miR-29b2c重組腺病毒的構建及對胃癌細胞增殖和遷移的影響

駱愛玲，杜春園，趙雪梅，梁繼超，陳勇

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miR-29b2c重組腺病毒的構建及對胃癌細胞增殖和遷移的影響

駱愛玲，杜春園，趙雪梅，梁繼超，陳勇

湖北大學中藥生物技術省重點實驗室生物資源綠色轉化湖北省協同創新中心，湖北武漢 430062

駱愛玲, 杜春園, 趙雪梅, 等. miR-29b2c重組腺病毒的構建及對胃癌細胞增殖和遷移的影響. 生物工程學報, 2017, 33(7): 1136–1144.Luo AL, Du CY, Zhao XM, et al. Effects of recombinant adenovirus Ad-miR-29b2c on HGC-27 cell proliferation and migration. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1136–1144.

構建了miR-29b2c重組腺病毒Ad-miR-29b2c，考察了其對HGC-27、MGC-803胃癌細胞增殖及遷移的抑制作用。采用PCR從基因組擴增miR-29b2c片段，并克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV中，構建穿梭質粒pAdT-29b2c，經酶切及測序鑒定。穿梭質粒經Ⅰ線性化后與腺病毒骨架載體共轉化BJ5183感受態，產生重組腺病毒質粒Ad-miR-29b2c，再經Ⅰ線性化后轉染293A細胞進行包裝。重組腺病毒擴增后感染HGC-27細胞，通過MTT及細胞遷移實驗觀察Ad-miR-29b2c對HGC-27、MGC-803細胞增殖及遷移的影響。采用Western blotting檢測Ad-miR-29b2c對HGC-27、MGC-803細胞δ-catenin蛋白表達的影響。酶切、測序及熒光定量PCR結果表明重組腺病毒構建成功，miR-29b及miR-29c在HGC-27細胞過表達。MTT實驗表明Ad-miR-29b2c能顯著抑制HGC-27、MGC-803細胞增殖。細胞遷移實驗表明Ad-miR-29b2c能顯著抑制HGC-27、MGC-803細胞遷移。此外，Ad-miR-29b2c能顯著降低HGC-27、MGC-803細胞δ-catenin蛋白表達水平。綜上所述，構建了miR-29b2c的重組腺病毒，并發現其可以抑制胃癌細胞HGC-27和MGC-803的增殖及遷移，該作用可能與miR-29抑制HGC-27、MGC-803細胞δ-catenin蛋白表達有關。

miR-29，胃癌，重組腺病毒，基因治療

胃癌是一種發病率及死亡率極高的惡性腫瘤，每年約90萬人被診斷為胃癌，約70萬人死于胃癌[1]。目前對于胃癌的治療以手術為主，但無論是早期還是中晚期胃癌均存在術后復發的情況，尋找有效的早期診斷指標及治療標靶是胃癌處理中的一個難題。

miRNA是一類長18–25個核苷酸組成的內源性非蛋白編碼RNA，在體內分布廣泛，物種間高度保守。在病理及生理條件下，miRNA調節大量蛋白編碼基因的表達，并形成復雜的調控網絡，在發育、分化、增殖及凋亡等過程中起著非常重要的調節作用。miRNA是最大的一類基因表達轉錄后調控因子，自2002年發現miRNA表達異常與腫瘤相關以來，越來越多的研究表明多種miRNA均參與腫瘤的發生與發展[2-3]。

研究表明，miR-29家族與腫瘤密切相關。研究人員陸續報道了惡性膽管癌、鼻咽癌、肺癌、成神經細胞瘤、橫紋肌肉瘤等多種腫瘤細胞中存在miR-29基因簇或單個基因表達異常[4-10]。miRNA-29家族是一類抑癌基因，對胃癌細胞的增殖和轉移發揮負調控作用[11]。最近有研究顯示，miR-29表達水平與胃癌患者生存率有密切關系，miR-29高表達胃癌患者與miR-29低表達胃癌患者相比，術后5年生存率更高，提示miR-29家族與胃癌的發生發展可能密切相關[12]。

miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c等3個成員，且分為miR-29b1a、miR-29b2c兩個基因簇位于不同的染色體上。本研究克隆了miR-29b2c基因片段，并構建了重組腺病毒，發現Ad-miR-29b2c能顯著抑制胃癌細胞HGC-27和MGC-803的增殖和遷移。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

pAdTrack-CMV穿梭質粒、pAdEasy-1腺病毒骨架質粒、HGC-27細胞、293A細胞、BJ5183感受態 (實驗室保存)。限制性內切酶Ⅱ、Ⅰ (Promega公司)；Ⅰ、Ⅰ (NEB公司)；DL2000、λ DNA/d Ⅲ核酸分子量標準 (TaKaRa 公司)；膠回收試劑盒 (AXYGEN公司)；質粒提取試劑盒 (QIAGEN公司)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)；man熒光定量PCR試劑盒 (Applied Biosystems公司)；DMEM細胞培養基、胎牛血清 (GIBCO公司)。miRNA提取試劑盒 (Ambion公司)；miRNA反轉錄及熒光定量檢測試劑盒 (Applied Biosystems公司)。PVDF膜 (Millipore公司)，Anti-GAPDH、Anti-Catenin (BOSTER公司)，鼠二抗、兔二抗 (KPL公司)。BCA試劑盒 (Thermo公司)，超敏ECL化學發光試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、蛋白上樣緩沖溶液 (碧云天公司)，蛋白酶抑制劑Cooktail (Roche公司)。

引物設計與合成：用于PCR擴增miR-29b2c片段的引物如下，下劃線為引入的酶切位點。

29F：AGATCTGCCTACAGGGTCA TGGGAT；29R：TCTAGACCAGGGAC CACTTCTCATT。

插入載體的是前體序列，分別為miR-29b (GenBank Accession No. NR_029518.1) 和miR-29c (GenBank Accession No. NR_029832.1)。

1.2 穿梭表達載體pAdT-29b2c的構建

PCR擴增出的miR-29b2c片段經Ⅱ/Ⅰ雙酶切后亞克隆到pAdTrack-CMV載體，構建出重組穿梭質粒pAdT-29b2c。重組質粒經測序鑒定，序列完全正確。

1.3 重組腺病毒Ad-miR-29b2c的構建

pAdT-29b2c質粒經Ⅰ線性化后，與pAdEasy-1腺病毒骨架質粒共轉化BJ5183感受態細胞，在胞內進行同源重組，涂卡那霉素平板后培養18–24 h，挑取較小單克隆，提取質粒后經Ⅰ酶切鑒定。得到重組腺病毒質粒pAd-miR-29b2c。

1.4 重組腺病毒pAd-miR-29b2c的包裝和擴增

取4 μg重組腺病毒質粒pAd-miR-29b2c，經Ⅰ酶切線性化，用乙醇進行沉淀回收，按照Lipofectamine 2000轉染試劑要求，轉染至70%匯合度的293A細胞中，1–2周后可以觀察到擴增斑。50%的細胞變圓并漂起后收集細胞，4次液氮/37 ℃反復凍融后離心得到第1代重組腺病毒。

1.5 細胞增殖實驗

取對數生長期的HGC-27和MGC-803細胞，胰酶消化后接種于96孔板。實驗分為5組，對照組給予含pAd-GFP的完全培養基，實驗組用完全培養基配置不同滴度的上述收集的重組腺病毒pAd-miR-29b2c，用pAd-GFP調整實驗組病毒總量，保證每組細胞感染了相同總量的重組腺病毒以降低實驗誤差；每組設置5個平行復孔，在37 ℃、5% CO2條件下置于培養箱中培養24 h。然后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，于培養箱中繼續培養4 h后，棄掉培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩混勻，用酶標儀測定在570 nm處的吸光度，根據吸光值比較各組細胞增殖情況。

1.6 細胞遷移實驗

取對數生長期的HGC-27和MGC-803細胞，胰酶消化后接種于6孔板 (過夜鋪滿)。翌日用干凈的藍槍頭均勻劃痕，將不同濃度的重組腺病毒pAd-miR-29b2c及空白對照置于含pAd-GFP的無血清培養基中繼續培養，觀察24 h和48 h后遷移到劃痕區細胞的情況，每組設 3個重復孔。

1.7 實時定量PCR

采用miRNA分離提取試劑盒提取總miRNA，miRNA經Applied Biosystems miRNA反轉錄試劑盒反轉錄后采用man探針法定量分析miR-29b及miR-29c水平。

1.8 蛋白印跡實驗

取對數生長期的胃癌細胞，胰酶消化后接種于6孔板。翌日，分別轉染Ad-GFP和Ad-miR-29b2c。細胞融合至90%左右，取出6孔板，預冷PBS清洗2–3次，再加入預先配好的細胞裂解液，充分裂解后，經BCA蛋白測定試劑盒測得總蛋白濃度。裂解液中加入蛋白上樣緩沖溶液，沸水浴10 min變性，進行10% SDS-PAGE。電泳結束后，用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，電轉結束后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，將PVDF膜移至配好的GAPDH和Catenin一抗 (1∶1 000) 中，4 ℃孵育過夜。TBST溶液洗膜6次，8 min/次，分別加入鼠二抗、兔二抗 (1∶5 000) 于28 ℃孵育1 h，TBST溶液洗膜6次，8 min/次，加入超敏ECL化學發光液后置于暗室曝光。

2 結果與分析

2.1 pAdT-29b2c穿梭質粒的構建與鑒定

PCR擴增出miR-29b2c片段，凝膠電泳檢測，如圖1所示，片段大小與設計一致。目標片段及pAd-Track-CMV空載體經Ⅱ/Ⅰ雙酶切后用T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌后挑取單克隆，小量提取質粒，并用Ⅱ/Ⅰ雙酶切進行初步鑒定。如圖2所示，質粒經Ⅱ/Ⅰ雙酶切后，出現了一條約1.3 kb的小片段。取陽性克隆送公司測序，結果證明插入序列與設計完全一致，沒有突變，插入方向正確。結果表明重組穿梭質粒pAdT-29b2c構建成功。

2.2 重組腺病毒載體的構建及鑒定

重組穿梭質粒pAdT-29b2c經Ⅰ酶切線性化后凝膠電泳回收?；厥掌闻c100 ng腺病毒骨架載體pAdEasy-1混合后，電轉化BJ5183感受態細胞，挑菌、提取重組質粒，重組質粒經Ⅰ酶切，電泳。如圖3所示，根據重組腺病毒包裝系統說明書，酶切產生4.5 kb的片段，說明腺病毒重組成功[13]，命名為pAd-miR-29b2c。

圖1 miR-29b2c基因序列的擴增

圖2 重組穿梭質粒pAdT-29b2c的酶切鑒定

圖3 PacⅠ酶切重組質粒pAd-miR-29b2c

2.3 重組腺病毒的包裝及擴增

腺病毒重組質粒經Ⅰ酶切線性化后，轉染293A細胞進行包裝，48 h后熒光顯微鏡下可見少量GFP (綠色熒光蛋白) 的表達，1周后細胞基本都變綠，如圖4所示。50%的細胞漂起后收集細胞，反復凍融釋放病毒 (Ad-miR-29b2c)，重新感染新鮮的293A細胞進行病毒擴增。

2.4 重組腺病毒在HGC-27細胞中的表達

培養HGC-27細胞，在對數生長期分別感染Ad-GFP及重組腺病毒Ad-miR-29b2c。24及48 h后收集細胞，提取總miRNA，采用man探針法對miR-29b及miR-29c進行定量分析。如圖5所示，與感染Ad-GFP組相比，感染Ad-miR-29b2c組miR-29b及miR-29c表達水平明顯升高。

2.5 重組腺病毒對HGC-27和MGC-803細胞增殖的影響

HGC-27細胞分別感染Ad-GFP及Ad-miR-29b2c，24、48及72 h后MTT法檢測抑制效果。如圖6所示，與感染Ad-GFP組相比，感染Ad-miR-29b2c組對HGC-27和MGC-803細胞有明顯的抑制作用，48 h及72 h比24 h抑制作用更強。

2.6 重組腺病毒對HGC-27和MGC-803細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示 (圖7)，與感染Ad-GFP組相比，感染Ad-miR-29b2c組HGC-27和MGC-803細胞遷移明顯受到了抑制。

圖4 線性化重組質粒pAd-miR-29b2c轉染293A細胞3 d (A) 和5 d (B) 后的綠色熒光蛋白表達

圖5 Real-time PCR分析經重組腺病毒感染后的HGC-27細胞中miR-29b和miR-29c表達水平

圖6 HGC-27和MGC-803細胞感染重組腺病毒后MTT分析細胞活力

圖7 HGC-27和MGC-803細胞中細胞遷移分析

2.7 重組腺病毒對HGC-27和MGC-803細胞Catenin蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，與感染Ad-GFP組相比，感染Ad-miR-29b2c組Catenin蛋白表達水平明顯降低，如圖8所示。

圖8 蛋白印跡分析δ-catenin在HGC-27和MGC-803細胞中的表達

3 討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一[14]，全球范圍內發病率高，僅次于肺癌、乳腺癌及結直腸癌[15]。胃癌死亡率更是位居惡性腫瘤第二[16]。我國每年新發病例大約40萬，約占世界總發病例數的42%[17]。胃癌已經嚴重威脅我國居民的生活健康。

miRNA的發現及其調控機制的闡明為深入理解很多生理病理過程提供了新的重要線索及視野[3,18-20]。近年來，研究發現，多種miRNA的異常表達與胃癌的發生發展密切相關 (miR-448[21]、miR-let-7a[22]、miR-133[23]、miR-206[24])。

miR-29家族包含miR-29a、miR-29b及miR-29c等3個成員。研究表明，miR-29家族通常扮演抑癌基因的角色，抑制多種腫瘤細胞的生長[25]。

目前，雖然miR-29c已被發現與胃癌細胞增殖相關，但miR-29家族在體內分布在不同的染色體上，miR-29b與miR-29a及miR-29c分別形成兩個miRNA簇，即miR-29b1a及miR-29b2c。miRNA通常在物種之間非常保守，主要通過其種子序列靶向結合于靶mRNA 3′非翻譯區，抑制靶基因的翻譯。miR-29a、miR-29b及miR-29c種子序列完全一致，即5′-UAGCACCAU-3′。研究表明，miR-29家族成員在多種細胞內可以同時靶向同1個靶mRNA，該調控模式的意義還有待研究。miR-29b1a和miR-29b2c存在于不同的基因簇，加工后分別表達miR-29b、miR-29a及miR-29b、miR-29c。為了研究miR-29b2c與胃癌之間的關系，本研究克隆了其片段，并包裝成重組腺病毒，模擬體內miR-29b與miR-29c共表達的現象，通過細胞增殖及遷移實驗，發現miR-29b與miR-29c能顯著抑制胃癌細胞增殖及遷移，為實現腺病毒基因治療胃癌提供線索。miR-29b1a是否具有相同或類似的影響胃癌細胞增殖及遷移的活性，需要單獨包裝其腺病毒，作進一步的研究。

研究表明，胃癌細胞的增殖、遷移受到多個信號通路的影響，如PI3K/Akt信號途徑。在胃癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均能檢測到PI3K/Akt途徑的活化[26-28]，并通過其下游效應分子調節腫瘤細胞的分化、侵襲轉移等，與臨床腫瘤預后密切相關。此外，HIF-1α/VEGF途徑在胃癌的發生、發展及侵襲轉移方面也發揮了重要作用。胃癌組織的低氧狀態誘導HIF-1α的活化，從而調節包括葡萄糖轉運蛋白、血管內皮生長因子等多種基因的表達水平，導致胃癌惡化、轉移[29]。

δ-catenin最初作為1個神經特異性表達蛋白被發現。研究表明，δ-catenin可以與經典的鈣粘素、鈣調節的細胞-細胞鏈接蛋白等相互作用，參與多種人類疾病的發生發展過程，如δ-catenin的表達異常與近視、阿爾茲海默病及精神分裂癥相關[30]。最新的研究表明，δ-catenin影響Wnt信號通路及參與Rho GTP酶的調節，其突變及表達紊亂與包括胃癌在內的多種腫瘤的增殖及轉移密切相關[31]。鑒于δ-catenin在胃癌發生發展中的重要性，以及其被預測為miR-29家族的潛在靶基因，我們在胃癌細胞中檢測了其表達水平是否受到miR-29家族的調控。

綜上所述，腺病毒介導的過表達miR-29b2c抑制HGC-27及MGC-803胃癌細胞增殖和遷移，該活性可能與δ-catenin蛋白表達水平有關。

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(本文責編 陳宏宇)

Effects of recombinant adenovirus Ad-miR-29b2c on HGC-27 cell proliferation and migration

Ailing Luo, Chunyuan Du, Xuemei Zhao, Jichao Liang, and Yong Chen

Hubei Province Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine, Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio-resources, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China

We constructed recombinant adenoviruses expressing miR-29b2c (Ad-miR29b2c), and analyzed their effects on the proliferation and migration of HGC-27 and MGC-803 cells. miR-29b2c gene was amplified by PCR from genomic DNA and cloned into the pAdTrack-CMV vector to create the shuttle plasmid pAdT-29b2c. The recombinant plasmid was verified by restriction enzyme digestion and sequencing. The linearized shuttle vector was mixed with an adenoviral backbone plasmid (pAdEasy-1), followed by cotransformation into competent BJ5183 cells to generate the recombinant plasmid pAd-miR-29b2c. Finally, recombinant adenoviral vectors were generated by transfecting the recombinant plasmid into 293A packaging cell line. HGC-27 and MGC-803 cells were infected with the recombinant adenoviruses expressing pAd-miR-29b2c, then MTT and wound-healing assay were used to analyze the effects of pAd-miR-29b2c on the proliferation and migration of HGC-27 and MGC-803 cells. The miR-29b and miR-29c levels were significantly increased in HGC-27 cells after infected with pAd-miR-29b2c. MTT and wound-healing analysis also revealed a significant decrease in proliferation and migration of HGC-27 and MGC-803 cells compared to the control Ad-GFP-infected cells. Furthermore, western blotting results demonstrated that the protein expression level of δ-catenin was reduced in pAd-miR-29b2c transfected HGC-27 and MGC-803 cells. Taken together, the recombinant adenoviral vector was generated, and it can significantly inhibit the proliferation and migration of HGC-27 and MGC-803 cells.

miR-29, gastric cancer, recombinant adenovirus, gene therapy

January 4, 2017; Accepted:April 6, 2017

Jichao Liang. Tel/Fax: +86-27-88663590; E-mail: liang529114@163.com Yong Chen. Tel/Fax: +86-27-88663882; E-mail: cy101610@qq.com

Supported by:Young Talent Project of the Education Department of Hubei Province (No. Q20141002).

湖北省教育廳科學技術研究計劃青年人才項目 (No. Q20141002) 資助。

網絡出版時間：2017-04-18

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170418.1109.001.html