耐硒產纖維素酶菌株的篩選

袁 帥 王宇哲 張可然 黃鳳華 張西鋒

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023)

耐硒產纖維素酶菌株的篩選

袁 帥 王宇哲 張可然 黃鳳華 張西鋒

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023)

采用硒選擇培養基和剛果紅平板法對耐硒產纖維素酶菌株進行初篩，通過透明圈的大小篩選了耐2500mg/L濃度Se的13株菌株，并對篩選菌株的產纖維素酶活力進行了初步的檢測。

纖維素酶 菌株

1 前言

纖維素是植物光合作用下產物，且是目前自然界中含量非常大的一類可再生資源，有機肥料等部分物質可由其制備而成，但每年也會有大量秸稈等富含纖維素的生物體被焚燒造成環境的污染和資源的浪費，因此，如何利用好自然界中的纖維素對人類未來的發展有著重要的意義。目前，肥料是農作物的生長所離不開的物質，而有機肥料則需要通過秸稈等物質內部纖維素的分解來進一步生產，同時人們對健康生活的追求使富硒產品的需求量增加。但目前大部分土壤并不是富硒的環境，所以非富硒地區的農業生產開始對富硒有機肥料有所需求，通過在農作物的生長過程中加入有機肥料的方式來達到農作物含硒的目的。而富硒有機化肥的生產離不開可耐受高濃度硒的纖維素菌種或菌群，所以，篩選出耐受高濃度硒的纖維素菌種或菌群對富硒有機化肥的生產有著重要的意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 土樣：湖北恩施富硒礦床土樣。

2.1.2 其他實驗材料：蛋白胨、酵母提取物、蒸餾水、氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、亞硒酸鈉等均為國產試劑。

2.2 培養基

2.2.1 富集培養基和液體發酵培養基：

富集培養基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，自然pH值。液體發酵培養基：富集培養基+Na2SeO3 150mg/L。

2.2.2 梯度硒選擇培養基和富硒固體培養基：

梯度硒選擇培養基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，Na2SeO3（500、1000、1500、2000和2500）mg/L，自然pH值。富硒固體培養基：梯度硒選擇培養基+瓊脂粉15g/L。

2.2.3 剛果紅篩選纖維素瓊脂培養基：

KNO3（2g/L），KH2PO4（1g/L），MgSO4（0.5 g/L），NaCl（1g/L），Na2HPO4（1g/L），CMC-Na（20g/L），Na2SeO32500mg/L，瓊脂（15g/L），自然pH值。

2.2 方法

2.2.1 耐硒菌種的分離：

收集湖北恩施富硒茶田土富硒土樣，將土樣放入燒杯中，加入無菌磷酸鹽緩沖液懸浮，在常溫、180r/min的環境下于搖床中振蕩30min，靜置，待沙礫和大顆粒沉降后收集懸浮液。取懸浮液的一部分經5000r/min離心10min后，收集沉淀（沉淀用5ml無菌磷酸鹽緩沖液懸浮后放入4℃冰箱保存）。另一部分2ml的懸浮液加入富集培養基中擴培，在37℃、180r/min的條件下振蕩培養2d，放入4℃冰箱保存。

取上述擴培液加入含150μg/ml Na2SeO3的液體發酵培養基的250ml三角瓶中，在37℃、180r/min的條件下振蕩培養2天。以5%接種量繼代培養4次后，接種到硒的濃度為Se（500、1000、1500、2000和2500mg/L）的梯度硒選擇培養基中，繼續培養48h。在2500mg/L的梯度硒選擇培養基中存活的菌株即為耐硒的菌株。

2.2.2 耐硒纖維素分解菌的分離：

取耐硒菌液，經蒸餾水稀釋后涂布在相對應濃度Na2SeO3（2500mg/L）的剛果紅篩選纖維素瓊脂培養基上，在37℃恒溫培養箱中培養48h，在培養結束后往培養皿中加入適量的剛果紅溶液，染色1h后棄去染液，加入適量1 mol/L的NaCl溶液，洗滌1h。根據菌落周圍透明圈直徑與菌落直徑的比值大小選擇菌株。對比值大的菌落進一步分離并保存，在編號后用于后續纖維素酶活力強弱的研究測定。共篩選出了13株耐硒菌株。

2.2.3 標準曲線的繪制

標準曲線的繪制采用文獻1的方法[1]。

2.2.4 內切型β-葡聚糖酶活力的測定

內切型β-葡聚糖酶活力的測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[2]。

3 結果

3.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，葡萄糖溶液含糖的毫摩爾數（酶活力）為橫坐標，繪制標準曲線的標準曲線如下：y=0.1597x-0.0807。

圖1 標準曲線

3.2 菌種的分離與篩選

通過剛果紅染色使產纖維素酶的菌落周圍形成透明圈，如下圖所示。共篩選出13株耐硒2500mg/L的菌株。使用剛果紅平板篩選法可以更好地篩選出耐硒纖維素菌，可以非常直觀地看出平板上分布著各種大大小小的透明圈，一個透明圈就意味著存在這樣一個耐硒菌種。另外根據菌種周圍透明圈的大小可以判斷出它的酶產量，透明圈越大說明它的酶產量越多，透明圈成型越快說明它的產酶量越快。

圖1 菌株在平板上形成的透明圈（箭頭所指）

3.3 菌株纖維素酶活力的測定

以液體LB培養基培養菌株篩選的耐硒菌株，在12h和24h分別取樣，測定內切型β-葡聚糖酶的活力。

Table 1 12h內切型β-葡聚糖酶的活力

Table. 2 24h內切型β-葡聚糖酶的活力

4 結論

纖維素是地球上最廉價和最豐富的可再生資源，可以轉化為飼料、能源、化工原料和食品等。但纖維素酶活力不高制約了纖維素的廣泛應用。因此，選育產酶活力高、遺傳穩定性好的菌株是解決纖維素有效利用的關鍵問題之一。硒是人體必需的微量元素。硒在提高人體免疫力和抗氧化方面具有非常好的功效，并具有抗腫瘤活性，對多種癌癥具有明顯的抑制作用。這就促進了富硒食品的研究與開發。富硒有機肥的生產與應用可以解決食品中有機硒的含量。本研究篩選了13株耐硒產纖維素酶菌株，下一步將對各菌株進行鑒定。篩選的菌株可用于富硒有機肥的生產與利用，促進富硒有機肥事業的發展。

[1] 蔡勇.堿性纖維素酶高產菌株的篩選及其基因的克隆與表達[D].西北農林科技大學，2005.

[2] 管斌，謝來蘇，丁友防，等.纖維素酶酶活力測 定方法的校正[J].無錫輕工大學學報，1999，（4）：20-26.

武漢輕工大學大學生科研項目（xsky2016008）

袁帥（1996-），男，本科生。

張西鋒（1977-），男，博士，副教授。