水產品中氯霉素和己烯雌酚快速檢測方法初探

易 鳴 朱志強 曾 智

科研園地

水產品中氯霉素和己烯雌酚快速檢測方法初探

易 鳴 朱志強 曾 智

在標準《NY 5070-2002 無公害食品水產品中漁藥殘留限量》中氯霉素和己烯雌酚因其對人體的危害已被列為不得檢出的藥物殘留項目。檢測氯霉素和己烯雌酚的方法主要有酶聯免疫法、氣相法、液質聯用法，其中酶聯免疫法耗時最短且操作最簡單，也是筆者檢測工作的主要項目之一。結合筆者的實際工作，本文詳述了酶聯免疫法測定水產品中氯霉素和己烯雌酚含量的原理、方法和注意事項。

一、材料和方法

1.氯霉素和己烯雌酚

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，能對多種細菌微生物產生作用，常用于對水生動物各種傳染病的治療，曾在水產養殖業中得到廣泛應用，同時也帶來了水產品中氯霉素殘留的嚴重問題。因其會引起人類的再生障礙性貧血、新生兒灰嬰綜合癥等嚴重毒副作用，作為漁藥已禁用。己烯雌酚為人工合成的非甾體雌激素，對水生動物有提高繁育率等作用。但人食用了殘留有己烯雌酚的水產品后會造成體內激素失調，對人體健康產生危害，作為漁藥也已禁用。因此對水產品中氯霉素和己烯雌酚的檢測對于食品安全有重要意義。

2.酶聯免疫法

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann，荷蘭學者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）。它的中心原理就是讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。

具體步驟是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，然后與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。但由于酶聯免疫法可能出現假陽性情況，故在本法檢出陽性后一般再用其它方法復驗。

3.酶聯免疫試劑盒

試劑盒中提供的檢測材料有：酶標板、標準品、酶結合物、抗體、底物溶液、終止液和洗滌液、提取液等試劑。

（1）氯霉素酶聯免疫試劑盒

筆者在實際工作中使用氯霉素酶聯免疫試劑盒檢測時采用間接競爭一步法。在酶標板中同時加入標準品（或樣本）、酶標二抗及氯霉素抗體，酶標板上包被的抗原與加入的標準品（或樣本）中的抗原競爭結合加入的氯霉素抗體，同時酶標二抗與氯霉素抗體結合。用TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物中氯霉素濃度呈負相關，與校準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣本中氯霉素的含量。

（2）己烯雌酚酶聯免疫試劑盒

筆者在實際工作中所用的己烯雌酚酶聯免疫試劑盒基于競爭性酶聯免疫反應原理。含有己烯雌酚的抗原已經包被于微孔板上。檢測時，樣品同特異性一抗共同被添加到板孔中，如果樣品中含有己烯雌酚，會競爭一抗，抑制抗體與板上包被的藥物抗原結合。加入酶標記的二抗，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。加入底物后，產物的顏色深淺與樣品中己烯雌酚的濃度成反比。

二、樣品前處理

由于上酶標板檢測必須采用液體樣本，所以必須對樣品進行前處理，提取出其中的氯霉素和己烯雌酚。因兩種藥殘的樣品前處理步驟大同小異，以下以氯霉素的前處理為主，合并敘述。以筆者在工作中采用的試劑盒為例，所有的提取液、洗滌液等均需預先配成1倍濃度。

（1）稱取3.0±0.05g（己烯雌酚稱取2.0g）組織樣本于50mL離心管中；

（2）加入6mL乙酸乙酯（己烯雌酚加6mL乙腈和2mL組織提取液）；

（3）渦漩3-5分鐘；

（4）4000轉離心10分鐘，取4mL有機相（己烯雌酚取3mL有機相至另一試管中加入150mg組織清洗劑，渦漩30秒，室溫靜置5分鐘，再次4000轉離心10分鐘后取2.4mL上清液），于60℃下氮氣吹干；

（5）殘留物加入1mL正己烷和1mL樣本稀釋液（己烯雌酚加入400μL1倍PBS-甲醇（3∶2，v/v），渦漩混勻1分鐘；

（6）取50μL下層液體（己烯雌酚為均相液體）進行檢測。

三、操作步驟與要點

此為定性定量的關鍵步驟，但由于兩種試劑盒的操作步驟不盡相同，以下分別敘述。

1.氯霉素試劑盒操作步驟

①加樣：每孔加入標準品或樣品50μL，加入酶結合物50μL和抗體50μL，輕輕震蕩混勻，25℃靜置溫育30分鐘。

②洗板：取出微孔板，甩干孔內液體，用洗滌液洗板4次，250μL/孔，浸泡30秒，在吸水紙上拍干。

③顯色：每孔加入底物溶液100μL，震蕩后25℃避光顯色15分鐘。

④依序每孔加終止液50μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

⑤在加終止液后5分鐘內用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光度（OD）值。

2.己烯雌酚試劑盒操作步驟

①每孔加入標準品或樣品50μL和一抗100μL輕輕震蕩混勻，25℃靜置反應30分鐘。

②洗板，同氯霉素試劑盒操作步驟（2）。

③每孔加入150μL二抗，25℃避光顯色30分鐘。

④洗板，同步驟（2）。

⑤加入100μLTMD底物并混勻，25℃避光靜置反應10-15分鐘。

⑥每孔加終止液100μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

⑦穩定2分鐘后，在450nm波長下測定OD值。

3.操作要點

由于同屬酶聯免疫試劑盒，其操作有共同之處?，F將操作要點一并敘述如下：

（1）為保證抗體活性，試劑盒應保存在2-8℃下，使用前將盒內試劑移至室溫25℃平衡至少30分鐘。整個酶標板操作過程都應保證溫度在25℃左右。按量取用微孔條，不用的放回鋁箔袋，2-8℃保存。

（2）加樣：加樣使用一次性槍頭，避免交叉污染。加樣時應輕緩，避免起泡，直接加于酶標板底部，勿沿孔壁加樣。一次加樣時間最好控制在10分鐘內，如樣品數量多，在可能時推薦使用排槍加樣。

（3）溫育：為防止樣品蒸發或污染，溫育過程中推薦覆上板貼。溫育過程中應保持溫度恒定，室溫達不到25℃時推薦使用空調，可在已恒溫的小盒子內溫育。

圖1 Mk3型酶標儀給出的數據

（4）洗板：洗板過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。ELISA分析中的重現性很大程度上取決于洗板的一致性。手工洗板法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標板內液體；在實驗臺上鋪幾層吸水紙，酶標板向上用力拍幾次；浸泡時間不可太短，以30秒為宜；重復次數以4次為宜。自動洗板法：如有自動洗板機，就在熟練使用后再用到正式實驗中去。

（5）顯色：為保證實驗結果的準確性，底物顯色反應時間到后應盡快加入終止液?？稍诩尤氲孜锶芤汉竺扛粢欢螘r間（如每隔10分鐘）觀察顯色情況以控制反應時間。當肉眼可見標準品前1-4孔有明顯梯度藍色，后5-6孔顯色不明顯時，即可加入終止液終止反應，此時藍色立刻變為黃色。終止液的加入順序應與底物溶液加入順序相同。

（6）底物溶液應為淺藍色或無色，如果顏色嚴重變深則應棄用。底物溶液易受污染，應避光保存。

（7）試劑盒的最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光值和靈敏度發生變化。

四、數據處理

以氯霉素的數據處理為例說明酶聯免疫法的數據處理。

筆者使用的是熱電Mk3型酶標儀。給出的數據如圖1：其中A1、B1、C1、D1、E1、F1格為標準曲線OD值，G1-H3為樣品OD值。

圖2 在計算軟件上輸入的測定值

圖3 由OD值計算出的標準曲線圖形

筆者在實際工作中使用RIDARSOFT Win (Art.No.Z9999軟件)計算，輸入界面如圖2，其中上半部分為指定標準品和樣品，下半部分為標準品和樣品的OD值。

計算出的標準曲線如圖3。

計算出的結果如圖4，樣品的稀釋倍數為0.5。

圖4 計算結果

五、結果分析

對標準曲線進行分析：OD值有明顯的梯度，圖形呈曲線，判斷標準曲線合格。軟件自動分析18號樣品OD值超出標準曲線范圍；對樣品值進行分析：1號樣品和18號樣品OD值接近或超過標準點最低濃度，判斷為樣品氯霉素含量極低，屬正?，F象。

六、結論

水產品中氯霉素和己烯雌酚的檢測對現時的食品安全有重要意義，酶聯免疫法作為一種快速檢測方法在實際應用中更有潛力。因相對其它檢測方法操作簡單、快速而節省了實驗室的時間、人力，提高了檢測效率。通常農業部一次例行監測約50個樣品用酶聯免疫法檢測氯霉素只需要1-2天即可給出結果，但如何避免假陽性，還需進一步研究。

（通聯：430077，湖北省水產科學研究所）