盒說明書。產物回收、連接轉化送測序,將RACE克隆測序片段使用DNASTAR軟件拼接。

1.2.2.2 板栗CAT1基因cDNA全長的克隆 根據拼接得到的板栗CAT1基因全長序列,使用Oligo7.0設計全長引物F和R,以板栗反轉錄cDNA為模板,使用TransTaq?HiFi高保真DNA聚合酶進行PCR擴增;PCR反應體系依據試劑說明書。PCR反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,共30個循環;最后72 ℃延伸5 min[22]。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,切下預期大小的目的條帶,用瓊脂糖凝膠試劑盒(OMEGA公司)回收純化PCR產物。將回收產物與pEASY-T1 載體(北京全式金)連接,熱激法轉化Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態細胞,取陽性克隆送上海華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用NCBI ORF-finder軟件在線分析板栗CAT1基因開放閱讀框,并翻譯編碼其蛋白氨基酸序列。利用Protparam程序(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼其蛋白氨基酸組成、分子式、等電點等理化性質。用NCBI的Conserved Domains服務器分析板栗CAT1蛋白氨基酸序列的保守結構域。運用Protscale程序(http://web.expasy.org/protscale/)進行蛋白疏水性/親水性分析。利用SignaIP4.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析預測蛋白N-末端信號肽。通過TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測該蛋白的跨膜區域。利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白磷酸化位點進行分析。用TargetP1.1Server進行蛋白的亞細胞定位。利用Hopfield神經網絡HNN(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)進行蛋白二級結構預測,同時用MEGA5.0軟件構建蛋白的系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取結果與檢測

提取板栗總的RNA,經1%瓊脂糖凝膠電泳后的結果如圖1所示。從圖1可以看到3條清晰完整的RNA條帶,分別為28S RNA、18S RNA和5S RNA。說明提取總RNA完整性較好。RNA吸光值A260/A280比值均在1.8～2.0之間,純度較高,可用于后續反轉錄實驗[23]。

圖1 板栗總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis result of total RNA from Castanea mollissima blume注:Marker:DL4500 DNA分子標準量;1和2:總RNA。

2.2CAT1基因全長cDNA的克隆

由設計全長引物F和R,以板栗cDNA為模板,進行全長序列的擴增。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖2所示。從圖2可以看出,PCR結果在1500 bp位置擴增出一條帶,與預期結果大小相符。將擴增后PCR產物回收、連接pEASY-T1 Cloning vector,轉化大腸桿菌感受態細胞,挑選陽性克隆,經菌落PCR和電泳條帶大小鑒定后送華大基因公司(上海)測序,測序序列經DNASTAR軟件拼接得到CAT1基因全長1485 bp。運用OFR-finder分析發現,該基因含有一個1479 bp開放讀碼框,編碼492個氨基酸,GeneBank登錄號為KY883373。用NCBI在線conserved Domains預測該蛋白的保守結構域,發現板栗CAT1基因編碼的蛋白屬于Catalase-like超家族(圖3)。

圖2 板栗CAT1基因cDNA全長擴增電泳圖Fig.2 Full-length cDNA amplification results of Castanea mollissima blume CAT1 gene注:Marker:DNA標準分子量(DL4500); 1和2:CAT1基因cDNA全長擴增產物。

2.3 板栗CAT1蛋白理化性質分析

利用ProtParam軟件對板栗CAT1蛋白理化性質進行預測,結果表明,CAT1蛋白分子式為C2578H3873N715O726S14,分子量56947.31 Da,理論等電點(pI)6.65。該蛋白由Ala,Arg等20種氨基酸組成,其中Pro含量最高(7.5%),Cys含量最低(1.2%),負電荷殘基(Asp+Glu)61個,正電荷殘基(Arg+Lys)57個。不穩定系數(II)為38.87,表明該蛋白為穩定蛋白;消光系數83685(280 nm),脂肪系數(AI)71.52。該蛋白N末端為Met,估計半衰期為30 h(哺乳動物網狀細胞,體外),總平均疏水性-0.554,表明該蛋白為親水性蛋白。

表2 板栗CAT1編碼蛋白理化性質Table 2 Physical and chemical properties ofCastanea mollissima blume CAT1 protein

2.4 板栗CAT1蛋白親水性/疏水性分析

運用ExPASy的ProtScale在線軟件對板栗CAT1基因編碼蛋白氨基酸序列進行疏水性/親水性預測。以0為界線,正值為疏水,負值為親水,且氨基酸分值越低親水性越強、分值越高疏水性越強。結果表明(圖4);該蛋白在第326位分值最高,為2.667,疏水性最強;第427位分值最低,為-2.678,親水值最強。由圖中分布知,該蛋白氨基酸得分大都為負值,結合ProtParam理化性質分析結果,其平均疏水性為-0.554,可推測該蛋白為親水性蛋白。

圖4 板栗CAT1編碼蛋白疏水性/親水性預測Fig.4 The prediction on hydrophobic/hydrophilic region of Castanea mollissima blume CAT1 protein

2.5 板栗CAT1蛋白亞細胞定位分析

采用TargetP1.1 Server軟件對板栗CAT1蛋白進行亞細胞定位,結果如表3所示,該蛋白在線粒體靶向肽(mTP),葉綠體轉運肽(cTP),分泌途徑信號肽(SP)中分值均較低,分別為0.350、0.148、0.032,而劃分為其他不含信號肽的蛋白分值較高為0.614。同時結合PSORT Prediction預測顯示,CAT1蛋白在微體(過氧化氫酶體)中概率最高為0.748,線粒體基質空間(mitochondrial matrix space)概率0.100,內質網(腔)中概率0.000,內質網(膜)中概率為0.000。結合以上2種預測,推測CAT1蛋白可能定位于過氧化氫酶體。

表3 板栗CAT1蛋白亞細胞定位Table 3 Subcellular location of Castanea mollissima blume CAT1 protein

注:“-”表示無。2.6 板栗CAT1蛋白跨膜和信號肽分析

用TMHMM2.0工具預測其跨膜結構域,結果顯示(圖5)該蛋白跨膜螺旋數量為0,氨基酸的螺旋數量為0.00475,第60個氨基酸跨膜螺旋數量為0.00067,表明該蛋白不存在跨膜結構域。屬于非跨膜蛋白。同時通過SignalP 4.1分析板栗CAT1蛋白信號肽(圖6)所示,其最高原始剪切位點分值(C值),綜合剪切位點分值(Y值)和信號肽分值(S值)為分別是第68位甘氨酸和第12位酪氨酸,分值分別為0.113、0.108、0.127;可知信號肽的分值低于0.5,推斷該蛋白不存在信號肽,為非分泌蛋白。

圖5 板栗CAT1編碼蛋白的跨膜結構域分析Fig.5 Transmembrane analysis of Castanea Mollissima blume CAT1 protein

圖6 板栗CAT1編碼蛋白信號肽預測Fig.6 Signal peptide prediction of Castanea mollissima blume CAT1 protein

2.7 板栗CAT1蛋白磷酸化位點分析

通過NetPhos3.1工具預測板栗CAT1編碼蛋白磷酸化位點(圖7),結果表明該蛋白含有30個可能的磷酸化位點,其中包括13個絲氨酸(Ser)磷酸化位點,11個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和6個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。

圖9 板栗CAT1與其他植物CAT氨基酸序列系統進化樹分析Fig.9 Phylogenetic tree analysis of the Castanea mollissima blume CAT1 protein with other plant species

圖7 板栗CAT1編碼蛋白磷酸化位點Fig.7 Phosphorylation sites of Castanea mollissima blume CAT1 protein

圖8 板栗CAT1編碼蛋白二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction of Castanea mollissima blume CAT1 protein

2.8 板栗CAT1蛋白二級結構預測

用Hopfield神經網絡(HNN)對板栗CAT1蛋白的二級結構果進行預測,結果表明(圖8),該蛋白含有α-螺旋(Alpha helix)20.53%、無規則卷曲(Random coil)59.55%、延伸鏈(Extended strand)19.92%,其中無規則卷曲所占比例最高,其次是α-螺旋和延伸鏈,不含β折疊的氨基酸。表明該蛋白二級結構主要是以α螺旋、無規則卷曲為主。

2.9 板栗CAT1編碼蛋白的氨基酸同源性及進化樹分析

將板栗CAT1基因編碼蛋白的氨基酸序列在NCBI上進行Blastp檢索,結果發現,該氨基酸序列與來自桃(Prunuspersica,CAD42908.1)、煙草(Nicotianatabacum,NP_001312022.1)、陸地棉(Gossypiumhirsutum,NP_001314073.1)、可可(Theobromacacao,EOY15259.1)、毛白楊(Populustomentosa,AFU90822.1)、旱柳(Salixmatsudana,AJE26131.1)、棗(Ziziphusjujuba,NP_001310800.1)、辣椒(Capsicumannuum,NP_001311851.1)等植物CAT氨基酸序列同源性較高,均達到93%以上。將板栗CAT1蛋白氨基酸序列與上述植物CAT氨基酸序列,用MEGA5.0軟件通過近臨相接法(Neighbor-Joining)構建蛋白序列的進化樹(圖9),由進化樹可知,相同科毛白楊、旱柳聚為一類;棉花與可可、桃與棗分屬不同科,在聚類中聚為一類,表明植物CAT編碼蛋白在同一科屬有較高的同源性,不同科間也有一定程度的同源性;板栗又與以上植物聚為一大類。

3 結論

CAT家族由多基因編碼,其表達和活性受溫度、鹽度、干旱、重金屬及臭氧、紫外等多種環境環境因子的影響[24-26]。如玉米中存在CAT1、CAT2和CAT3三種過氧化氫酶的同工酶,它們分別由3個獨立的基因編碼,且具有各自不同的時空表達模式[27]。小麥中的兩種過氧化氫同工酶CAT1和CAT2的表達量與干旱條件相關[28]。本研究運用RACE技術,獲得了板栗過氧化氫酶CAT1基因cDNA全長。該基因全長1485 bp,開放閱讀框為1479 bp,編碼492個氨基酸,最大疏水值2.667。其亞細胞定位在過氧化氫酶體中,這與前人報道的植物細胞CAT主要分布在過氧化物酶體、乙醛酸循環體和細胞質中結論相一致[29]。板栗CAT1與來自桃、煙草、陸地棉、棗等植物過氧化氫酶CAT1氨基酸序列具有較高相似性,達到93%以上。二級結構以α螺旋、無規則卷曲為主。這些分析為進一步探究該基因功能及表達特性等研究提供理論依據。

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Cloning and bioinformatics analysis ofcatalase gene(CAT1)fromCastaneamollissimablume

GE Ying,MIAO Ying-jie,WU Zu-fang*,WENG Pei-fang,ZHANG Xin

(Department of Food Science and Engineering,Key Laboratory ofApplied Marine Biotechnology,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

The objectives of the present study were to provide a molecular mechanism basis in the studying of quality changes in postharvest and storage fromCastaneamollissimablume,and further exploring the function ofCAT1 gene. Full-lengthCAT1 cDNA was cloned fromCastaneamollissimablume using rapid amplication of cDNA ends(RACE)method,and were analyzed by bioinformatics technology. The results of sequence analysis indicated thatCAT1 had a length of 1485 bp containing a 1479 bp open reading frame which encoded 492 amino acid residues. Amino acid sequence analysis indicated that,CAT1 was high identity with the catalases ofZiziphusjujuba,Nicotianatabacum,Gossypiumhirsutumand many other plants. The predicted molecular weight of the protein was 56947.31 Da with the pI of 6.65. Characteristic analysis of protein results revealed thatCAT1 protein is a stable,non-transmenbrane and hydrophilic protein,located in microbody(peroxisome). It has no signal peptide and contains 30 phosphorylation sites. The conserved domains service analysis indicated thatCAT1 belonged to catalase-like superfamily. The secondary structure prediction showed thatCastaneamollissimablumeCAT1 protein mainly containsα-helix and random coil.CastaneamollissimablumeCAT1 gene were cloned in this study,which laid the foundation for further studying biological of the gene.

Castaneamollissimablume;catalase gene;cloning;bioinformatics

2016-12-27

葛穎(1985-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬保鮮方法及作用的分子機制，E-mail:1257718424@qq.com。

*通訊作者:吳祖芳(1963-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術研究，E-mail:wzfwpf@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0124-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.023