響應面優化酶法酯交換催化合成中長鏈結構甘三酯

陸繼源，王小三，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122)

油脂深加工

響應面優化酶法酯交換催化合成中長鏈結構甘三酯

陸繼源，王小三，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122)

采用響應面法對脂肪酶Lipozyme 435在無溶劑體系中催化中鏈甘三酯(MCT)和大豆油酯交換反應合成中長鏈甘三酯的反應條件進行優化,并采用超高壓液相色譜-飛行時間質譜在正離子模式下對反應產物的甘三酯構型進行分析。結果表明：反應溫度和反應時間對中長鏈甘三酯含量具有極顯著性影響(P<0.01)。最佳反應條件為大豆油與MCT質量比60∶40，反應時間4.36 h，反應溫度89 ℃，加酶量(以底物質量計)5.5%。在此條件下，中長鏈甘三酯含量達到84.15%。CyCyL、CyCyLn、LOCy、LPCy、OOCy和LOCa為反應產物的主要甘三酯構型。

中長鏈結構甘三酯；Lipozyme 435；酯交換；響應面；甘三酯構型

中長鏈結構甘油三酯(MLCT)是指一個甘油骨架同時含有中碳鏈脂肪酸和長碳鏈脂肪酸的甘三酯。MLCT具有快速供能，減少脂肪積累的營養代謝優勢[1-3]，同時具有煙點低，不易起泡的優良煎炸特性[4-5]，在食品、醫藥行業需求與日俱增，市場潛力巨大。

目前，國內外合成MLCT的方法主要有酶法和化學法。與化學法相比，酶法催化反應條件溫和、節省能源、脂肪酶專一性強、副反應少、產品容易回收、對環境沒有污染，所得產物的安全性更高[6]。近年來學者們對于酶法制備MLCT的研究重點在酸解和酯化上，而對酶法酯交換合成的研究報道很少，多集中在新資源油料上。Zhao等[7]利用脂肪酶Lipozyme RM IM催化香樟籽油和山茶油酯交換反應合成MLCT含量55.81%的結構脂。Khodadadi等[8]研究了有機溶劑體系下，Novozym 435催化亞麻籽油和辛酸甘油三酯的酯交換合成工藝，合成了MLCT含量46.21%的產品。

本研究以大豆油和中鏈甘三酯(MCT)為原料，采用響應面法優化脂肪酶Lipozyme 435催化合成MLCT的反應條件，旨在減少酶的用量，縮短反應時間，為酶法制備MLCT的工業化推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆油：中糧東海糧油(張家港)有限公司；中鏈甘三酯：浙江建德千島化工有限公司；Lipozyme 435：諾維信生物技術有限公司；正己烷、甲醇、異丙醇、乙腈，均為色譜純；無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、Tris緩沖液、膽酸鈉、鹽酸、乙醚，均為分析純。

Agilent 7820A氣相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；ELSD 3300蒸發光散射檢測器，美國Grace公司；Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF質譜儀，沃特世科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MLCT的催化合成

將大豆油和MCT按一定質量比混合，加入到密閉的容器中，加入脂肪酶Lipozyme 435，在一定溫度下，磁力攪拌反應一段時間后，停止加熱，反應物轉入離心管中，4 000 r/min 離心5 min，將脂肪酶和油分離，得到含有中長鏈結構甘三酯的產物。

1.2.2 分析方法

產物脂肪酸組成的測定：參考文獻[9]。

產物甘三酯結構測定采用超高壓液相色譜-飛行時間質譜。超高壓液相色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil Gold柱(2.1 mm×100 mm,粒徑1.9 μm)；流動相A為乙腈-甲醇-水(體積比19∶19∶2)，流動相B為異丙醇(流動相A、B中均添加5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)；柱溫35℃；進樣量1 μL；流動相洗脫條件見表1。

質譜條件：ESI電離源，正離子模式；毛細管電壓3.1 kV，錐孔電壓40.0 V，離子源溫度120℃，脫溶劑溫度450℃；錐孔氣流速80.0 L/h，脫溶劑氣流速600 L/h；掃描方式MSE，一級碰撞電壓6 V，二級碰撞電壓20～40 V；掃描間隔時間0.3 s；掃描范圍100～1 200；采集時間15 min，碰撞氣體為氬氣。

表1 超高壓液相色譜-飛行時間質譜洗脫條件

產物中MLCT含量的測定：參考文獻[10]。

2 結果與討論

2.1 響應面實驗設計及結果

采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計，根據Central Composite Design原理，在前期單因素實驗基礎上，以影響MLCT含量的3個重要因素反應時間(A)、反應溫度(B)和加酶量(以底物質量計)(C)為自變量，以產物中MLCT含量(Y)為響應值，進行響應面優化設計。因素水平見表2，響應面實驗設計及結果見表3。

表2 因素水平

表3 響應面實驗設計及結果

運用Design Expert軟件進行回歸擬合，并進行手動優化后, 獲得回歸方程：Y=58.03+12.92A+34.47B+2.99C+8.51AB+0.038AC+3.258E-003BC-5.13A2-18.75B2-2.14C2。

回歸方程方差分析見表4。

表4 回歸方程方差分析

2.2 響應面分析

圖1為4%加酶量的反應條件下，反應溫度和反應時間交互作用對中長鏈甘三酯含量的影響。從圖1可以看出，中長鏈甘三酯含量的最大值出現在90～105℃和1.5～5.5 h的范圍內。在較高溫度下，中長鏈甘三酯含量隨反應時間的延長升到極大值后出現下降趨勢；在反應時間較長的情況下，中長鏈甘三酯含量隨反應溫度的變化也呈現類似的趨勢，這主要與酶的催化活性有關。反應溫度的控制非常重要，由于酶促催化反應是一個熱動力學過程，影響著酶的催化活性、底物的溶解狀態及黏度、底物和產物的傳質速度等[11]。反應溫度升高，可使酯交換程度和反應速度提高。但反應溫度過高時，也會導致酶變性失活。

圖2為反應時間3 h條件下，反應溫度和加酶量交互作用對中長鏈甘三酯含量的影響。從圖2可以看出，中長鏈甘三酯最高含量出現在90～105℃和2%～7%加酶量的范圍內。隨著反應溫度的不斷升高，中長鏈甘三酯含量上升。這主要是由于反應溫度升高導致脂肪酶的活性升高，脂肪酶Lipozyme 435具有高的熱穩定性，適合在90℃以上的高溫體系下催化酯交換反應。反應速度與加酶量符合動力學關系[12]；當加酶量增加時，反應速度亦隨之增大；當加酶量增大到一定程度，底物和產物的傳質阻力的影響已開始大于酶催化反應速度的影響，其反應速度的增量減少，酶的催化效率降低。

圖3為反應溫度70℃條件下，加酶量和反應時間交互作用對中長鏈甘三酯含量的影響。從圖3可以看出，較高的加酶量和較長的反應時間得到較高的中長鏈甘三酯含量。加酶量和反應時間對中長鏈甘三酯含量的交互作用不顯著，反應時間影響的顯著性要高于加酶量?？傮w來看，在加酶量為3%～7%時，相同的反應時間條件下中長鏈甘三酯含量較高。

圖1 反應溫度和反應時間交互影響

圖2 反應溫度和加酶量交互影響

圖3 反應時間和加酶量交互影響

2.3 反應條件優化及模型驗證

利用Design Expert軟件對酶催化MCT和大豆油酯交換反應合成中長鏈甘三酯的最佳反應條件進行預測，得到最佳的反應條件為：大豆油與MCT質量比60∶40，反應時間4.36 h，反應溫度88.8℃，加酶量5.5%(以底物質量計)?？紤]到實際操作的局限性，將工藝參數中的反應溫度調整為89℃。在此優化條件下進行3次平行驗證實驗，中長鏈甘三酯含量分別為84.78%、83.96%和83.71%，平均含量為84.15%，模型預測值為84.36%，實驗結果與預測值相近，說明該響應面模型預測是有效的。

2.4 產物脂肪酸組成分析

表5為酯交換產物及原料物理混合油的脂肪酸組成。其中中碳鏈脂肪酸C8∶0、C10∶0來自原料MCT，其余脂肪酸來自原料大豆油。酯交換產物的具體反應條件為上述最佳反應條件。

表5 原料物理混合油及酯交換產物的脂肪酸組成 %

從表5可以看出，酯交換反應前后的總脂肪酸組成無顯著性差異，主要是酯交換反應過程中，脂肪酸在甘三酯分子內和分子間碳鏈骨架上發生轉移，因此總脂肪酸組成基本不發生變化。但是脂肪酸在甘三酯碳鏈骨架上的位置重新分布會造成物理混合油和酯交換產物不同位置脂肪酸組成的顯著變化。酯交換反應后，sn-2位上中碳鏈脂肪酸(MCFA)含量下降，而不飽和脂肪酸(UFA)含量則提高到 65.16%。sn-2位上的不飽和脂肪酸能夠在體內被快速地消化和吸收，為人體提供必需脂肪酸，有益人體健康。同時sn-1,3位上的MCFA可以實現快速供能和降低體內脂肪積累的生理功能。因此，酯交換合成的MLCT結構脂能夠提供食用油的基本營養，同時具有獨特的營養代謝優勢，在食用領域具有良好的應用前景。

2.5 產物甘三酯組成

采用常規HPLC-ELSD法對原料物理混合油和自制中長鏈結構甘三酯的甘三酯組成進行初步分析，結果如圖4所示。

從圖4可以看出，16 min之前出峰為MCT，32 min 之后出峰為長鏈甘三酯，中間峰為MLCT。由圖4a可知，原料物理混合油中不含MLCT，圖4b顯示酯交換后有大量MLCT生成。

HPLC不能準確提供甘三酯構型信息，因此進一步采用超高壓液相色譜-飛行時間質譜(UPLC/Q-TOFMS)在正離子模式下分析了酯交換產物的甘三酯構型，結果見表6。

注：Cy, C8∶0; Ca, C10∶0; P, C16∶0; S, C18∶0; O, C18∶1; L, C18∶2; Ln, C18∶3。下同。

圖4 原料物理混合油(a)和酯交換產物(b)

續表6

TAG[M+NH4]+ [DAG]+碎片離子CENsCyCaLn650.61489.50461.46355.3630CyCyL624.61463.47327.3230CyCyP600.61439.48327.3332CyCyS627.61465.49327.3234CyCaL652.61491.48463.44355.3332CaCaLn678.61489.51383.432CaCyP628.61467.52439.48355.3634CaCyO654.61493.53465.49355.3634CaCyS656.71495.52467.49355.3636LnLnCy756.72595.59461.4732LCaCa680.71491.52383.3934LLnCy758.72597.63463.47461.4734CaCaP656.71467.51383.3936CaCaO682.71493.54383.3936CyLL760.72599.64463.4836LnPCy734.72573.61461.46439.4836LnLCa786.82597.62491.52489.4936SCaCa684.71495.54383.3938LPCy736.72575.64463.48439.4738LOCy762.82601.64465.49463.4838LLCa788.82599.64491.5238PPCy712.72551.61439.4840OPCy738.82577.64465.49439.4740OOCy764.82603.67465.540LOCa790.82601.63493.54491.5240PPCa740.82551.61467.5142OPCa766.82577.64493.54467.5142LnLnO894.94599.65597.6244OOCa792.83603.67493.5442LLL896.94599.6442LLnP870.93597.62575.62573.6242SPCa768.82579.66495.54467.5144SOCa794.83605.68495.55493.5344LLO898.94601.65599.6344LLP872.93599.65575.6344OOL900.94601.64603.6746LOP874.93601.64577.66575.6146LPP848.93575.62551.6146OOO920.94603.6748OOP876.93603.67577.6548OPP850.93577.66551.6248SOP878.93605.66579.65577.6450

從表6可以看出，MLCT結構脂中共檢測到45種構型的甘三酯(不包含異構體)，MCT的主要甘三酯構型為CyCyCy、CyCyCa和CyCaCa，大豆油則為LLL、LLnP、LLP、LLO和LOP。結合圖4可知，經過酯交換反應，產物中甘三酯的種類發生明顯變化，CyCyL、CyCyLn、LOCy、LPCy、OOCy和LOCa成為主要甘三酯構型，而原料物理混合油中的主要甘三酯LLL、LLO、LLP、CyCyCy和CyCyCa的含量則大幅降低。

3 結 論

響應面法優化得到Lipozyme 435催化酯交換合成中長鏈甘三酯的最佳反應條件為：反應時間4.36 h，反應溫度89℃，加酶量5.5%，大豆油與MCT質量比60∶40。最佳條件下中長鏈甘三酯平均含量為84.15%。采用超高壓液相色譜-飛行時間質譜分析了酯交換產物的甘三酯構型，結果表明CyCyL、CyCyLn、LOCy、LPCy、OOCy 和LOCa為其主要甘三酯構型。

[1] PAPAMANDJARIS A A, MACDOUGALL D E, JONES P J H. Medium chain fatty acid metabolism and energy expenditure: obesity treatment implications[J]. Life Sci, 1998, 62(14): 1203-1215.

[2] MU H, PORSGAARD T. The metabolism of structured triacylglycerols[J]. Progr Lipid Res, 2005, 44(6): 430-448.

[3] KASAI M, NOSAKA N, MAKI H, et al. Effect of dietary medium-and long-chain triacylglycerols (MLCT) on accumulation of body fat in healthy humans[J]. Asia Pac J Clin Nutr, 2003, 12(2): 151-160.

[4] KOH S P, LONG K, TAN C P, et al. The use of enzymatically synthesized medium-and long-chain triacylglycerols (MLCT) oil blends in food application[J]. Int Food Res J, 2011, 18(1): 355-366.

[5] NEGISHI S, ITAKURA M, ARIMOTO S, et al. Measurement of foaming of frying oil and effect of the composition of TG on foaming[J]. J Am Oil Chem Soc, 2003, 80(5): 471-474.

[6] 何玥, 趙金利, 張參, 等. 酶催化酯交換制備零反式脂肪酸食品專用油脂基料的性質研究[J]. 中國油脂, 2016, 41(9): 36-40.

[7] ZHAO M L, HU J N, ZHU X M, et al. Enzymatic synthesis of medium-and long-chain triacylglycerols-enriched structured lipid fromCinnamomumcamphoraseed oil and camellia oil by Lipozyme RM IM[J]. Int J Food Sci Technol, 2014, 49(2): 453-459.

[8] KHODADADI M, KERMASHA S. Optimization of lipase-catalyzed interesterification of flaxseed oil and tricaprylin using response surface methodology[J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91(3): 395-403.

[9] 李志曉, 金青哲, 葉小飛, 等. 制油工藝對油茶籽油品質的影響[J]. 中國油脂, 2015, 40(4):47-51.

[10] 彭亮, 宋志華, 騰傳震, 等. 甲醇鈉催化酯交換制備中/長鏈結構甘三酯[J]. 中國油脂, 2011, 36(3):5-9.

[11] NAGACHINTA S, AKOH C C. Production and characterization of DHA and GLA-enriched structured lipid from palm olein for infant formula use[J]. J Am Oil Chem Soc, 2013, 90(8): 1141-1149.

[12] 戚以政, 汪叔雄. 生化反應動力學與反應器[M]. 北京: 化學工業出版社, 1999:10-51.

Optimization of Lipozyme 435-catalyzed synthesis of medium-and long-chain triglycerides using response surface methodology

LU Jiyuan, WANG Xiaosan, JIN Qingzhe, WANG Xingguo

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu，China)

The synthesis conditions of medium- and long-chain triglycerides by Lipozyme 435-catalyzed interesterification of soybean oil and medium-chain triglycerides in a solvent-free system was optimized by response surface methodology. The triglycerides structure of the product was analyzed by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) coupled with quadrupole time of flight mass spectrometry under positive ion model. The results showed that reaction temperature and reaction time had extremely significant influence on medium-and long-chain triglycerides content. The optimal reaction conditions were obtained as follows： mass ratio of soybean oil to medium-chain triglycerides 60∶40, reaction time 4.36 h, reaction temperature 89℃, and enzyme dosage 5.5%(based on the mass of substrate). Under these conditions, medium- and long-chain triglycerides content was 84.15%. The main triglycerides in the products were CyCyL, CyCyLn, LOCy, LPCy, OOCy and LOCa.

medium-and long-chain triglycerides; Lipozyme 435; interesterification; response surface methodology; triglycerides structure

2016-09-04；

2017-01-17

江蘇省自然科學基金——青年基金項目(BK20150137);政策引導類計劃(產學研合作)——前瞻性聯合研究項目(BY2016022-33)

陸繼源(1989)，男，在讀碩士，研究方向為功能性油脂(E-mail)lujiyuan@live.cn。

王小三，副教授，博士(E-mail)wxstongxue@163.com。

TS225.6;TQ641

A

1003-7969(2017)05-0015-05