金銀花等6種植物提取物總黃酮含量與抗氧化性相關性研究

付晶晶 肖海芳 宋元達

(山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000)

?

金銀花等6種植物提取物總黃酮含量與抗氧化性相關性研究

付晶晶 肖海芳 宋元達

(山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000)

以金銀花、核桃葉、南非醉茄、何首烏、紅景天、石榴皮6種提取物為試驗對象，通過硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法測定了總黃酮含量；采用ABTS、DPPH與Fenton法測定了其抗氧化能力并進行比較；采用Pearson法進行相關性分析。結果表明：對DPPH自由基的清除能力順序為金銀花>核桃葉>南非醉茄>紅景天>何首烏>石榴皮；對羥基自由基的清除能力順序為金銀花>核桃葉>南非醉茄>何首烏>石榴皮>紅景天；對ABTS+自由基清除能力順序為金銀花>核桃葉>紅景天>南非醉茄>何首烏>石榴皮?？傸S酮含量對DPPH、ABTS+與羥基自由基清除能力的相關系數分別為0.819，0.848，0.791，表明總黃酮含量與清除DPPH、ABTS+自由基能力呈顯著相關性，與清除羥基自由基能力相關性不顯著。

金銀花；何首烏；紅景天；石榴皮；南非醉茄；核桃葉；總黃酮；抗氧化活性

由于自由基與人體內多種疾病相關，近年來，自由基與健康的相關性逐漸成為研究熱點[1]。自由基又稱為“游離基”，是細胞正常的代謝產物[2]，它是一種缺乏電子的物質，具有很強的反應性，它可以從其他化合物中獲得電子來維持穩定[3]。眾多醫學研究表明，過量的自由基可以破壞人體內包括DNA[4]、蛋白質[5]、脂質[6]等各種生物大分子的完整性，從而導致各種各樣疾病的發生發展?？寡趸瘎┛梢郧宄杂苫鶑亩乐棺杂苫鶎θ梭w的各種損害[7]，BHT、BHA等是人們最常用的合成抗氧化劑，然而，這些抗氧化劑在抗氧化的同時也存在潛在的致癌作用[8]。因此，開發安全、無毒無害、健康的天然抗氧化劑具有重要的應用價值[9]。

黃酮類化合物是植物次生代謝的產物，廣泛存在于天然植物中[10-11]。眾多研究表明，黃酮類化合物具有抗炎[12]、抗氧化[13]、抗菌[14]、抗腫瘤[15]等生物活性。大多數黃酮類化合物均有較強的抗氧化作用[16]，而黃酮類化合物的一些藥理活性也往往與其抗氧化作用相關[17]。近年來，因黃酮類其藥理作用在食品、醫藥領域研究較為深入，加快了其化合物的開發利用[18-19]。劉昌平等[20]研究發現，金銀花中黃酮類化合物可以阻斷亞油酸的自氧化作用；陳紅紅等[21]研究表明核桃葉中的總黃酮對D-半乳糖導致的衰老小鼠具有延緩衰老的作用；龔曉武等[22]證明了紅景天黃酮類提取物對超氧陰離子、DPPH自由基、羥基自由基具有較好的清除作用；王濤等[23]證明何首烏黃酮類提取物對羥基自由基具有較好的清除能力；劉夢星等[24]證明石榴皮總黃酮提取物對羥基自由基具有較好的清除能力；朱海升等[25]研究表明南非醉茄根提取物在抗老年癡呆方面具有重要作用。本研究從植物來源及未來開發利用等多方面考慮，對已經報道的植物進行篩選分析之后，以金銀花、何首烏、石榴皮、紅景天、南非醉茄、核桃葉6種植物提取物為研究對象，利用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法[26]測定6種物質提取物總黃酮含量，再采用羥基自由基(·OH)清除率[27]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除率[28]、ABTS+自由基清除率[29]評價6種物質的抗氧化性，以期篩選出抗氧化性最強的植物，并分析其量效關系，旨在為黃酮類功能性食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮核桃葉：采自淄博市博山區；

金銀花、何首烏、紅景天、石榴皮、南非醉茄提取物：陜西信瑞生物科技有限公司；

蘆丁標準品、DPPH、ABTS：純度≥98%，國藥集團化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

旋轉蒸發器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環水式真空泵：SHZ-D型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

超聲清洗器：KQ-700E型，昆山超聲儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科學儀器有限公司；

高速萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

分光光度計：UV-2600 型，日本島津(中國)有限公司；

電子天平：LE303E/02 型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品液的制備 準確稱取0.1 mg金銀花、石榴皮、核桃葉、南非醉茄、何首烏、紅景天提取物于10 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，得到10 mg/mL的樣品液。

1.2.2 總黃酮含量的測定

(1) 標準液的配置：準確稱取10 mg蘆丁標準品，置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得濃度為0.1 mg/mL的標準液。

(2) 標準曲線的建立：準確吸取蘆丁標準液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL置于 10 mL 的試管中，加入30%的乙醇至5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液 0.3 mL，混勻；放置 6 min 后加入10%硝酸鋁溶液 0.3 mL，搖勻；放置6 min后加入10%氫氧化鈉溶液 4 mL，搖勻；最后用60%的乙醇定容至10 mL，搖勻，15 min后于510 nm處測定吸光值，根據所得數據，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線(見圖1)，得線性回歸方程為：y=11.04x-0.007 6，R2=0.995 2。

圖1 蘆丁標準曲線

(3) 樣品液總黃酮含量的測定：分別準確吸取1 mL各樣品液于10 mL容量瓶按1.2.2(2)的方法加入顯色劑，加60%的乙醇至刻度，搖勻，10 min后，于510 nm處測吸光度。以未加樣品液的為空白，每個樣品重復3次?？傸S酮含量按式(1)計算：

(1)

式中：

F——黃酮類物質含量，mg/g；

C——提取液中總黃酮質量濃度，mg/mL；

d——稀釋倍數；

V——提取液定容體積，mL；

M——樣品質量，g。

1.2.3 DPPH自由基的清除作用 精密稱取7.88 g DPPH，用無水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液，4 ℃保存，現配現用。避光取2 mL樣品液于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。取3組標號為1、2、3、4、5的5支5 mL離心管加樣，混勻后室溫避光靜置30 min，在波長為517 nm條件下測定吸光值，按式(2)計算DPPH清除率并計算IC50(當抑制率到達50%時所需抗氧化劑的量)。每個樣品做3次平行。

(2)

式中：

D——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2 mL樣品液與2 mL DPPH混合后的吸光度；

Aj——2 mL樣品液與2 mL 70%乙醇混合后的吸光度；

Ac——2 mL DPPH與2 mL 70%乙醇混合后的吸光度。

1.2.4 羥基自由基的清除作用 分別量取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL樣品液于10 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容至刻度。取3組標號為1、2、3、4、5的5支5 mL離心管加樣，第一組分別加入1 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲與5種不同濃度梯度的樣品1 mL，后加入0.75 mmol/L的硫酸亞鐵1 mL，最后加入60 mmol/L H2O21 mL，混勻后水浴60 min，在波長536 nm條件下測定吸光值得As；第二組、第三組分別用蒸餾水替代60 mmol/L H2O2得Ab、用蒸餾水代替樣品溶液得Ap，按式(3)計算羥基自由基清除率并計算IC50。每個樣品做3次平行。

(3)

式中：

O——羥基自由基清除率，%。

1.2.5 ABTS+自由基的清除作用 分別量取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL樣品液于10 mL容量瓶中，并用70%的乙醇定容至刻度。取2組標號為1、2、3、4、5的5支5 mL離心管加樣，將經暗處理24 h的體積比為1∶1的混合液(7 mmol/L的ABTS和2.5 mmol/L的K2S2O8)稀釋40～50倍，使其在734 nm處吸光度為0.7±0.02，制成ABTS+工作液。第一組中分別取0.8 mL ABTS+與0.2 mL無水乙醇混合均勻，測得吸光值為A；第二組中分別取0.8 mL ABTS+與各濃度梯度的提取液0.2 mL混合均勻，測得吸光值為A0。樣品混勻后室溫避光靜置6 min，再在734 nm條件下測定吸光值。按式(4)計算ABTS+自由基清除率并計算IC50。每個樣品做3次平行。

(4)

式中：

A——ABTS+自由基清除率，%。

1.2.6 數據分析 采用Spss v19.0軟件進行統計分析，Pearson法進行相關性分析，Duncan法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 6種總黃酮類提取物的含量

由圖2可知，6種物質的總黃酮含量順序為：金銀花>核桃葉>南非醉茄>紅景天>何首烏>石榴皮。其中，金銀花、核桃葉、南非醉茄總黃酮含量分別是石榴皮的4.6，2.5，2.4倍。

2.2 6種提取物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除能力 DPPH作為一種穩定的自由基，而被廣泛應用于自由基清除試驗中。由圖3可知，6種不同濃度的黃酮類提取物對DPPH自由基均有清除作用，且隨濃度升高清除作用增強，但6種物質清除DPPH自由基的增幅不明顯。

研究表明黃酮類物質含量與抗氧化性具有相關性[30]，DPPH清除率達到50%時的組分濃度(IC50)與清除能力呈反比，IC50越大，其清除DPPH自由基的能力就越小[31]。圖4結果顯示6種提取物IC50范圍為0.096～0.374 mg/mL，其中金銀花提取物的IC50最小為0.096 mg/mL，石榴皮提取物的IC50最大為0.374 mg/mL。6種提取物清除DPPH自由基的順序為：金銀花>核桃葉>南非醉茄>紅景天>何首烏>石榴皮。

圖2 6種提取物的總黃酮含量

圖3 6種提取物對DPPH自由基的清除能力

圖4 清除DPPH自由基的IC50值

2.2.2 羥基自由基的清除能力 羥基自由基被公認為是最具活性的活性氧，能導致生物體內DNA、蛋白質和脂質氧化損傷。目前關于羥基自由基的產生機理，最被廣泛接受的是過渡金屬離子催化的Fenton反應[32]。H2O2/Fe2+體系可以通過Fenton反應產生羥基自由基，鄰二氮菲-Fe2+水溶液被羥基自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其在536 nm處的最大吸收峰消失，A536值降低。當反應體系中加入羥基自由基清除劑時，此過程受到抑制。試驗結果表明(見圖5)核桃葉、金銀花、南非醉茄、紅景天、何首烏、石榴皮均對羥基自由基具有清除作用，并且在濃度為0.08～0.16 mg/mL時，清除能力變動幅度較大，0.16 mg/mL后變動幅度趨于平穩。整體看6種提取物對羥基自由基清除能力均隨濃度升高而增高，因此6種提取物對羥基自由基清除能力表現出一定的量效關系。

6種植物提取物IC50范圍為0.045～0.316 mg/mL(見圖6)，金銀花提取物IC50為0.045 mg/mL，明顯低于其它5種物質，紅景天提取物IC50最大(為0.316 mg/mL)，6種提取物清除羥基自由基的順序為：金銀花>核桃葉>南非醉茄>何首烏>石榴皮>紅景天。

圖5 6種提取物對羥基自由基的清除作用

圖6 清除羥基自由基的IC50值

2.2.3 ABTS+自由基清除能力 ABTS自由基經活性氧氧化產生穩定的藍綠色自由基ABTS+，在734 nm處有最大吸收峰，在抗氧化物質的作用下反應體系褪色，因而依據吸光值的變化可以衡量待測物對ABTS+自由基清除能力。本試驗利用該法測定6種提取液的抗氧化能力，結果表明(見圖7)，6種提取物對ABTS+自由基均有清除作用。其中金銀花提取物在濃度為0.24 mg/mL時增幅較大，其它5種提取物增幅趨于平穩，隨提取物黃酮濃度的增加6中提取物對ABTS+自由基清除能力均增加。說明6種提取物對ABTS+自由基的清除能力存在一定的量效關系。

提取物IC50的變動范圍為0.067～0.415 mg/mL(見圖8)，其中金銀花提取物IC50最小為0.067 mg/mL，所以其抗氧化性最強，其他5種提取物中石榴皮的IC50最大，其抗氧化性最弱。6種提取物ABTS+自由基清除能力順序為：金銀花>核桃葉>紅景天>南非醉茄>何首烏>石榴皮。

圖7 6種提取物對ABTS+自由基的清除作用

圖8 清除ABTS+自由基的IC50值

2.2.4 6提取物總黃酮含量與抗氧化性相關性分析 對6種總黃酮提取物抗氧化性進行了Pearson法相關性分析(結果見表1)，表明總黃酮含量與清除DPPH自由基、ABTS+自由基能力呈顯著相關性，與清除羥基自由基能力相關性不顯著。由此總黃酮在抗氧化過程中起著較為重要的作用。

表1 6種提取物總黃酮含量與抗氧化性相關性分析?

? *顯著相關(P<0.05)。

3 結論

供試的6種植物提取物的總黃酮含量及對自由基清除能力表現出一定的差異性。并且隨著總黃酮含量的增加抗氧化能力隨之增加?？赡苁屈S酮類物質的多樣性及各個樣品中具有抗氧化的種類及其中具有抗氧化的有效黃酮種類和含量不同。黃酮類物質種類繁多，但并不是所有的黃酮類化合物都具有相同的抗氧化能力，而是與每種化合物的結構有關。

據以往研究[33]表明黃酮類化合物只是衡量物質抗氧化的一個主要指標，所以不同物質表現出不同的清除能力可能與其主導的抗氧化性物質種類有關。至于能不能將黃酮類物質含量作為唯一衡量抗氧化的指標，值得進一步研究。

[1] GOMBERG M. An instance of trivalent carbon: triphenylmethyl[J]. Journal of the American Chemical Society, 1900, 22(11): 757-771.

[2] SALLA S, SUNKARA R, OGUTU S, et al. Antioxidant activi-ty of papaya seed extracts against H2O2, induced oxidative stress in HepG2 cells[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 66(1): 293-297.

[3] PHANIENDRA A, JESTADI D B, PERIYASAMY L. Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases[J]. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 2015, 30(1): 11-26.

[4] MARNETT L J. Oxyradicals and DNA damage[J]. Carcinogenesis, 2000, 21(3): 361-370.

[5] STADTMAN E R, LEVINE R L. Protein oxidation[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2000, 899(1): 191-208.

[6] SEPPO Yl?-herttuala. Oxidized LDL and Atherogenesis[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2006, 874(1): 134-137.

[7] HAKKIM F L, SHANKAR C G, GIRIJA S. Chemical composition and antioxidant property of holy basil (Ocimum sanctum L.) leaves, stems, and inflorescence and their in vitro callus cultures[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2007, 55(22): 9 109-9 117.

[8] 李愛軍, 歐仕益, 羅澤榕, 等. 一種天然抗氧化劑復合物抗氧化作用的研究[J]. 食品與機械, 2001, 17(4): 28-30.

[9] POLITEO O, JUKIC M, MILOS M. Chemical composition and antioxidant capacity of free volatile aglycones from basil (Ocimum basilicum L.) compared with its essential oil[J]. Food Chemistry, 2007, 101(1): 379-385.

[10] YANG C, GUNDALA SR, MUKKAVILLI R, et al. Synergisticinteractions among flavonoids and acetogenins in Graviola(Annona muricata) leaves confer protection against prostatecancer[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(6): 656-665.

[11] BRICKMAN A M, KHAN U A, PROVENZANO F A, et al. Enhancingdentate gyrus function with dietary flavanols improvescognition in older adults[J]. Nat Neurosci, 2014, 17(12): 1 798-1 803.

[12] GONZALEZ R, BALLESTER I, LOPEZ-POSADAS R, et al. Effects of flavonoids and other polyphenols on inflammation[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2011, 51(4): 331-62.

[13] PASTORELLO EA, CONTI A, PRACETTONI V, et al. Identification of actinidin as the major allergen of kiwifruit[J]. J Allergy Clin Immu, 1998, 101(4): 531-537.

[14] MOAWAD A, HETTA M, ZJAWIONY J K, et al. Phytochemical investigation of Cycas circinalis and Cycas revoluta leaflets: moderately active antibacterial biflavonoids.[J]. Planta Medica, 2010, 76(8): 796.

[15] DURY L, NASR R, LORENDEAU D, et al. Flavonoid dimers are highly potent killers of multidrug resistant cancer cells overexpressing MRP1[J]. Biochemical Pharmacology, 2017, 124： 10-18.

[16] RICE-EVANS C A, MILLER N J, PAGANGA G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids[J]. Free Radic. Biol. Med., 1996, 20(1): 933-956.

[17] 熊皓平, 楊偉麗, 張友勝, 等. 天然植物抗氧化劑的研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2001, 13(5): 75-79.

[18] 王春霞, 蒲彪, 蔣燕, 等. 藤椒冷榨油餅粕中黃酮類物質的提取及體外抗氧化活性研究[J]. 食品與機械, 2017, 33(1): 137-142.

[19] 張赟彬, 李彩俠, 吳亞卿. 黃酮類化合物的研究進展[J]. 食品與機械, 2005, 21(5): 70-73.

[20] 劉昌平. 金銀花黃酮的抗氧化活性分析[J]. 安徽農業科學, 2009, 37(20): 9 483-9 484.

[21] 陳紅紅, 李助樂, 章健, 等. 山核桃葉總黃酮抗衰老作用的研究[J]. 天然產物研究與開發, 2008, 1(5): 892-895.

[22] 龔曉武, 李炳奇, 劉丹丹, 等. 紅景天黃酮提取及其抗氧化活性研究[J]. 西北林學院學報, 2011, 26(3): 136-138.

[23] 王濤, 郝云輝, 馬晶軍. 微波輔助提取何首烏中的總黃酮及其抗氧化性研究[J]. 河北醫藥, 2014, 36(23): 3 654-3 656.

[24] 劉夢星, 劉祺鳳, 田璐陽, 等. 石榴皮中總黃酮超聲輔助提取及抗氧化性分析[J]. 湖北農業科學, 2014, 53(4): 894-896.

[25] 朱海升, 劉鄂湖, 鞠娟, 等. 抗老年性癡呆的天然藥物研究進展[J]. 中國藥房, 2007, 18(3): 223-225.

[26] 郭亞健, 范莉. 關于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討[J]. 藥物分析雜志, 2002, 1(2): 97-99.

[27] 洪艷平, 陳木森, 上官新晨, 等. 枸骨葉總黃酮超聲輔助提取與測定[J]. 食品與機械, 2009, 25(1): 72-75.

[28] 施英, 徐玉娟, 陳衛東, 等. 桔核中檸檬苦素類物質最佳提取條件的探討及清除DPPH活性的研究[J]. 食品與機械, 2006, 22(6): 74-76.

[29] 馬博, 張婷婷, 黎遠成, 等. 麻瘋樹籽殼總黃酮的提取及其羥基自由基清除作用[J]. 食品與機械, 2014, 30(5): 196-199.

[30] 歐陽凱, 何先元, 陳飛, 等. 四齒四棱草總皂苷提取工藝優化及抗氧化性研究[J]. 食品與機械, 2016, 32(7): 141-145.

[31] 唐福才, 關天旺, 姚敦琛, 等. 微波提取龍眼核中多酚及其抗氧化活性的研究[J]. 廣東化工, 2015, 42(5): 176-177.

[32] 賈之慎, 鄔建敏, 唐孟成. 比色法測定Fenton反應產生的羥自由基[J]. 生物化學與生物物理進展, 1996, 23(2): 184-186.

[33] 郭小補, 廖森泰, 劉吉平, 等. 不同桑品種的桑葉總黃酮含量與體外抗氧化活性的相關性[J]. 蠶業科學, 2008, 34(3): 381-386.

Acomparative study of contents of total flavonoids and their antioxidant activities in six plants

FU Jing-jing XIAO Hai-fang SONG Yuan-da

(School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology, Zibo, Shandong 255000, China)

In the present study, six total flavonoids extracts were prepared from Honey suckle, Walnut leaves,WithaniaSomnifera,Rhodiolarosea, Pomegranate bark, andPolygonummultiflorum. The total flavonoids content of six plant extracts were measured by aluminium nitrate-sodium nitrite colorimetry. The antioxidant activities of six extracts were compared by the detection methods of DPPH, ABTS and Fenton, and then the correlation of total flavonoids content was analyzed by Pearson. The results showed that the DPPH scavenging order was Honey suckle>Walnut leaves>W.Somnifera>R.rosea>P.multiflorum>Pomegranate bark. The hydroxyl radical scavenging order was Honey suckle>Walnut leaves>W.Somnifera>P.multiflorum>Pomegranate bark>Rhodiola rosea. The results showed that the ABTS+scavenging order was Honey suckle>Walnut leaves>R.rosea>W.Somnifera>P.multiflorum>Pomegranate bark. The free radical scavenging ability and flavonoids content of six kinds of extracts showed quantitative relationship. The correlation that the total flavonoid content and DPPH, ABTS+was significantly positive, while with hydroxyl radical was not the same. The correlation coefficients above were 0.819, 0.848 and 0.791, respectively.

Honey suckle; Walnut leaves;WithaniaSomnifera;Rhodiolarosea; Pomegranate bark;Polygonummultiflorum; total flavonoids; antioxidant activity

山東省自然科學基金青年項目(編號：ZR2014CQ002)

付晶晶，女，山東理工大學在讀碩士研究生。

肖海芳(1980—)，女，山東理工大學講師，博士。 E-mail:xiaohaifang@sdut.edu.cn

2017—02—25

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.032