黑楊應答楊生褐盤二孢?；颓秩镜幕虿町惐磉_

王凱英,高 茜,孫曉明,張琰鋒,嚴東輝,2

(1.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所 北京 100091; 2.南京林業大學南方現代林業協同創新中心 江蘇 南京 210037; 3. 北京林業大學林學院 北京 100083)

黑楊應答楊生褐盤二孢?；颓秩镜幕虿町惐磉_

王凱英1,高 茜1,孫曉明1,張琰鋒3,嚴東輝1,2

(1.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所 北京 100091; 2.南京林業大學南方現代林業協同創新中心 江蘇 南京 210037; 3. 北京林業大學林學院 北京 100083)

[目的]楊生褐盤二孢的單芽管?；秃投嘌抗軐；头謩e引起白楊組和黑楊組(包括青楊組)楊樹的褐斑病，其分化機制有待闡明。[方法]本文在?；曰プ黧w系建立的基礎上，利用熒光染色標記研究了病菌孢子在?；约闹髑秩具^程中的萌發發育情況，并通過RT-qPCR分析了黑楊寄主抗病相關基因在應答兩?；颓秩具^程中的不同表達。[結果]結果發現多芽管分生孢子在黑楊寄主上能完成發育并成功侵染，單芽管分生孢子也能成功萌發和發育，但不能侵入黑楊寄主；黑楊抗性基因在兩?；颓秩景l育過程中均能被誘導表達，但在表達時間和表達量上，除基因WRKY89的表達較為一致外，病程相關基因PR5、PR10、NPR1和LAR3在二者間的表達存在差異。[結論]研究結果初步表明病原?；涂赡苁羌闹髋c病原專性互作的表型，這一認識將有助于進一步探明楊樹褐斑病病原?；托纬珊头只臋C制。

楊生褐盤二孢，?；?，RT-qPCR，基因表達

病原菌種內?；偷姆只瘷C制是植物病理學研究的基本問題，揭示其中的機制對于認識病害發生規律和提出防治策略均具有重要意義[1]。楊生褐盤二孢(Marssoninabrunnea(Ell. et Ev.) P. Magn.)是引起楊樹早期落葉和樹勢衰弱的重要病原菌[2-3]，針對不同楊樹寄主，該菌分化為多芽管和單芽管兩個?；?，并在自然界分別只侵染親和性黑楊(Aigeiros)(包括青楊Tacamahaca)派系寄主和白楊派系(Leuce)寄主[2,4]。有研究表明，籍于ITS分子系統發育以及其它遺傳分子標記，在一定程度上可區分兩個?；蚚5-6]， 尤其ITS2遺傳特征能區分聚類不清的?；蚚6]，這說明兩個?；偷姆只哂幸欢ǖ姆肿舆z傳基礎。但這種分化基礎在病原與寄主互作水平上的表現并未給予揭示，?；褪遣≡秩爰闹鬟^程中與寄主互作的表型體現，是病原與寄主互作生態進化的結果，其中寄主的病程相關蛋白可能參與或奠定了?；缘陌l生基礎[1]。為此，作者在明確黑楊寄主對兩個?；颓秩揪哂许憫幕A上，通過分析已有相關病原?；颓秩九c楊樹互作過程的研究報道，選取了具有抗病標記作用的楊樹寄主基因，如水楊酸(SA)誘導表達防衛基因PR5(類奇異果糖蛋白)、抗性基因PR10、SAR(systemic acquired resistance)信號途徑中起關鍵調控因子的非病程相關基因表達基因NPR1(Nonexpressor of Pathogenesis-related Genes1)、抗病調控轉錄因子WRKY以及和對褐斑病病菌菌絲有抑制作用的無色花色素還原酶基因(PtrLAR)等進行分析研究，結果初步證明了楊生褐盤二孢和寄主的互作是形成楊樹?；偷幕A之一。

1 材料與方法

1.1 楊生褐盤二孢和供試黑楊材料

供試黑楊為一年生扦插苗盆栽苗。扦插于第二年3月份，7—8月份成熟葉片用于接種試驗。

1.2 ?；途昵秩竞跅钤囼灱斑^程觀察

孢子懸浮液制備：兩?；途闞HHB和RHBH分別在PDA培養基上培養30 d，無菌水洗脫孢子，分別制備成濃度為106個·mL-1的孢子懸浮液用于接種。

侵染試驗及病情分級：7—8月份，選取健康長勢相近的一年生的黑楊扦插植株進行處理試驗。每株選取7～8片健康成熟葉片用于涂抹接種，塑料袋保濕48 h。對照設置為接種無菌水。選取接種后2、8、24、96 h觀察記錄侵染過程和發病情況，該時間點對應孢子萌發的不同發育階段和侵染階段。發病程度依據病情指數統計，病情指數分級標準見表1。

表1 離體葉片接種病情分級標準

侵染過程觀察：黑楊接種葉組織經徒手切片[7]后，放在載玻片上，滴加0.001%的熒光增白劑(18909-100ML-F,Sigma)，黑暗條件下染色5 min后，在倒置熒光顯微鏡(徠卡DMI6000B)觀察褐盤二孢孢子在黑楊葉片的發育侵染過程。

1.3 熒光定量PCR分析黑楊響應不同?；途昵秩镜南嚓P基因表達

取接種后第2、24、96 h處理組黑楊和對照葉組織，用錫箔紙包裹立即放到液氮中1 min，然后取出放入-80℃冰箱中保藏至RNA提取。

RNA提取及反轉錄：實驗采用CTAB法提取RNA[8]。用1%瓊脂糖凝膠及Nanodrop ND-1000儀對RNA完整性和質量進行檢測。反轉錄前，用RQ1 RNase-Free Dnase (Promega)去除RNA樣本中的DNA，并將RNA的濃度稀釋為100 ng·μl-1，取10 μlRNA作為反轉錄起始模板，反轉錄試劑盒采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo)，按說明書進行。

本次研究中，采取靜脈溶栓治療能夠顯著提高早期急性心梗死患者的血管再通率，并減少其不良反應的發生，從而顯著降低患者的死亡率。同時從本次研究還可以看到，38例在發病后6 h之內進行靜脈溶栓的患者，其血管再通率要顯著高于22例發病6～12 h進行治療的患者，這一結果表明，對于早期急性心肌梗死患者來說，靜脈溶栓治療的時間越早，其血管再通成功率也越高，因此，對于這類患者需及早進行治療。

1.4 Real-time PCR

以病程相關蛋白PR5、PR1、NPR1，WRKY基因家族的基因PtrWRKY89以及無色花色素還原酶基因PtrLAR3為定量表達基因，內參基因為ACTIN。內參基因與目的基因擴增效率M值<0.1。上述基因擴增引物(表2)見相關文獻[9-12]，且其?；越涍^實驗驗證。

基因表達定量采用SYBR Green (Life Technologies)相對定量2-ΔΔCt法。其中ΔΔCt的計算方法如下：

ΔCt=Ct(目的基因)— Ct(參考基因)

△△Ct =△Ct(試驗樣品)—△Ct(基準樣品)

△Ct(試驗樣品) = Ct(試驗樣品，目的基因)—Ct(試驗樣品，內參基因)

△Ct(基準樣品) = Ct(基準樣品，目的基因)—Ct(基準樣品，內參基因)

定量PCR的反應體系為20 μL，每個處理3個重復。反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s(開啟熒光)，40個循環。定量PCR儀為Rorot Gene 6000。

表2 Real-time PCR中目的基因的引物

2 結果與分析

2.1 兩?；途昵秩竞跅?/p>

經接種試驗調查，兩?；驮诠┰嚭跅钌袭a生的發病率情況分別是：多芽管?；途闞HHB從29.2～50%；單芽管?；途闞HBH從0～8.3%，分別表現為感病和抗病(表3)。這與自然界?；颓秩鞠鄳闹靼l病的現象是一致的。

楊生褐盤二孢黑楊?；蚏HHB和白楊?；蚏HBH在黑楊葉片上的發育過程(圖1、2)基本一致，即在接種2 h時，分生孢子開始萌發，在2～12 h逐漸長出芽管；12 h時始見附著孢；在24 h時產生大量附著孢；48～96 h時產生先菌絲。

表3 楊生褐盤二孢接種黑楊葉片感病病情分析結果

RHHB在黑楊葉片表面開始大量形成先菌絲，先菌絲先端接觸到葉片后膨大形成附著孢，由此開始侵染葉片。菌絲在擴展過程中逐漸形成分生孢子盤，接種葉片在10 d可以看到產生病斑，病斑顏色由褐色逐漸加深至黑色；而RHBH產生少量先菌絲后就不再對葉片侵染，接種10 d后也未發現葉片表面有病斑出現。

表4 相對定量的相關參數

2.2 黑楊抗性基因對兩?；颓秩镜捻憫磉_

選擇內參基因Actin和五個目的基因的標準曲線的相關系數R2>0.97，擴增效率E值為1.05和1.06，兩者的M值相差小于0.1 (表4)。擴增后的產物可通過溶解曲線的峰型圖直觀判斷，內參Actin和五個目的基因的Real-time PCR產物經過電泳均為單一條帶(圖3)，表明擴增產物特異性較高。這些結果均符合實時熒光定量PCR標準曲線相關標準，滿足后續試驗要求，可以進行熒光定量PCR試驗[13-14]。

黑楊5個抗性基因在葉片分別接種孢子2 h、24 h、96 h后的表達情況如下(圖4)。

圖1 黑楊?；途昵秩竞跅钊~片過程Fig.1 The Aigeiros Biotypes strains infection leaf of P. niger

圖2 白楊?；途昵秩竞跅钊~片過程Fig.2 The Leuce Biotypes strain infection leaf of P. niger

圖3 Real-time PCR產物凝膠電泳
Fig. 3 Agarose electrophoresis of Real-time PCR products

在黑楊應答楊盤二孢侵染的過程中，隨著孢子在葉片上的萌發生長和侵染，抗病基因對不同?；偷谋磉_也呈現不同的變化。多芽管?；?黑楊?；?病菌侵入時，黑楊在接種2 h時孢子萌發時，均上調表達了5個抗性基因，其中PR10上調最為顯著；至接種后24 h時病菌附著孢形成，寄主中這5個基因均呈現顯著下調表達，顯示出寄主對這一時期病菌侵染過程抗性的減弱；而接種96 h時，病菌先菌絲形成并侵入后，僅有PtrWRKY89和PtrLAR3顯著上調表達，其余3個基因的表達與孢子萌發期的表達水平幾乎持平。

而黑楊對單芽管?；?白楊?；?病菌相同發育階段和侵染過程的應答，則是接種2 h時，PR10和PtrWRKY89顯著上調表達，而其余3個基因的表達微式上調；接種24 h時病菌形成附著孢，PR5、NPR1和PtrLAR3持續明顯上調，至接種96 h時，這3個參與病菌先菌絲形成和侵入階段的抗性基因表達達到檢測時間內的最高表達量；而PR10在接種24 h和96 h時持續下調，PtrWRKY89則在接種24 h時有所下調后，接種96 h時又有上調至病原菌侵染之處2 h的表達水平。因此，黑楊中5個抗性基因對兩?；偷谋磉_譜沒有一個是相似的?？梢?，兩?；驮谇秩緯r，與寄主的互作在分子水平上存在顯著差異。

3 討論

注：黑色條框表示黑楊?；途杲臃N黑楊葉片的樣本表達情況，白色條框表示白楊?；途杲臃N黑楊葉片的樣本表達情況。
Note:The black box show expression of Aigeiros Biotypes strain inoculate leaves, the white box show expression of Leuce Biotypes Strain inoculate leaves.
圖4 目的基因在不同時期Real-time PCR相對定量表達
Fig.4 The samples relative expression of target genes in different stages by real-time PCR

侵染楊樹的楊生褐盤二孢兩個?；途哂幸欢ǖ倪z傳基礎[4-6]。11條隨機擴增DNA多態性引物(RAPDs 引物)能擴增到76條帶，能將國內42株楊盤二孢聚類成主要的兩組，并與寄主來源對應；僅有一株不在兩組內，而被認為是過渡型[5]，而這過渡型在ITS2結構的分型中得以歸化為兩組之一[6]。因此，楊盤二孢?；褪遣≡m應和遺傳進化的結果。但我們不了解這遺傳形成的進化壓力，最新研究認為病原與寄主分子互作是壓力構成的主要因素或主導因素[15]。自然界楊樹褐斑病只發生在?；秃直P二孢與其親和的楊樹組寄主中，不發生交叉侵染。供試的白楊?；秃直P二孢(單芽管?；?孢子能在供試黑楊上發育，但不能侵染。雖然在供試黑楊上也出現有8.3%的壞死病斑，但這些均屬于過敏性壞死(張琰鋒, 資料待發表)。因此，楊樹寄主對褐盤二孢的選擇性或二者之間的互作是形成?；偷姆只目赡芤蛩?。

在楊樹抗病抗逆的研究中，發現了一些抗性關聯的常規表達基因[9-11,16-17]。本文利用的5個基因中，PR5(類奇異果糖蛋白)是病程相關基因，由水楊酸(SA)誘導表達的防衛基因；PR10蛋白是具有多種小亞類的胞內蛋白，表現抗菌、體外酶活性、參與植物次生代謝、抵御非生物脅迫等復雜的生物學功能；NPR1是系統獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAS)信號途徑關鍵調控因子之一，誘導PR相關基因表達；PtrWRKY89為WRKY基因家族，參與發育和生理過程調節，高通量轉錄組分析發現該族蛋白在楊樹黑斑病、水楊酸途徑、創傷等過程都表現抗性調控，并且加速PR相關基因表達；最后，PtrLAR3為無色花色素還原酶基因(PtrLAR)，分離自毛果楊葉片，能抑制黑斑病菌菌絲的生長。這些基因在植物與病原物互作過程中發揮著一定作用，在病原菌侵染的不同時期，其表達也存在差異性。

從這5個抗病相關基因在侵染過程中的表達變化可見(圖4)，黑楊寄主對病原菌的調控表達，在病原菌接觸起始就有了響應?，F已知病原菌孢子在葉組織表面萌發至附著孢形成，寄主的主要應答方式是對病原菌相關分子程式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)因子識別引起的抗性，這種抗性非常容易被長期進化和適應了的病原菌所克服[13]。自然界楊生褐盤二孢的兩個?；蜕?，與黑楊有著長期互作適應進化的是多芽管?；?。在我們的研究結果中，也呈現出二者的這種適應關系。如在2 h～24 h間，黑楊對多芽管?；?RHHB)的接觸和識別，在5個抗性基因中，寄主除PR10在孢子萌發階段有強烈上調相應和迅速下調外，其余4個抗性基因并沒有顯示積極的顯著上調表達，說明病原菌進化出適應寄主抗性的能力，并進而分泌效應物克服黑楊對PAMPs的抗性，致使黑楊發生病害[18]。而面對單芽管?；偷牟【秩?，在2 h病原菌萌發開始，黑楊寄主這5個基因就具有強烈應答表現，而且其中三個基因的表達強度隨單芽管病原菌發育侵染過程不斷增加，顯示出該?；团c黑楊寄主的不親和性。這可能是單芽管?；驮谂c黑楊寄主長期進化過程中，未發展出適應性互作關系的結果，致使黑楊寄主對此?；捅憩F出高度抗性或免疫。這種抗性從組織病理學的角度也可以發現(圖1)，相對于多芽管?；玩咦影l育形成附著孢之后，表現的繼續旺盛生長而言，單芽管?；玩咦觿t在黑楊上萌發形成附著孢后，菌絲的發育即陷入停滯(圖2)。這些觀察到的性狀比較，在之前的研究中并未給予揭示或提示。當然，更為明確的區別特征有待于進一步通過更細致的分子組織病理學的方法給予闡述。

4 結論

楊生褐盤二孢?；偷姆只碎L期進化適應導致的遺傳變異外，還可能與寄主互作過程相關。本文通過兩個?；途陮跅钋秩具^程的組織病理學、及其關聯的抗性基因表達變化的研究，發現了黑楊對兩個?；陀兄煌膽饒D譜，進而認為病原菌?；偷姆只c寄主的互作是密切相關的，楊生褐盤二孢與楊樹寄主的互作對其?；头只哂羞x擇壓力的作用。其機制有待于后續互作轉錄組學來做進一步的闡明。

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(責任編輯：崔 貝)

Gene Differential Expression onPopulusdeltoidsResponding to Infection byMarssoninabrunneaFormae

WANGKai-ying1,GAOQian1,SUNXiao-ming1,ZHANGYan-feng3,YANDong-hui1,2

(1. Research Institute of Forest Ecology，Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing 210037, Jiangsu, China; 3. Forestry College, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

[Objective]To study the mechanism ofMarssoninabrunneasp.monogermtubiformae speciales (RHBH) infectingPopulusSection Leuce andM.brunneasp.multigermtubiformae speciales (RHHB) infectingPopulusSection Aigeiros. [Method] Based on pathogen-host interaction system, the pathogen’s spore germination, growth and infection process on poplar leaves were investigated by using fluorescence microscopy strain method and the expression of five pathogen-relative genes in hosts was also analyzed by RT-qPCR technique. [Result] The results showed that the spores of RHHB were able to grow and successfully infect the hosts ofPopulusSection Aigeiros, the spores of RHBH were also able to grow but failed to infect the hosts ofPopulusSection Aigeiros. The pathogen-resistant genes of Populus Section Aigeiros could be induced and express during the infection process of the two formae speciales. The gene express ofWRIKY89 followed a similar expression trend, while the other four genes (PR5, PR10, NPR1 and LAR3) followed different expression patterns in time and quantity for the two formae speciales. [Conclusion] The study provides some references for study the mechanisms of the two formae speciales and their differentiation.

Marssoninabrunnea; formae speciales; Real-time PCR, gene express

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.007

2016-08-29

效應物在楊盤二孢半活養方式及親和寄主致病性中的作用(31370645)、水解纖維素產烴樹木內生菌資源利用技術引進(2013-4-10)、芯片通量病原檢測技術在楊樹病害防控中的應用([2016]10號)

王凱英(1990—)，女，河北邯鄲人，在讀碩士研究生，森林植物微生物組學，E-mail：wkylibra@163.com

* 通訊作者：博士，研究員，主要從事森林病理與樹木微生物群學(microbiomes)，E-mail：yandh@caf.ac.cn

S796

A

1001-1498(2017)04-0582-06