利用微衛星標記分析雁蕩土雞及其他3個雞群體遺傳多樣性

曾 濤，孫思維，田 勇，陳 黎，盧立志，干賢通，干方本，吳春琴，*

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021; 2.溫州科技職業學院 動物科學系，浙江 溫州 325006; 3.浙江綠雁農業開發有限公司，浙江 樂清325615)

利用微衛星標記分析雁蕩土雞及其他3個雞群體遺傳多樣性

曾 濤1，孫思維2，田 勇1，陳 黎1，盧立志1，干賢通3，干方本3，吳春琴2，*

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021; 2.溫州科技職業學院 動物科學系，浙江 溫州 325006; 3.浙江綠雁農業開發有限公司，浙江 樂清325615)

為探討浙江省不同地方雞群體的遺傳多樣性及遺傳距離，促進浙江境內雞群體遺傳資源的合理利用和保護，本試驗利用STR分型技術對雁蕩麻雞Ⅰ系、Ⅱ系、蕭山雞、龍游麻雞和仙居雞5個群體(440只個體)在28個位點上的遺傳多樣性進行了檢測。結果表明，所有位點在5個群體中的平均有效等位基因(Ne)、期望雜合度(He)和多態信息含量(PIC)分別為3.709 0、0.664 1和0.621 5，其中龍游麻雞的平均Ne、He和PIC最高(3.941 9、0.702 2和0.661 3)；仙居雞最低(3.505 1、0.653 9和0.609 3)；雁蕩麻雞2個品系平均值處于龍游麻雞和仙居雞之間(Ⅰ系分別為3.785 5、0.670 6和0.628 8，Ⅱ系分別為3.695 7、0.654 6和0.611 4)。遺傳距離和系統聚類結果顯示，5個雞群體聚為3類，雁蕩麻雞2個群體為一類，仙居雞為一類，蕭山雞與龍游麻雞為一類。雁蕩麻雞Ⅰ系和Ⅱ系是浙江境內不同于仙居雞、蕭山雞和龍游麻雞而單獨存在的一個品種。

雞；微衛星；遺傳多樣性；遺傳距離

微衛星DNA 核心序列重復次數的不同和重復程度的不同導致了每個基因座的多態性[1]，微衛星DNA 或標記因其有數量多、分布廣、多態性豐富、呈共顯性遺傳方式等優點，已經在動物遺傳育種中得到廣泛應用。目前，全球生物多樣性正在下降，研究和保護動物的遺傳多樣性已成為保護生物學關注的熱點。微衛星作為理想的遺傳標記，已應用于動物遺傳多樣性和建立遺傳譜系的研究中，推動了保護遺傳學的發展。國內外已有多位學者用微衛星標記研究了不同家禽品種的遺傳結構、親緣關系和遺傳多樣性[2-7]。

雁蕩土雞原產于樂清市雁蕩山區一帶，是在特定的地理、氣候等環境和傳統飼養管理方式下，經過長期擇優繁育而形成的蛋肉兼用品種。2004年以來，課題組對散養在雁蕩山區一帶的土雞進行收集和閉鎖繼代選育，根據土雞的羽色和生產性能重點培育了兩個品系，分別是Ⅰ系快長型，羽色為黑羽黑腳，生長速度較快；Ⅱ系優質型，羽色為黃麻羽黃腳，生長速度較慢。雁蕩土雞雞肉品質細嫩，雞蛋營養價值高，深受當地人們歡迎。本研究選取與雁蕩土雞相近的浙江省本地蛋肉兼用型雞品種蕭山雞、龍游麻雞和仙居雞，進行遺傳多樣性比較及遺傳距離的分析，以揭示雁蕩土雞的遺傳特征，為地方雞品種資源開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗采集浙江省主要的5個雞(Gallusgallus)群體的血樣。5個群體樣本信息詳見表1。所有群體公母比例為1∶1。

1.2 血液采集及DNA提取

采取翅靜脈采血，收集于醫用2 mL一次性真空采血管(含抗凝劑)帶回實驗室，-20 ℃保存備用。使用TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit提取總DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，用紫外分光光度計法估計含量，稀釋DNA樣品至 50 ng·μL-1，用于后續微衛星分型分析。

1.3 引物設計及PCR擴增

根據GenBank和相關文獻所提供的雞的SSR序列及引物進行篩選。選擇核心重復序列較多，且在多個品種中多態性豐富的位點。最終選取30對引物進行擴增，其中28對引物擴增成功，引物由上海英捷生物有限公司合成，詳見表2。

PCR反應體系為15 μL，具體為：10×Buffer 1.5 μL，DNA 1.0 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，酶0.3 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各0.15 μL，ddH2O補至15 μL。擴增反應程序如下：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃變性15 s，52～65 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，共35個循環；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

表1 各群體樣本信息

Table 1 Information of the population sample

品種Breeds樣本量Samplesize來源Source雁蕩麻雞Ⅰ系YandangchickenⅠ(YDⅠ)100浙江綠雁農業開發有限公司ZhejiangLvyanAgriculturalDevelopmentCo．，Ltd．雁蕩麻雞Ⅱ系YandangchickenⅡ(YDⅡ)100浙江綠雁農業開發有限公司ZhejiangLvyanAgriculturalDevelopmentCo．，Ltd．蕭山雞Xiaoshanchicken(XS)60杭州蕭山東海養殖有限責任公司HangzhouXiaoshanEastSeaAquacultureCo．，Ltd．龍游麻雞Longyouchicken(LY)60衢州某雞場AchickenfarminQuzhou仙居雞Xianjuchicken(XJ)120浙江禮仕得仙居雞開發有限公司ZhejiangLishideXianjuChickenDevelopmentCo．，Ltd．

表2 雞微衛星引物信息

Table 2 Microsatellite primers sequences of chicken

座位名稱(Loci)染色體Chromosome引物序列Primerssequences退火溫度Annealingtemperature/℃ADL1369TGTCAAGCCCATCGTATCACCACCTCCTTCTCCTGTTCA53ADL1665TGCCAGCCCGTAATCATAAAGCACCACGACCCAATCTA55ADL1852CATGGCAGCTGACTCCAGATAGCGTTACCTGTTCGTTTGC60ADL1951AGATGGAAGACAGGACAAATAGCACAGACAATGTTATGC52ADL21011ACAGGGAGGATAGTCACACATGCCAAAAAGATGAATGAGTA55ADL2122TTTCAAAAGTGCCCTCACACTTCCTCCCTAAACTATGCTG52ADL22513CCAAAAAGCTGTATCACCTTGCCTGTTGTAAACCACCTGA59ADL12311GCTGTGTCAAGATTAGAATCACAACAATGAAAAACACTACCTGA53ADL201ZGCTGAGGATTCAGATAAGACAATGGCTGACGTTTCACAGC52ADL1762TTGTGGATTCTGGTGGTAGCTTCTCCCGTAACACTCGTCA52LEI01663AAGCAAGTGCTGGCTGTGCTCTCCTGCCCTTAGCTACGCAC58LEI006614GATCAGATGCATCCAAAGTTCGAAGCAGGAAAATAGAAAAGGC56LEI00944CAGGATGGCTGTTATGCTTCCAGGCCAACCCATACAAGAAAC63MCW02954ATCACTACAGAACACCCTCTCTATGTATGCACGCAGATATCC62MCW00146AAAATATTGGCTCTAGGAAACCGGAAATGAAGGTAAGACTAGC63MCW6710GCACTACTGTGTGCTGCAGTTTGAGATGTAGTTGCCATTCCGAC65MCW00815GTTGCTGAGAGCCTGGTGCAGCCTGTATGTGGAATTACTTCTC63MCW1837ATCCCAGTGTCGAGTATCCGATGAGATTTACTGGAGCCTGCC64MCW294ZACTGAACAGAAACAGTCTTCCCTTCTCTAGATGTCCACTACC63MCW33017TGGACCTCATCAGTCTGACAGAATGTTCTCATAGAGTTCCTGC63MCW00854GTGCAGTTATATGAAGTCTCTCGGTATACAGGGCTTCTGAAACA57MCW2642AGACTGAGTCACACTCGTAAGCTTACTTTTCACGACAGAAGC56MCW1349GGAGACTTCATTGTGTAGCACACCAAAAGACTGGAGGTCAAC58MCW10413TAGCACAACTCAAGCTGTGAGAGACTTGCACAGCTGTGACC64MCW1451ACTTTATTCTCCAAATTTGGCTAAACACAATGGCAACGGAAAC61MCW1503TCCTGACTGAAATGGTACAGCCATGAAAACCTTTGCCCTCAG61MCW325AAGTTCCTTGTACAATTGTTATCATTACTAGTACAATCAAGATGG56MCW43GGATTACAGCACCTGAAGCCAAACCAGCCATGGGTGCAGATTGG64MCW1207CTATGTAAAGCTTGAATCTTCAATTCCTGGGTGCTAATTTACC57MCW1744TGGACTTAACACTGCTATTGCCTCTCTACCTTGGAGGGCTGA54

含熒光標記的PCR產物用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動測序儀檢測。上樣總體積為10 μL，其中包括已經混有ROX500標準內參的上樣液Hi-Di Formamide 9 μL，PCR產物1 μL。

1.4 數據統計分析

采用GeneMapper 4.0導出圖譜文件，根據圖譜中最大波峰位置判斷目標條帶的大小，單波峰為純合子，雙峰為雜合子，并生成Excel數據表格。利用microsatellite-toolkit軟件計算有效等位基因數目(Ne)、期望雜合度(He)、多態信息含量(PIC))。用Popgene32軟件進行F-統計量分析，群體Nei氏遺傳距離及相似性分析。

2 結果與分析

2.1 微衛星位點檢測分型

利用 28對引物分別對440個樣本進行PCR擴增，利用ABI-3730XLDNA Analyzer全自動測序儀對所檢位點進行毛細管電泳掃描、判讀基因型(圖1)。

2.2 群體的遺傳多樣性比較

所有位點在5個群體中的平均He、PIC和Ne分別為0.664 1、0.621 5和3.709 0，其中龍游麻雞的平均He、PIC和Ne最高(0.702 2、0.661 3和3.941 9)，仙居雞最低(0.653 9、0.609 3和3.505 1)，雁蕩麻雞2個品系處于龍游麻雞和仙居雞之間， 但與兩者又具有顯著差異(Ⅰ系分別為0.670 6、0.628 8和3.785 5；Ⅱ系分別為0.654 6、0.611 4和3.695 7)(表3)。

2.3 群體間的遺傳距離和系統聚類

利用Popgene32軟件對5個雞群體間的Nei氏相似性和遺傳距離進行了分析，同時根據遺傳距離，采用UPGMA法進行聚類，詳見表4和圖2。雁蕩麻雞Ⅰ系和Ⅱ系的相似性最高為0.904 9，其次是蕭山雞與龍游麻雞(0.820 6)；雁蕩麻雞與其他3個品種的相似性高低依次為仙居雞>龍游麻雞>蕭山雞；雁蕩麻雞與其他3個品種間的遺傳距離大于3個品種內部的遺傳距離，說明雁蕩麻雞是屬于單獨的一個品種；聚類分析顯示，雁蕩麻雞2個品系單獨聚成一類，與仙居雞遺傳距離小于與蕭山雞和龍游麻雞的遺傳距離，而蕭山雞和龍游麻雞聚成一類。遺傳距離和系統聚類結果均表明，雁蕩麻雞Ⅰ系和Ⅱ系是不同于仙居雞、蕭山雞和龍游麻雞而單獨存在的一個品種。

圖1 位點ADL225的某基因型Fig.1 One of genotyping of ADL225

表3 二十八個微衛星位點在各個群體中的期望雜合度(He)、多態信息含量(PIC)、有效等位基因數(Ne)

Table 3 Expected heterozygosities， polymorphism information content and the number of effective alleles of 28 microsatellite loci in each population

位點Loci群體Population雁蕩麻雞Ⅰ系(YDⅠ)雁蕩麻雞Ⅱ系(YDⅡ)蕭山雞(XS)龍游麻雞(LY)仙居雞(XJ)平均值MeanADL136He085040836307904089070850708437PIC083220811207568087310830408207Ne753015719346228768546208963533ADL166He079410811308493082490808608176PIC076920781608243079370780707899Ne538655887563293548785133656449ADL185He083980841808153058740381106931PIC081770821207823056040367506698Ne645196756852189239301611644864ADL195He077390721407561082080669407483PIC073620664507056078830606907003Ne387574371539898536072995341186ADL210He062700534907574079640799407030PIC054110490907073076380763906534Ne262471833739950471504840036016ADL212He063420601305595070660686806376PIC060830556005121067810628305966Ne243692828522441333623159728010ADL225He085610802006161087690859008020PIC083440770005658085520839107729Ne619005878925705765426912958413ADL123He052550472702467044700480804345PIC050310444202323041440441304070Ne217461838613238179551918418101ADL201He001990000861000212PIC001960000817000203Ne100001020210000109331000010227ADL176He070330768105549080630729507124PIC064690728704945077390686306661Ne441353757622223498373655938066LEI0166He058400596606453060210463105782PIC050400507205744053000382604996Ne249202442927756248081855824094LEI0066He088300955008990094100945009190PIC071760705407998081830767607617Ne396564505556023619114880650290MCW0295He067880543807556066700668906628PIC061690476007145061040612406060Ne294682367739874295222994830497

續表1

表4 五個雞群體間的Nei氏遺傳相似性系數和遺傳距離

Table 4 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

品種Breeds雁蕩麻雞Ⅰ系(YDⅠ)雁蕩麻雞Ⅱ系(YDⅡ)蕭山雞(XS)龍游麻雞(LY)仙居雞(XJ)雁蕩麻雞Ⅰ系(YDⅠ)????09049063230716007556雁蕩麻雞Ⅱ系(YDⅡ)01000????063190689207171蕭山雞(XS)0458404590????0820606506龍游麻雞(LY)033400372301977???? 08082仙居雞(XJ)02802033250429802130????

*Nei氏遺傳相似性系數(對角線以上)和遺傳距離(對角線以下)

Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).

圖2 五個雞群體基于Nei氏遺傳距離的UPGMA系統發育聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 5 breeds based on Nei’s genetic distance

3 討論

了解雁蕩麻雞的遺傳多樣性，有助于中國地方雞種的選育及開發利用。雁蕩麻雞體軀長方形，體型中等。羽色具有麻雞的特點，尾羽上翹。按照羽色和脛部皮膚顏色的不同，分Ⅰ系(黑麻羽青腳)、Ⅱ系(黃麻羽黃腳)兩個品系，具有豐富的多樣性。雁蕩麻雞是雁蕩山區獨特的家禽資源，體型偏小，抗病力強，肉蛋營養豐富，但目前，該品種尚未經過省遺傳資源鑒定，因此有必要了解該品種的遺傳特性及其與周邊地方雞種的遺傳距離，為今后雁蕩土雞更好地開發提供參考。

由于微衛星標記具有多態豐富、共顯性、操作簡單等特點，被用于雞種多樣性，以及群體內及群體間的遺傳結構和差異研究[8-11]。通過分析遺傳雜合度(He)和多態信息含量(PIC)，可以看到不同座位在不同群體中的遺傳變異程度不同。從本研究的結果可以看出，28個微衛星座位在5個不同雞群體，呈現出不同的多態現象。其中，S9的Ne、He和PIC較其他位點稍低，為低度多態位點，其他位點均處于中高度多態位點。5個群體中的平均He、PIC和Ne分別為0.664 1、0.621 5和3.709 0，其中龍游麻雞的平均He、PIC和Ne最高(0.702 2、0.661 3和3.941 9)，仙居雞的平均He、PIC和Ne最低(0.653 9、0.609 3和3.505 1)，雁蕩麻雞2個品系的平均He、PIC和Ne處于龍游麻雞和仙居雞之間，但與兩者又具有顯著差異(Ⅰ系He、PIC和Ne分別為0.670 6、0.628 8和3.785 5；Ⅱ系He、PIC和Ne分別為0.654 6、0.611 4和3.695 7)，結果表明,雁蕩麻雞是處于龍游麻雞和仙居雞之間的品種。

遺傳距離是指不同的種群或種間的基因差異的程度，并且以某種數值進行度量，通常由基因頻率的某個函數所確定。遺傳距離的信息已作為在決策保種計劃時群體結構和品種分化最基本的指標，準確理解遺傳距離的概念和在不同的情況下選擇合適的度量方式是很重要的。遺傳距離是研究物種遺傳多樣性的基礎，它反映了所研究群體的系統分化，一般認為，群體分化時間越短，遺傳距離越小。哪種遺傳距離測定方法對分析品種遺傳變異最好并無定論，不同的遺傳距離得出的系統發生樹不同[12-13]。本試驗得到的聚類圖中，5個雞群體聚為3類，雁蕩麻雞2個群體單獨為一類，仙居雞為一類，蕭山雞與龍游麻雞為一類。結果表明，雁蕩麻雞Ⅰ系和Ⅱ系是不同于仙居雞、蕭山雞和龍游麻雞而單獨存在的一個品種。

本研究通過應用28個多態性較好的微衛星標記對浙江省5個雞群體進行了遺傳多樣性分析，所得的聚類圖能夠準確地反映5個群體間的分化關系，各品種的遺傳多樣性非常豐富，都具有各自的特性，在合理開發利用的同時，要保存其各自優良的品種資源。同時，本研究也發現雁蕩麻雞是不同于仙居雞、蕭山雞和龍游麻雞而單獨存在的一個品種，應申請省遺傳資源鑒定為新的保護品種。

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(責任編輯 張 韻)

Genetic diversity of Yandang chicken and other three chicken populations using microsatellite markers

ZENG Tao1， SUN Siwei2， TIAN Yong1， CHEN Li1， LU Lizhi1， GAN Xiantong3， GAN Fangben3， WU Chunqin2，*

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.DepartmentofAnimalScience，WenzhouVocationalCollegeofScienceandTechnology，Wenzhou325006，China; 3.ZhejiangLvyanAgriculturalDepartmentCo.，Ltd.，Yueqing325615，China)

In order to study the chicken populations’ genetic diversity and relationship and promote the rational use and protection of the chicken populations genetic resources in Zhejiang Province， 28 microsatellite loci were tested in the 5 chicken populations， which were Yandang chicken I， Yandang chicken II， Xiaoshan chicken， Longyou chicken and Xianju chicken， totally 440 samples. The results showed that the average effective number of alleles (Ne) was 3.709 0， the average expected heterozygosity (He) was 0.664 1， and the mean polymorphic information content (PIC) was 0.621 5. In addition， the Ne， He and PIC of Longyou chicken were the highest (3.941 9， 0.702 2 and 0.661 3). The Ne， He and PIC of Xianju chicken were the lowest (3.505 1， 0.653 9 and 0.609 3). The Ne， He and PIC of Yandang chicken were between the two populations (Ⅰ: 3.785 5， 0.670 6 and 0.628 8; Ⅱ: 3.695 7， 0.654 6 and 0.611 4). Phylogenetic tree analysis based on Nei’s genetic distance revealed that Yandang chicken (Ⅰ and Ⅱ)， Xianju chicken， Xiaoshan chicken and Longyou chicken was clustered into threes group separately. It indicated that Yandang chicken was a separate breed which is different from Xiaoshan chicken， Longyou chicken and Xianju chicken.

chicken; microsatellite; genetic diversity; genetic distance

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.03

2017-01-12

浙江省農業科技成果轉化資金資助項目(2013-101)；溫州市種子種苗科技創新專項項目(N20120031)；浙江省科學技術廳重大科技專項重大農業項目(2014C02001)

曾濤(1987—)，男，安徽安慶人，博士，助理研究員，主要從事家禽遺傳育種研究。E-mail: zengtao4009@126.com

*通信作者，吳春琴，E-mail: nkywcq@163.com

S831.2

A

1004-1524(2017)07-1070-07

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1070-1076

曾濤，孫思維，田勇，等. 利用微衛星標記分析雁蕩土雞及其他3個雞群體遺傳多樣性[J].浙江農業學報，2017，29(7)： 1070-1076.