不同胎齡小鼠腦組織中神經干細胞所占比例的研究

張鳳蘭，楊璐軍，朱紅梅，張南煬，沙學芳，朱柯穎，肖志成,5*

(1.昆明醫科大學分子臨床醫學研究院,云南省干細胞和再生醫學重點實驗室，昆明 650500； 2.深圳市寶安區人民醫院，深圳 518101； 3.南方醫科大學珠江醫院神經外科,廣東神經外科研究所,廣東省腦功能修復與再生重點實驗室，廣州 510282；4.昆明醫科大學基礎醫學院，昆明 650500； 5.澳大利亞莫納什大學免疫與干細胞研究中心，墨爾本VIC3010)

不同胎齡小鼠腦組織中神經干細胞所占比例的研究

張鳳蘭1，楊璐軍2,3，朱紅梅1，張南煬1，沙學芳4，朱柯穎4，肖志成1,5*

(1.昆明醫科大學分子臨床醫學研究院,云南省干細胞和再生醫學重點實驗室，昆明 650500； 2.深圳市寶安區人民醫院，深圳 518101； 3.南方醫科大學珠江醫院神經外科,廣東神經外科研究所,廣東省腦功能修復與再生重點實驗室，廣州 510282；4.昆明醫科大學基礎醫學院，昆明 650500； 5.澳大利亞莫納什大學免疫與干細胞研究中心，墨爾本VIC3010)

目的 詳細了解并比較不同胎齡小鼠全腦和大腦皮層組織中神經干細胞(neural stem cells，NSCs)所占比例，為后期優化分離培養NSCs提供直接量化數據。方法 分離不同胎齡小鼠全腦(胎齡12.5、14、16和18 d)和大腦皮層(胎齡14、16 和18 d)組織，消化成單細胞懸液，貼壁培養3 ～ 4 h，細胞免疫熒光標記NSCs特異性標記物Nestin，統計分析各組中NSCs所占比例。另外，通過實時熒光定量PCR技術檢測Nestin mRNA在不同胎齡(12.5、14、16和18 d)小鼠大腦皮層中的表達水平。結果 細胞免疫熒光結果顯示，分離培養的不同胎齡小鼠全腦和大腦皮層組織中均有Nestin陽性細胞。在分離培養的小鼠全腦組織中胎齡12.5 d組NSCs所占比例最高，為53.42% ± 1.57%；胎齡18 d組NSCs所占比例最低，為25.96% ± 1.31%，而胎齡14 d組和16 d組位于二者之間。在分離培養的不同胎齡小鼠大腦皮層組織中，胎齡14 d組NSCs所占比例最高，為33.65% ± 0.29%；胎齡18 d組比例最低，為25.29% ± 0.28%，胎齡16 d組位于二者之間(26.82% ± 0.30%)。實時熒光定量PCR結果顯示，當把胎齡12.5 d組的小鼠大腦皮層組織中Nestin mRNA表達水平設定為1，胎齡14 d組的小鼠大腦皮層組織中Nestin mRNA的相對表達量為0.83± 0.04，胎齡16 d組為0.77± 0.05，胎齡18 d組為0.44± 0.05。因此，隨著小鼠胎齡增加，小鼠大腦皮層中的Nestin mRNA的表達水平逐漸下降。結論 在小鼠大腦發育過程中，隨著胎齡增加，分離培養的小鼠全腦和大腦皮層組織中神經干細胞比例逐漸降低。

小鼠；不同胎齡；神經干細胞；全腦；大腦皮層

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是中樞神經系統中一類能夠自我更新，增殖并分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的細胞[1，2]。1992，Reynolds 和Weiss在成體小鼠紋狀體中首次分離培養出NSCs[3]。自此以后，NSCs的基礎研究和臨床應用成為國內外新熱點[4，5]。近年來，小鼠NSCs體外分離培養技術已被廣泛報道，但是所用小鼠胎齡有所不同[6]。本實驗旨在統計分析分離培養的不同胎齡小鼠全腦和大腦皮層細胞中NSCs所占比例及差異，為后期優化培養高純度NSCs提供直接量化數據和前期研究基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號【SCXK(京)2011-0011】，后在昆明醫科大學清潔級實驗動物房繁殖飼養【SYXK(滇)2005-0004】。

1.2 主要試劑

Nestin抗體(Millipore公司)，山羊抗小鼠熒光二抗(Abcam公司)，DMEM/F12細胞培養基(Gibco公司)，堿性成纖維生長因子(bFGF，Peprotech公司)，表皮生長因子(EGF，Peprotech公司)，B27(Gibco公司)，0.05% EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司)，多聚甲醛(索萊寶公司)，BSA(索萊寶公司)，DAPI(羅氏公司)，Trizol(Sigma公司)，DNaseI(寶生物公司)，PrimerScript RT reagent Kit(寶生物公司)，Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)(羅氏公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠大腦組織細胞的分離培養

將20～ 26 g左右健康成年C57BL/6雌性小鼠與雄性小鼠于傍晚合籠，次日觀察雌性小鼠有無陰道栓，若有則表示交配成功，記為胎齡0.5 d(embryonic 0.5 d，E0.5)。標記多只孕鼠，分別在胎齡12.5 d(E12.5)、14 d(E14)、16 d(E16)和18 d(E18)時使用。將孕鼠麻醉，在無菌條件下每組至少分離3 ～ 4只雌雄不限的胎鼠全腦和大腦皮層，加入適量0.05% EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴中消化腦組織，然后輕柔吹散成單個細胞，800 rpm離心10 min，棄上清，加入含2% B27，20 ng/mL的EGF和bFGF的DMEM/F12生長培養基調整細胞密度，按照 5 × 105cells/mL接種至已包被細胞外基質的24孔細胞培養板中培養3 ～ 4 h。然后加入4%多聚甲醛固定30 min，用于后期細胞免疫熒光實驗。

1.3.2 細胞免疫熒光染色

將固定的細胞用PBS洗3遍，孔內加入0.3% Triton X-100打孔10 min，然后加入10% BSA室溫封閉1 h。再次用PBS洗3遍，加入Nestin一抗(1∶50)4℃孵育過夜，次日用PBS清洗后加入相應的二抗(1∶1000)室溫孵育1 h(此后需避光)，最后加入DAPI細胞核染色5 min。熒光顯微鏡下觀察，然后每個樣品隨機采集至少5張細胞分布較均勻的圖片，計數Nestin陽性細胞和DAPI陽性細胞并計算二者比例。

1.3.3 RNA抽提及real-time PCR

每組至少分離3只12.5 d(E12.5)、14 d(E14)、16 d(E16)和18 d(E18)胎齡的雌雄不限的胎鼠大腦皮層，加入適量Trizol研磨至組織完全溶解，按照說明書操作步驟抽提總RNA，加入DNaseI去除基因組DNA。然后按照Primer Script RT reagent Kit(Perfect Real-time)說明書逆轉獲取cDNA。應用ABI7300型熒光定量PCR儀，使用Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)進行擴增。Nestin上游引物序列為5′-AAAGTTCCAGCTGG CTGTGG-3′，下游引物序列為5′-TGGGGTCAGG AAAGCCAAGA-3′，Gapdh上游引物序列為5′-TGACGTGCCGCCTGGAGAAA-3′，下游引物序列為5′-AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG-3′。實驗結果采用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同胎齡小鼠全腦NSCs的比例及差異

通過觀察4組細胞免疫熒光圖發現，不同胎齡小鼠全腦組織細胞經消化分離后，未見細胞團塊幾乎全為單細胞，且未發現碎裂細胞殘片。細胞貼壁培養3 ～ 4 h后，能較好貼壁。DAPI陽性細胞呈藍色，在細胞核中均勻分布。Nestin陽性細胞呈綠色，在細胞質中均勻分布。且胎齡12.5 d組Nestin陽性細胞比例較胎齡14、16 d和18 d組高(圖1)。

圖1 不同胎齡小鼠全腦組織中的NSCs (細胞免疫熒光染色)Fig.1 NSCs in the whole brain of mice at different embryonic days (Imunofluorescence staining)

注：***P< 0.001。圖2 不同胎齡小鼠全腦組織NSCs的比例Note. ***P< 0.001 showing a significant difference at different embryonic days.Fig.2 Proportion of NSCs in the whole brain of mice at different embryonic days

細胞免疫熒光統計分析顯示，胎齡12.5 d組分離培養的全腦細胞中NSCs所占比例最高，為53.42% ± 1.57%，并與其他三組差異有顯著性(P< 0.001)。胎齡18 d組所占比例最低，為25.96% ± 1.31%，胎齡14 d和16 d 組位于二者之間。另外，胎齡14 d組NSCs比例(33.77% ± 1.12%)與胎齡18 d組之間差異有顯著性(P<0.05，未標注)(圖2)。2.2 不同胎齡小鼠大腦皮層NSCs的比例及差異

觀察3組不同胎齡小鼠大腦皮層細胞的免疫熒光圖，發現無細胞團塊，無碎裂細胞殘片(與圖1類似)，且胎齡14 d組Nestin陽性細胞比例較胎齡16 d和18 d組高(圖3)。

細胞免疫熒光統計分析顯示，胎齡14 d組小鼠大腦皮層細胞中NSCs所占比例最高，為33.65% ± 0.29%；胎齡18 d組所占比例最低，為25.29% ± 0.28%。胎齡14 d組與16 d組(P< 0.01)和18 d組(P< 0.001)之間差異有顯著性，但胎齡16 d組與18 d組之間差異無顯著性(圖4)。

2.3 不同胎齡小鼠大腦皮層中Nestin mRNA的表達水平

Real-time PCR檢測胎齡12.5、14、16 d和18 d時小鼠大腦皮層中Nestin mRNA的表達水平結果顯示，當把胎齡12.5 d組小鼠大腦皮層的Nestin mRNA表達水平設定為1時，胎齡14 d組的相對表達量為0.83±0.04，16 d組為0.77± 0.05，18 d組為0.44± 0.05。其中，胎齡18 d組小鼠大腦皮層中的Nestin mRNA表達水平最低，與另外三組差異有顯著性(P< 0.01或0.001)。另外，胎齡12.5 d組與胎齡16 d組之間差異有顯著性(P<0.05，未標注)(圖5)。由此可知，隨著小鼠胎齡增加，小鼠大腦皮層中Nestin mRNA的表達水平逐漸下降。

圖3 不同胎齡小鼠大腦皮層的NSCs(細胞免疫熒光染色)Fig.3 NSCs in cerebral cortex of mice at different embryonic days (Immunofluorescence staining)

注：**P< 0.01；***P< 0.001。圖4 不同胎齡小鼠大腦皮層NSCs的比例Note. **P< 0.01; ***P< 0.001.Fig.4 Proportions of NSCs in the cerebral cortex of mice at different embryonic days

注：**P< 0.01；***P< 0.001。圖5 不同胎齡小鼠大腦皮層中Nestin mRNA 的表達水平Note. **P< 0.01; ***P< 0.001.Fig.5 Expression of Nestin mRNA in the cerebral cortex of mice at different embryonic days

3 討論

NSCs的發現是神經科學領域的重要進展, 徹底改變了人們以往認為中樞神經不能再生的傳統理念，為神經系統的研究與應用開辟了廣闊的前景[7，8]。但是，目前NSCs的來源及數量不足仍是臨床應用和基礎研究中普遍存在的問題[1,9]。因此，優化NSCs的體外培養對于研究其潛在價值具有重要意義。

目前，在小鼠的腦源性NSCs研究中，已經建立以胎鼠、新生鼠和成體鼠作為主要供體來源的NSCs培養方法[10，11]。但就胎鼠而言，各科研機構取材時間有所不同，主要集中于胎齡12 d至胎鼠出生前[12，13]。雖然取自不同胎齡小鼠腦組織的神經干細胞都能自我更新，增殖并可以誘導分化，但是如何提高NSCs占分離培養總細胞的比例，減少雜細胞在NSCs培養中造成的負面影響是NSCs培養實驗中非常重要的前期工作[14]。因此，充分了解并比較來自不同胎齡小鼠腦組織中NSCs的比例及其差異是十分必要的。

Nestin是一種中間纖維絲，屬于細胞骨架蛋白[15，16]。它在早期胚胎發育的神經外胚層細胞中強烈表達，隨著神經細胞的遷移和分化表達逐漸減弱，并在神經細胞的分化完成后表達停止[17]。該蛋白是目前廣泛使用的NSCs特異性標記物[1,15]，由神經組織分離培養的細胞，通過細胞免疫熒光染色認為Nestin陽性標記細胞即為NSCs。

本實驗細胞免疫熒光結果表明在小鼠全腦組織分離培養的細胞中，胎齡12.5 d組NSCs占總細胞的比例明顯高于其他三組，并約為胎齡18 d組比例的兩倍。胎齡14 d組與18 d組之間也有顯著性差異。在小鼠大腦皮層分離培養的細胞中，胎齡14 d 組NSCs占總細胞的比例明顯高于胎齡16 d組和胎齡18 d組。另外，由于胎齡12.5 d時小鼠的大腦發育處于初期，大腦體積較小，大腦皮層較薄，消化后所得細胞量較少且細胞死亡率較高，對實驗結果造成較大誤差，故本實驗未將其結果納入分析。Real-time PCR實驗檢測小鼠大腦皮層發育過程中Nestin mRNA的表達水平變化，結果顯示胎齡18 d組小鼠的大腦皮層中Nestin mRNA表達水平顯著低于胎齡較小的其他三組。因此，隨著小鼠胎齡增加，小鼠大腦皮層中的Nestin mRNA表達量逐漸降低，此結果與細胞免疫熒光結果基本一致。

劉曉梅等[18]通過對胎齡8.5 d至13.5 d的Nestin-GFP轉基因小鼠胚胎進行冰凍切片，觀察發現Nestin隨著胚胎發育表達逐步增強，在胎齡11.5 d 至13.5 d時最強。尹曉娟等[19]通過Nestin免疫組化技術分別比較分析了不同胎齡人胎腦室下區NSCs在形態和存在方式上的差異，發現NSCs數量隨著胎齡的增加而減少。楊蓬勃等[20]通過HE染色和免疫組化實驗發現人胎腦VZ/SVZ內含有大量Nestin陽性細胞，隨著發育進行Nestin免疫反應強度和陽性細胞數都逐步降低。此三者研究結果與本實驗結果較一致。吳雨嶺等[21]通過Nestin免疫組織化學方法檢測11、15和19 d胎齡的 Wistar大鼠腦組織中Nestin陽性NSCs的分布及比例，發現隨著胎齡增加腦室室管膜及管膜下區NSCs逐漸增多，19 d時Nestin陽性細胞多達86.1%±11.72%，此結果與本實驗結果及大多數已報道實驗結果有較大差異。

本實驗通過將分離的腦細胞短暫貼壁培養后立即進行Nestin細胞免疫熒光染色，能真實反映所分離腦組織中NSCs數量及比例，且樣品為單層細胞，便于統計分析，數據可靠性更高。另外，本方法還能檢測分離腦組織細胞過程中操作是否合格，是否因操作不足有細胞團塊存在或操作過度有細胞死亡或細胞碎片存在等。

綜上所述，在分離培養小鼠NSCs實驗中，我們推薦分離12.5 d胎齡的小鼠全腦或者14 d胎齡的小鼠大腦皮層進行培養，以獲得起始純度較高的NSCs，通過快速擴增，用于后期實驗。

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Proportion of neural stem cells in brain tissues of miceat different embryonic days

ZHANG Feng-lan1， YANG Lu-jun2, 3， ZHU Hong-mei1， ZHANG Nan-yang1，SHA Xue-fang4， ZHU Ke-ying4， XIAO Zhi-cheng1, 5*

(1.Key Laboratory of Stem Cell And Regenerative Medicine, Institute of Molecular And Clinical Medicine, KunmingMedical University, Kunming 650500, China； 2.Department of Neurosurgery, Baoan People’s Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518101； 3.Neurosurgery Institute, Key Laboratory on Brain Function Repair And Regeneration ofGuangdong Province, Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou510282； 4.Basic Medical College, Kunming Medical University, Kunming 650500； 5.Department of Anatomy AndDevelopmental Biology, Monash University, Clayton, Victoria 3800 Australia)

Objective To understand and compare the proportion of neural stem cells (NSCs) in the whole brain and cerebral cortex of mice at different embryonic days, and provide quantitative data for the later optimization of NSCs isolation and culture. Methods The whole brains (at embryonic 12.5, 14, 16 and 18 days) and cerebral cortex (at embryonic14, 16 and 18 days) were isolated and digested into single cell suspension, and were adherently cultured for 3-4 h.Immunofluorescence staining of Nestin, a NSCs specific marker, was used to statistically analyze the proportion of NSCs in each group.Expression of Nestin mRNA in the cerebral cortex of mice at E12.5, E14, E16, and E18 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The result of immunofluorescence assay showed that there were Nestin-positive cells in the whole brain and cerebral cortex of mice at different embryonic days. In the whole brain,the proportion of NSCs was highest at E12.5 (53.42±1.57%) and lowest at E18(25.96±1.31%), and the proportions at E14 and E16 were placed in the middle among the groups. In the cerebral cortex, the highest proportion of NSCs was at E14 (33.65±0.29%), and the lowest at E18(25.29±0.28%), and the middle at E16 (26.82±0.30%).The result of real-time PCR showed that when the mRNA expression of Nestin in the cerebral cortex was set to 1, the relative mRNA expression of Nestin was 0.83±0.04 at E14, 0.77±0.05 at E16, and 0.44 ±0.05 at E18. Thus, the mRNA expression level of Nestin in the mouse cerebral cortex was gradually decreasing with the increase of embryonic days. Conclusions During the brain development, the proportion of NSCs is gradually decreasing in the whole brain and cerebral cortex of mice with the increase of embryonic days.

Mouse; Embryonic days; Neural stem cells; Brain development; Cerebral cortex

云南省高端人才引進計劃(編號：20080A004)；云南省干細胞和再生醫學重點實驗室(編號：2015DG027)。

張鳳蘭(1986-)，女，博士研究生，研究方向：神經干細胞與miRNAs。Email: FenglanZhang2016@126.com

肖志成(1957-)，男，教授，博士導師，研究方向：神經退行性疾病。Email: zhicheng.xiao@monash.edu

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0048-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.009

2017-01-08