蘿卜細胞質雄性不育的分子鑒定及orf138/orfB基因序列差異性分析

李曉梅，柴 靚，楊 峰，冉茂林,3 *

(1.四川省農業科學院水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.四川省農業科學院作物研究所，四川 成都 610066；3.蔬菜種質與品種創新四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

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蘿卜細胞質雄性不育的分子鑒定及orf138/orfB基因序列差異性分析

李曉梅1，柴 靚2，楊 峰1，冉茂林1,3 *

(1.四川省農業科學院水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.四川省農業科學院作物研究所，四川 成都 610066；3.蔬菜種質與品種創新四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

【目的】本研究旨在了解蘿卜雄性不育細胞質的分子特征?！痉椒ā恳?份蘿卜細胞質雄性不育系及其保持系、5份不育材料及6個蘿卜品種為試材，利用線粒體基因orf138及orfB為分子標記，設計特異引物對材料進行擴增，并對擴增產物進行測序分析?！窘Y果】8份蘿卜細胞質雄性不育系、5份不育材料及5個蘿卜品種檢測到含有orf138特異片段，為Ogura胞質類型，不育系相應保持系則未檢測到特異片段；對擴增產物測序發現所有Ogura胞質材料可分為2種類型，Type A和Type H；27份材料orfB特異擴增后，其產物按編碼區核苷酸序列的差異可分為2個類型，Ogura胞質中序列一致，普通胞質中序列一致?！窘Y論】由此可見，orf138與orfB基因在Ogura胞質與普遍胞質間均差異明顯，可利用orf138的有無及orfB基因的核苷酸序列差異進行胞質類型鑒定。

蘿卜(RaphanussativusL.)；雄性不育細胞質；分子鑒定；orf138；orfB

【研究意義】蘿卜(RaphanussativusL.)是一種古老的蔬菜作物，我國現今年平均種植面積約120萬hm2，為我國第三大蔬菜作物。蘿卜為典型的異花授粉植物，自交衰退嚴重，其雜種優勢明顯。利用細胞質雄性不育系做母本進行雜交制種是當前蘿卜雜種優勢利用的有效途徑，具有雜種一代純度高、制種成本低、親本不易流失等優點[1]。細胞質雄性不育性(CMS)是由胞質基和核基因共同作用的一種母性遺傳，已被證實與線粒體基因有關，線粒體基因組分子內或分子間的重組或重排，可以形成嵌合基因或新的開放閱讀框(ORF)而導致CMS[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】自1968年日本學者小倉發現第一個蘿卜細胞質雄性不育類型(Ogura CMS)以來，現今已有77-01A、Kos、NWB及DCGMS等不同胞質類型被發現[4-8]，但Ogura CMS因敗育徹底，育性易于恢復，到目前為止為研究最充分、應用最廣泛的不育胞質，現已通過雜交和體細胞融合等技術轉育到其他十字花科作物中[9-11]。研究證明，線粒體基因orf138是導致Ogura CMS的主控因子，引起敗育的原因可能是其表達產物對線粒體活性有毒性從而抑制花藥絨氈層的形成[12-14]。orfB為atp8同系物，負責編碼ATPase，與線粒體能量代謝有關，存在于Ogura胞質和普通胞質中，其與細胞質雄性不育的關系爭議較大。Ogura CMS正是orf138插入orfB的5′端形成，因此orf138-orfB為Ogura CMS線粒體基因組中的重要結構[15-17]。諸多研究者利用orf138和orfB為分子標記進行蘿卜胞質鑒定與分類，依orf138核苷酸堿基位點的差異，Ogura CMS被分為9個類型(Type A→I)，依編碼區及側翼堿基的差異，orfB被分為3個類型(Type 1→3)，其中Type1為Ogura CMS特有，這些發現證明了Ogura CMS具有豐富的多態性，有助于進行胞質類型鑒定及不同材料進化關系的研究[18-21]。鑒定蘿卜胞質不育類型并對其進行分類，是有效進行細胞質雄性不育系選育的前提和基礎，不僅可以提高種質材料的利用效率，還可以加快雜種一代選育進程，同時還將有助于研究細胞質基因與核基因互作機理[22-23]?！颈狙芯壳腥朦c】本試驗利用orf138和orfB為分子標記對8份蘿卜細胞質雄性不育系，8份蘿卜細胞質雄性不育保持系，5份不育材料及6個蘿卜品種進行胞質鑒定，同時對PCR產物進行測序以分析其差異性?！緮M解決的關鍵問題】旨在為加快蘿卜CMS的轉育奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料：本試驗所用材料共27份，包括8份蘿卜雄性不育系及其保持系、5份不育材料和6個蘿卜品種，每個材料取3個單株，重復2次。不育系“沈A”由沈陽市農業科學院提供，“藏蘿卜A”為甘孜州理塘縣藏蘿卜中發現的不育株，6個商業品種購于市場，其他材料均為四川省農業科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組的育種材料，各材料的性狀及來源見表1。

試劑盒、酶：通用型植物DNA提取試劑盒，PCR擴增所用的TaqPlus、TaqPlus Buffer和Super pure dNTPs均購自天根生化科技(北京)公司(TIANGEN)。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物總DNA的提取 剪取蘿卜幼嫩葉片約2 g，按照TIANGEN公司通用型植物DNA提取試劑盒產品說明提取總DNA，將提取的DNA用TE稀釋至200 ng·μl-1，保存于-20 ℃，以備后續使用。

1.2.2 PCR擴增及測序 以蘿卜線粒體全基因組(Ogura-type GenBank:AB694744及Normal-type GenBank:AB694743)中包含orf138及orfB(atp8)特異片段的序列為模板[17]，使用Primer Premier 5.0設計3對特異性引物(表2)，引物由上海生工合成。PCR反應體系為25 μl，含40 ng DNA，2.5 μl 10×TaqPlus Buffer(含Mg2+)，2 μl 2.5 mM Super pure dNTPs，0.5 μl 10 μM正向引物，0.5 μl 10 μM反向引物，0. 5 μl 2.5 U/μlTaqPlus，用ddH2O補齊25 μl。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環；最后72 ℃延伸10 min。 PCR產物于1.2 %瓊脂糖凝膠上電泳檢測，并切膠、回收、送交上海生工測序。序列分析在 NCBI上進行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，利用NCBI網站中的BLAST序列比較工具軟件進行序列同源性分析(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST)，利用DNAMAN(Version 7.0)軟件進行堿基及氨基酸序列多重比較分析。

表1 試驗材料

表2 特異片段擴增所用的引物序列

2 結果與分析

2.1orf138的擴增和序列比對

利用特異引物orf138-F/R對8份蘿卜雄性不育系及其保持系、5份不育材料和6個蘿卜品種進行PCR特異性擴增，并對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，8份不育系、5份不育材料及5個蘿卜品種有特異性條帶，表明這些材料均為Ogura胞質， 5個品種表現可育，推斷其為Ogura CMS與恢復系配制的雜交一代，8份保持系無特異條帶，說明orf138正是引起這些不育系敗育的原因，韓國品種“世農501”有微量花粉，但自交測交均不結實，說明花粉無活性，符合NWB胞質雄性不育特征，且未檢測到特異性片段，其可能為NWB胞質類型配制的雜種一代。

將PCR產物回收測序，對比這18個材料的orf138編碼區序列(417 bp)發現，所有材料可分為2種類型，前一類和后一類核酸序列相比，有2個堿基差異，分別是61A→C，99A→G(圖2)。將這些序列在NCBI上做Blast分析發現：第一類序列與Genbank已公布的蘿卜雄性不育細胞質相關基因(GenBank: DQ010330.1)核酸序列完全一致，經對比為Type A 型 Ogura CMS；而第二類序列與Genbank已公布的蘿卜雄性不育細胞質相關基因(GenBank: AB055442.1)核酸序列完全一致，經對比為Type H型Ogura CMS(Yamagishi&Terachi，2001)，進一步驗證了Ogura CMS具有豐富的變異類型。在DNAMAN軟件上進行氨基酸多重序列對比，發現orf138序列上61位點堿基的差異改變了編碼區的氨基酸序列(賴氨酸→谷氨酰胺)，為有義突變，但顯然氨基酸的變化并沒有改變雄性不育的表型性狀，推測其屬于中性變異。

M：D2000，1～27：不同蘿卜材料序號M:D2000，1-27:Number of materials圖1 基于orf138基因的PCR特異性擴增產物 Fig.1 PCR products amplified from the orf138 locus of radish

圖2 Ogura 胞質材料之間orf138序列差異性比較Fig.2 Nucleotide sequences analysis of orf138 locus of Ogura CMS

2.2orfB的擴增和序列比對

以N-atp8-F/R及O-atp8-F/R為特異引物，PCR擴增表明atp8存在于Ogura胞質與普通胞質中(圖3)，對PCR產物回收測序，并對其編碼區(476 bp)進行序列分析，結果表明：所有Ogura 胞質的orfB編碼區堿基序列相同，普通胞質的orfB編碼區堿基序列相同，且兩類序列間存在兩個堿基位點的差異，即370C→ A，449C→T(圖4)，這與Terachi等的研究結果一致，進一步證實了Ogura胞質具有特異性的orfB序列。氨基酸多重序列對比發現，兩序列在堿基位點突變處均引起了編碼氨基酸的改變(370異亮氨酸→亮氨酸，449纈氨酸→丙氨酸)，這些氨基酸的變化是否引起基因功能的改變尚不知曉，有待進一步研究。

3 結論與討論

Ogura CMS是1968年小倉在日本野生蘿卜群體內發現的首個蘿卜胞質雄性不育材料，其不育源敗育徹底，是十字花科作物迄今發現的不育性最徹底的胞質不育源之一，應用價值巨大，隨后諸多學者對Ogura CMS進行了廣泛研究。1991年，一個2.5 kb的片段Nco2.5被證實與Ogura CMS有關，隨后進一步發現該片段包含orf138和orfB2個開放閱讀框，在Ogura CMS中2個基因共轉錄一個1.4 kb的雙順反子mRNA，其中orf138只在Ogura CMS中轉錄表達，而orfB在不育與可育植株中均轉錄表達[12-13]。隨后研究者進一步證實Ogura CMS正是orfB位點的5′插入特異orf138導致不育，orf138-orfB可能共同決定了Ogura 胞質的不育性[15]，因此日本學者用107份日本野生蘿卜，29份來自中國和日本的品種及7份野芥為材料，研究了蘿卜在種間和種內水平上orf138編碼區堿基的差異性，第一次在核苷酸水平證實了線粒體基因orf138的多態性。研究表明143份材料的orf138編碼區序列共存在6個堿基位點的變異和一個39個核苷酸的缺失，依此將Ogura CMS分為9個類型(Type A→I)，中國蘿卜Ogura 胞質的主要類型為Type H，并且這些變異均屬有義突變，引起了氨基酸序列的變化，但顯然并沒有引起蛋白質功能的改變[18]，隨后中國學者也鑒定到2個Ogura CMS的變異類型[22]。本研究用27個不同性狀蘿卜為試材，以orf138為特異分子標記進行鑒定，結果顯示除了品種“雪單1號”(湖北省農業科學院經濟作物研究所選育)，所有中國來源的材料均為Type A Ogura 胞質，韓國和日本品種均為Type H Ogura 胞質，然而Zhang等則只在中國蘿卜中鑒定到Type A[21]。

M：D2000，1～27：不同蘿卜材料序號 M:D2000，1-27:The number of materials圖3 基于orf B基因的PCR特異性擴增產物Fig.3 PCR products amplified from the orfB locus of radish

圖4 Ogura胞質與Normal胞質orfB序列差異性比較Fig.4 Nucleotide sequences analysis of orfB between Ogura-type and Normal-type

orf138-orfB成為Ogura 線粒體基因組的重要結構，對其進行鑒定與分類具有重要的意義。

Terachi 等首次對46份蘿卜材料的orfB編碼區及側翼序列進行測序分析，依序列堿基及酶切位點的差異將其分為3個類型(Type 1、Type 2、Type 3)，其中Type 1只存在于Ogura胞質中，Type2、Type3存在于普通胞質中且其在編碼區的序列相同，與Type 1有2個堿基位點的差異，突變引起了編碼氨基酸序列的改變，Yamagishi(2004)、Zhang等(2012)的研究結果與之一致[19-21]。本文對27份材料的orfB的編碼區序列進行測序發現，Type A與Type H Ogura胞質的orfB編碼區堿基序列與Type 1一致，而所有普通胞質的orfB編碼區堿基序列一致，與Terachi等的研究結果相同，進一步證實了Ogura胞質具有特異性的orfB序列，但其是否可作為分子標記用于鑒定Ogura胞質仍需進一步的研究。

蘿卜不育胞質的鑒定和分類是利用不同遺傳背景雄性不育系的前提和基礎，對雄性不育系、保持系的選育具有非常重要的意義。本文鑒定到13份蘿卜不育材料及5個蘿卜品種均為Ogura胞質，可再結合Ogura胞質核恢復基因Rfo/rfo的酶切擴增多態性序列(CAPS)分子標記快速篩選不育源的候選保持系，從而加快育種進程[23]。同時也說明了課題組選育材料胞質類型的單一性，應加大不同胞質類型材料的引進，避免長期使用單一不育胞質帶來的潛在危害。

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(責任編輯 陳 虹)

Molecular Identification of Cytoplasmic Male Sterility in Radish (RaphanussativusL.) and Sequence Analysis oforf138 andorfB

LI Xiao-mei1, CHAI Liang2, YANG Feng1, RAN Mao-lin1,3*

(1.Institute of Rice and Sorghum, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Deyang 618000,China; 2.Institute of Crop Research, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066,China; 3.Sichuan Province Key Laboratory of Vegetable Germplasm and Varieties Innovation, Sichuan Chengdu 610066, China )

【Objective】The present study was conducted to understand the molecular characteristics of male-sterile cytoplasm in radish. 【Method】Theorf138 andorfBof mitochondrial loci were used as molecular markers, and a total of eight male-sterile lines, eight maintainer lines, five male-sterile populations and six cultivars by PCR amplification were analyzed.【Result】Theorf138 gene of the eight male-sterile lines, five male-sterile populations and five cultivars by specific amplification were Ogura CMS, but their maintainer lines did not. Sequence analysis oforf138 demonstrated that the Ogura CMS could be divided into two types, type A and type H. Based on the mutations of the coding region sequences oforfB, two types oforfBwere found in total of 27 tested materials, and the sequences from Ogura and normal cytoplasm were absolutely distinguished. 【Conclusion】Thus, the genes oforf138 andorfBbetween the Ogura cytoplasm and the general cytoplasm were significantly different, and the presence oforf138 and the nucleotide sequence differences oforfBwould be used in cytoplasm type identification.

Radish (RaphanussativusL.); Cytoplasmic male sterility; Molecular identification;orf138;orfB

1001-4829(2017)6-1262-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.004

2016-07-10

四川省科學技術廳“四川省科技創新苗子工程”(2016092)

李曉梅(1984-)，女，四川廣安人，農學碩士，研究方向為蘿卜育種及分子生物技術，E-mail: lxmwsl@126.com，*為通訊作者：冉茂林，男，農學碩士，研究方向為蘿卜育種，E-mail: ran633@sohu.com。

S631.1

A